Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis und zur Lokalisierung von Drosophila-Embryoprotein und RNA von der Sammlung bis zur Voreinbettung und Einbettung, Immunfärbung und mRNA-in-situ-Hybridisierung.
Abstract
Die Calcium-induzierte Kalziumfreisetzungssignalisierung (CICR) spielt in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Jede zelluläre Aktivität von Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung und Alterung bis hin zu neuronaler synaptischer Plastizität und Regeneration wurde mit Ryanodinrezeptoren (RyRs) in Verbindung gebracht. Trotz der Bedeutung der Calciumsignalisierung ist der genaue Mechanismus seiner Funktion in der frühen Entwicklung unklar. Als Organismus mit kurzer Schwangerschaft sind die Embryonen von Drosophila melanogaster erstklassige Studienobjekte, um die Verteilung und Lokalisation von CICR-assoziierten Proteinen und ihren Regulatoren während der Entwicklung zu untersuchen. Aufgrund ihrer lipidreichen Embryonen und ihres chitinreichen Chorions ist ihr Nutzen jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Embryonen auf Glasoberflächen zu montieren. In dieser Arbeit stellen wir ein praktisches Protokoll vor, das die Bindung von Drosophila-Embryonen an Objektträger signifikant verbessert und Methoden für eine erfolgreiche Histochemie, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung detailliert beschreibt. Die Chromalaun-Gelatine-Objektträgermethode und die Embryo-Voreinbettungsmethode erhöhen die Ausbeute bei der Untersuchung des Drosophila-Embryoproteins und der RNA-Expression dramatisch. Um diesen Ansatz zu demonstrieren, untersuchten wir DmFKBP12/Calstabin, einen bekannten Regulator von RyR während der frühen embryonalen Entwicklung von Drosophila melanogaster. Wir identifizierten DmFKBP12 bereits im synzytialen Blastodermstadium und berichteten über das dynamische Expressionsmuster von DmFKBP12 während der Entwicklung: zunächst als gleichmäßig verteiltes Protein im synzytialen Blastoderm, dann vorläufig lokalisiert es während des zellulären Blastoderms in der Basalschicht des Kortex, bevor es sich während der Drei-Edelsteinschicht-Phase in der frühen Gastrulation in der primitiven neuronalen und Verdauungsarchitektur verteilt. Diese Verteilung könnte die entscheidende Rolle erklären, die RyR in den lebenswichtigen Organsystemen spielt, die aus diesen Schichten stammen: dem subösophagealen und supraösophagealen Ganglion, dem ventralen Nervensystem und dem Bewegungsapparat.
Introduction
Das Calcium Induced Calcium Release Signaling (CICR) spielt eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie z.B. Skelett-/glatte Muskulatur und kardiale Gefäßfunktion, Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung, Alterung, neuronale synaptische Plastizität und Regeneration1,2,3,4,5,6 . Ryanodinrezeptoren (RyRs) und Inositol-1,4,5-Trisphosphatrezeptoren (IP3Rs) sind Hauptakteure im Calcium-Signalweg, der von ihren Regulatoren Proteinkinase A (PKA), Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende Proteine (FKBPs), Calsequestrin (CSQ), Triadin und Junitin1,2,3,4,5,6 kontrolliert wird. . Abnorme menschliche Expression und Mutationen in diesen Proteinen können zu pathologischer Physiologie wie Arrhythmien7 und onkogener Proliferation führen8,9.
FKBPs regulieren die Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen retikulären (ER) durch RyRs. Dieser Prozess ist essentiell für den Kontraktionsmechanismus und somit verantwortlich für alle mechanischen Bewegungen, die durch die Myosin-Aktin-Kontraktion durch kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung zusammen mit embryonalem RyRs1,2 erzeugt werden. In Mausmodellen ist der Mangel an RyR2 und seinem Regulator FKBP12/Calstabin ausnahmslos tödlich, entweder während der Embryonalentwicklung oder in der frühen postnatalen Periode10,11,12. FKBP12/Calstabin-Knockout-Mäuse weisen während der Embryonalentwicklung kritische Herzdefekte mit unregelmäßiger Erregungs-Kontraktions-Kopplung (EC) und Hirnödemen auf. Dies deutet darauf hin, dass FKBP12/Calstabin eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der RyR2-Kanalexpression spielt, die sowohl für die kardiale als auch für die zerebrale Entwicklung wichtig ist10.
RyR-geleitete Kalziumfunken wurden zunächst in der Zygotenbildungsphase befruchteter Medaka-Eier entdeckt13,14. Es wurden jedoch nur wenige Untersuchungen zur Funktion der Calciumsignalisierung in der frühen Embryonalentwicklung durchgeführt. Bei Drosophila melanogaster liefern die Ergebnisse von DmFKBP12 S107-Mutanten starke Beweise für die Bedeutung dieses Gens für die Larvenentwicklung und eine gesunde Lebensdauer, die auf seine Funktion gegen oxidativen Stress zurückzuführen ist15,16. Vor kurzem haben wir die dynamische Lokalisation von FKBP12/Calstabin-Protein und Boten-RNA während der frühen Entwicklung von Drosophila melanogaster identifiziert17. Mit den in dieser Methodik beschriebenen Ansätzen konnten wir die Expression von FKBP12/Calstabin in D. melanogaster während des synzytialen Blastoderms (0-2 h), des zellulären Blastoderms (2-3 h), des frühen Gastrillas (3-12 h) und des späten Gastrula (12-24 h) verfolgen. In diesem Artikel stellen wir die detaillierten Protokolle aller Ansätze in der vorherigen Studie vor, einschließlich der Einbettung vor dem Embryo für die klassische Paraffinschnitte, der Vorbeschichtung von Objektträgern für embryonale Abschnitte, der histochemischen Färbung und Immunfärbung sowie der mRNA-In-situ-Hybridisierung zur Identifizierung der Genexpression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die durch RyRs und IP3Rs vermittelte Kalziumsignalisierung ist ein grundlegender Weg in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren1,2,3,4. Beim Menschen führen Punktmutationen, wie die CPVT-assoziierte R4496C-Mutation, im RyR2-Gen zu einem Kalziumverlust aus dem sarkoplasmatischen Retikulum des Kardiomyozyten, was zu einer Herzfunktionsstörung …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dem Foreign Distinguished Scientist Program des National Department of Education (#MS2014SXSF038), dem National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) unterstützt, und XZ wird vom Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), unterstützt. das Natural Science Basic Research Program Youth Project der Abteilung für Wissenschaft und Technologie der Provinz Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
Referenzen
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
