Een protocol voor immunohistochemie en RNA-in-situ distributie binnen vroege drosophila-embryo's
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.
Abstract
Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen. Elke cellulaire activiteit van celproliferatie en apoptose, ontwikkeling en veroudering, tot neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie zijn in verband gebracht met Ryanodine-receptoren (RyRs). Ondanks het belang van calciumsignalering is het exacte mechanisme van zijn functie in vroege ontwikkeling onduidelijk. Als organisme met een korte draagtijd zijn de embryo’s van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van CICR-geassocieerde eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo’s en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo’s op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktisch protocol dat de hechting van drosophila-embryo op dia’s aanzienlijk verbetert en gedetailleerde methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie. De chroomalum gelatine slide-coating methode en embryo pre-embedding methode verhoogt dramatisch de opbrengst bij het bestuderen van Drosophila embryo-eiwit en RNA-expressie. Om deze aanpak aan te tonen, bestudeerden we DmFKBP12/Calstabin, een bekende regulator van RyR tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van Drosophila melanogaster. We identificeerden DmFKBP12 al in de syncytiele blastodermfase en rapporteerden het dynamische expressiepatroon van DmFKBP12 tijdens de ontwikkeling: aanvankelijk als een gelijkmatig verdeeld eiwit in het syncytiele blastoderm, vervolgens preliminaal lokaliserend naar de kelderlaag van de cortex tijdens cellulair blastoderm, voordat het zich verspreidde in de primitieve neuronale en spijsverteringsarchitectuur tijdens de drie-gem laagfase in vroege gastrulatie. Deze verdeling kan de cruciale rol verklaren die RyR speelt in de vitale orgaansystemen die afkomstig zijn van deze lagen: het subo-oesofageale en supra-oesofageale ganglion, ventraal zenuwstelsel en het bewegingsapparaat.
Introduction
Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen, zoals skelet- / gladde spieren en cardiale vasculaire functie, celproliferatie en apoptose, ontwikkeling, veroudering, neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie1,2,3,4,5,6 . Ryanodinereceptoren (RyRs) en inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R’s) zijn belangrijke spelers in de calciumsignaleringsroute die wordt gecontroleerd door hun regulatoren eiwitkinase A (PKA), Ca2 + / calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II (CaMKII), FK506-bindende eiwitten (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triatidine en junctin1, 2,3,4,5,6 . Abnormale menselijke expressie en mutaties in deze eiwitten kunnen leiden tot pathologische fysiologie zoals aritmieën7 en oncogene proliferatie8,9.
FKBPs reguleren de calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulaire (ER) door RyRs. Dit proces is essentieel voor het mechanisme van contractie en dus verantwoordelijk voor alle mechanische bewegingen die worden gegenereerd door myosine-actinecontractie door calcium-geïnduceerde calciumafgifte samen met embryonale RyRs1,2. In muismodellen is het ontbreken van RyR2 en zijn regulator FKBP12 /Calstabin steevast dodelijk, hetzij tijdens de embryonale ontwikkeling of in de vroege postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knock-out muizen vertonen kritieke hartafwijkingen met onregelmatige excitatie-contractiekoppeling (EC) en hersenoedeem tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit geeft aan dat FKBP12/Calstabin een essentiële rol speelt bij het reguleren van RyR2-kanaalexpressie, wat belangrijk is voor zowel de cardiale als de cerebrale ontwikkeling10.
RyR uitgevoerde calciumvonken werden aanvankelijk ontdekt in de zygote-vormingsfase van bevruchte Medaka-eieren13,14. Er zijn echter weinig onderzoeken uitgevoerd naar de functie van calciumsignalering in de vroege embryonale ontwikkeling. In Drosophila melanogaster leveren de resultaten verkregen van DmFKBP12 S107-mutanten sterk bewijs ter ondersteuning van het belang van dit gen voor de ontwikkeling van larven en een gezonde levensduur, die wordt toegeschreven aan zijn functie tegen oxidatieve stress15,16. Onlangs identificeerden we de dynamische lokalisatie van FKBP12 / Calstabin-eiwit en boodschapper-RNA tijdens de vroege ontwikkeling van Drosophila melanogaster17. Met behulp van de benaderingen die in deze methodologie worden beschreven, konden we de expressie van FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster volgen tijdens het syncytiele blastoderm (0-2 uur), cellulair blastoderm (2-3 uur), vroege gastrula (3-12 uur) en late gastrula (12-24 uur). In dit artikel presenteren we de gedetailleerde protocollen van elke benadering in de vorige studie, inclusief pre-embryo-inbedding voor klassieke paraffinesectie, pre-coating diabehandeling voor embryonale secties, histo-chemie kleuring en immunostaining, en mRNA in-situ hybridisatie voor identificatie van genexpressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRs en IP3Rs gemedieerde calciumsignalering is een fundamentele route in veel fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren1,2,3,4. Bij mensen leiden puntmutaties, zoals CPVT-geassocieerde R4496C-mutatie, in het RyR2-gen tot calciumlekkage uit het sarcoplasmatisch reticulum van cardiomyocyten, wat resulteert in cardiale disfunctie. Deze mutaties presente…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), het Foreign Distinguished Scientist Program van het National Department of Education (#MS2014SXSF038), het National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) en XZ wordt ondersteund door Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), het Natural Science Basic Research Program Youth Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Referenzen
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
