כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.
הספיגה של ביומולקולים ממטריזות ביולוגיות סביב אל פני השטח של ננו-חומרים (NMs) כדי ליצור את הקורונה הייתה מעניינת בעשור האחרון. העניין בממשק הביו-ננו נובע מהעובדה שהקורונה הביומולקולרית מעניקה זהות ביולוגית ל-NMs ובכך גורמת לגוף לזהות אותם כ”עצמיים”. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי החלבונים בקורונה מסוגלים לקיים אינטראקציה עם קולטני ממברנה כדי להשפיע על ספיגת התאים וקבעו כי הקורונה אחראית לסחר תאי של NMs והרעילות שלהם בסופו של דבר. עד כה, רוב המחקרים התמקדו בחלבון הקורונה והתעלמו מההשפעות האפשריות של המטבוליטים הכלולים בקורונה או מההשפעות הסינרגיסטיות בין מרכיבים בקורונה הביומולקולרית המלאה. ככזה, עבודה זו מדגימה מתודולוגיות המאפיינות הן את רכיבי החלבון והן את מרכיבי המטבוליט של הקורונה הביומולקולרית באמצעות פרוטאומיקים מלמטה למעלה וגישות מטבולומיות במקביל. זה כולל תקציר על חלקיקים של קורונה חלבון עם פעילי שטח המשמש להגברת התאוששות חלבון, ואפיון פסיבי של קורונה מטבולית על ידי ניתוח מטריצות מטבוליט לפני ואחרי חשיפות NM. עבודה זו מציגה אלקטרופורזה נימית – ספקטרומטריית מסה (CESI-MS) כדכניקה חדשה לאפיון קורונה NM. הפרוטוקולים המתוארים כאן מדגימים כיצד CESI-MS יכול לשמש לאפיון אמין של החלבון והקורונה המטבולית שנרכשו על ידי NMs. המעבר CESI-MS מקטין מאוד את נפח המדגם הנדרש (בהשוואה לכרומטוגרפיה נוזלית מסורתית – ספקטרומטריית מסה (LC-MS) גישות) עם זריקות מרובות אפשריות מ 5 μL קטן של מדגם, מה שהופך אותו אידיאלי עבור דגימות מוגבל נפח. יתר על כן, ההשלכות הסביבתיות של ניתוח מופחתות ביחס LC-MS בשל שיעורי זרימה נמוכים (<20 nL / min) ב CESI-MS, ואת השימוש אלקטרוליטים מימית אשר מבטל את הצורך בממסים אורגניים.
אינטראקציות ביו-ננו, בממשק בין משטחים ננו-חומריים (NM) לבין מטריצות ביולוגיות שמהן ביומולקולס ספיחה ל- NM, הוא תחום מחקר אינטנסיבי העומד בבסיס ננו-בטיחותוננו-רפואה 1. שכבה זו של ביומולקולים מסוחפים מעניקה זהות ביולוגית ל- NMs, ובכך תאים מזהים אותם כ”עצמיים “, ובהמשך משפיעים על ספיגת תאים, הפצה ונקודות קצה ביולוגיות2,3,4. הרוב המכריע של מחקרי ביו-ננו התמקדו בחלבונים בתוך הקורונה, והוכיחו כי חלבונים משתנים כמותית ואיכותית בין NMs של קומפוזיציות שונות5. וריאציה זו תלויה הן במאפיינים של NM כגון גודל, פונקציונליזציה, וחומר בנוסף למאפיינים של המטריצה הביולוגית כולל הרכב ותכולת מלח5. תחום עולה של עניין בממשק ביו-ננו הם המטבוליטים כי ספיח ל- NMs6. מספר מחקרים הראו כי, כמו עם החלבונים, תכונות NM הם גורם מפתח בקביעת הרכב המטבוליטים בקורונה וכי הם יכולים להשפיע על התוצאות הביולוגיות שלחשיפהNM 6,7,8.
במחקרים על הקורונה הביומולקולרית ישנם ארבעה שלבים נפרדים לאפיון שלה, היווצרות קורונה, בידוד הביומולקולות בתוך הקורונה, איתורם באמצעות ספקטרומטריית מסה איכותית או כמותית וזיהוי9. עד כה אומצו מגוון טכניקות לבידוד החלבון קורונה, כולל רתיחה במאגר הריצה SDS-PAGE, עקירות ממס ומלח או עיכול ישיר של חלבונים במקום על פני השטח של NMs. מבחינת המטבוליטים בקורונה, הבידוד מורכב יותר בשיטות שונות באמצעות ממיסים או אפילו פירוק של NMs המוצעים כפתרונות8,10,11. עם זאת, בניגוד לקורונה חלבון גישה “גודל אחד מתאים לכולם” לא סביר להחיל על בידוד של מטבוליטים מ- NMs, בשל המרחב הכימי הרחב הכבוש על ידי חילוף החומרים ואת המגוון של NMs אפשריים. גישה חלופית היא לאפיין את המטריצה הביולוגית לפני ואחרי חשיפה ל- NM עם ההבדל בריכוזים מטבוליטים המיוחסים לספיגת מטבוליטים ל- NMs.12
גישה חלופית זו תחול על כל הביופלואידים וה- NMs ולמרות שהיא דורשת ניתוח כפול, היא מציעה מידה מדויקת הרבה יותר של קורונה מטבולית ואין לה סיכון להתאוששות מטבולית נמוכה מפני השטח של NM בטעות כריכה נמוכה של המטבוליט הספציפי.
השלב השני בניתוח הקורונה הביומולקולרי הוא גילוי הביומולקולות. באופן מסורתי עבור החלבונים בקורונה, זה היה ההעברה של ננו-LC-MS, סוס העבודה של פרוטאומיקה; גישות אחרות כגון NMR13, 1D ו- 2D SDS-PAGE הוחלו גם כן. במונחים של קורונה מטבוליט LC-MS7,GC-MS8 וספקטרומטריית מסת עירוי ישיר נוצלו14. עם זאת, גישה חדשה החלה לאחרונה לצבור תאוצה, כלומר ספקטרומטריה אלקטרופורזה-מסה נימית (CE-MS)11,15 ונוכח במעבדות NM כדכניקה עצמאית לאפיון תכונות פיזיות וכימיות שונות של NMs16. CE-MS היא טכניקת הפרדה אורתוגונלית לננו-אל-אם-אס ו-GC-MS ומסוגלת לאפשר זיהוי של מטבוליטים קוטביים וטעוניםמאוד 17,18. יתר על כן, CE-MS מתאים היטב לניתוח חלבונים ושינויים שלאחר דרכם כגון זרחן וגליקוסילציה19,20,21,22. השלב הסופי, זיהוי וניתוח נתונים יכול להתבצע במספר דרכים תלוי אם גישה כמותית / איכותית או ממוקדת / לא מיועדת משמשת, עם זאת, זה, נופל מחוץ למסר של פרוטוקול זה.
CESI-MS, שילוב של CE וממשק nanoESI, הוא התקדמות אחרונה בטכנולוגיית CE המשתמשת בממשק ללא נדן. זה מאפשר חיבור ישיר של CE זרימה נמוכה במיוחד (<20 nL / min) ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה ללא דילול, וכתוצאה מכך רגישות זיהוי משופרת באופן משמעותי23,24,25. CESI-MS מאפשר ניתוח דגימות מוגבלות בנפח (< 10 μL) תוך שמירה על ניתוח רגיש ביותר26. CESI-MS גם משווה לטובה לגישות ננו-ל-MS מסורתיות של קצב זרימה נמוכה המשמשות בפרוטומיקה ובמטבולומיה במונחים של רבייה27,28, תפוקה, וממשיכים הלאה מה שהופך אותו לסיכוי מרגש לאפיון קורונה ביומולקולרי מלא.
כדי להדגיש את הפוטנציאל של CESI-MS עבור ניתוחים של אינטראקציות ביו-ננו עבודה זו מתארת את הכנת המדגם הנדרש כדי לבודד את קורונה biomolecular NM מדגימת פלזמה אנושית אחת באופן כזה כדי למקסם נתונים הן החלבון והן מטבוליט היבט של קורונה NM ביומולקולרית מלאה. בעוד אנו מדווחים על השימוש בפלזמה אנושית, פרוטוקול זה יהיה מתאים באותה מידה עבור biofluids אחרים כגון סרום דם, מדיום תרבית תאים מלאה, ליסאט התא, נוזל השדרתי או שתן. הניתוחים של שני רכיבים אלה (חלבונים ומטבוליטים) יתוארו לאחר מכן באמצעות נימי CESI מצופים ניטרליים לקורונה החלבון ונימי סיליקה מותכים חשופים הן למטבוליטים קטיוניים והן מטבוליטים אניוניים.
זוהי השיטה הראשונה המוצעת לאפיין את הקורונה הביומולקולרית המלאה המשלבת חלבונים ומטבוליטים, מאותה מדגם, באמצעות CESI-MS. היכולת לאפיין הן את החלבונים והן את המטבוליטים מאותה דגימה תגדיל באופן משמעותי את כמות הנתונים שנאספו מחשיפה ניסיונית אחת, ותאפשר תובנות חדשות על תהליך היווצרות הקורונה והשפעותיו על רעילות ויעילות NMs כננו-רפואה. יתר על כן, CESI-MS היא פלטפורמה אידיאלית לאפיון שני המעמדות של biomolecules עם רק שינוי של נימים נדרש. במבט קדימה, שיטות חדשות שפותחו עבור CE לא מימי יאפשרו ליפידומיקה להתבצע באמצעות CE-MS40 ולכן ניתן כעת לנתח חלבונים, מטבוליטים ושומנים באמצעות פלטפורמה אחת. הגישות הקונבנציונליות הנוכחיות ידרשו שתי פלטפורמות LC-MS ייעודיות, אחת לחלבון קורונה ואחת לקורונה המטבולית. לפיכך, גישה זו יכולה לאסוף כמות כפולה של נתונים באמצעות פלטפורמה אנליטית אחת.
יש כמה אזהרות לגישה זו במיוחד עם הקורונה המטבולית כמו פרוטוקול זה מציע מדידה עקיפה של הקורונה. ככזה, עלולה להתעורר בעיה כאשר רמות חילוף החומרים נמצאות בריכוזים גבוהים ביחס ל- NMs והירידה הבאה בריכוז המטבוליט במטריצה קטנה. עם זאת, בניגוד לקורונה החלבון, לא סביר כי גישה “גודל אחד מתאים לכולם” לבידוד קורונה מטבולית תפותח בשל כל NM שיש כימיה משטח ייחודית. בהמשך סביר יותר כי גישות ספציפיות של NM לבודד את הקורונה המטבולית יפותחו ויאומתו עם זאת; זה יהיה תקף רק על NM ספציפי זה. למרות זאת, CESI-MS עדיין יהיה פלטפורמה מתאימה מאוד לאפיון של מטבוליטים טעונים בקטבים ללא קשר לאופן שבו הם מבודדים. כמו כן ראוי לציין כי אם גלולה לא נוצרת במהלך שלבי הצנטריפוגה שנועדו גלולה NMs, כוח צנטריפוגלי גבוה יותר עשוי להידרש; סביר להניח שזה יקרה עם NMs פחות צפוף. זה גם קריטי כי כל שלבי הסינון הם דבקים בתוך הפרוטוקול בשל משעמם צר של נימים אלה יכולים בקלות להיות חסום אם כל חומר חלקיקי לא בוטל כראוי מן המדגם.
בעוד הקורונה החלבון כבר תחום אינטנסיבי של מחקר במשך מספר שנים היכולת לשלב את זה עם קורונה מטבולית הוא תחום עניין חדש עבור מדענים החוקרים את ממשק ביו-ננו6,14. עד כה, רוב המחקרים האלה התמקדו בשבר הלא קוטבי, השומנים שלקורונהמטבולית 9,28. שיטה זו מאפשרת אפיון של מטבוליטים קוטביים וטעונים מאוד בקורונה הכוללים מטבוליטים חשובים המעורבים בחילוף חומרים אנרגטי, גליקוליזה וסינתזת DNA. כתוצאה מכך, בשילוב עם זרימת העבודה של הפרוטאומיקס, ניתן אפיון הוליסטי יותר של הקורונה הביומולקולרית. זה מאפשר ניתוח מעמיק יותר של אינטראקציות ביו-ננו לנוע קדימה. שיטה זו מאפשרת תובנות מכאניסטיות משופרות על אנדוציטוזיס בתיווך קולטן באמצעות אינטראקציות חלבון ומטבוליט עם קולטני ממברנה. יתר על כן, ניתן לחקור אינטראקציות בין-אינטר ואינטרה קורונה בין חלבונים למולקולות קטנות; לדוגמה, לאחרונה הוכח כי החלבונים בקורונה ממלאים תפקיד מרכזי בגיוס מטבוליטים15. ראוי לציין כי התוצאות הייצוגיות באיור 3 ובאיור 4 הן כימות מוחלט של מטבוליטים, עם זאת, גישה לא טרוגה המשתמשת בניתוח נתונים רב-משתני כדי להשוות את כל תכונות CE-MS בפקדים בהשוואה לפלסמה חשופה תבהיר גם כריכת מטבוליט. לכן, יש היקף משמעותי לחקור כיצד, ואשר, מטבוליטים וחלבונים להשפיע על הגיוס שלהם לתוך קורונה NM. מחקרים נוספים אלה עשויים לסייע בתכנון קורונה כדי לייעל את המסירה של ננו-רפואה או לחשוף משוכות נוספות להתפתחותם כגון דיכוי פעילות התרופות בגלל חסימת קורונה ביומולקולרית או מיסוך פונקציות מיקוד.
CESI-MS עם קצבי זרימה בקנה מידה ננו של סביב 20 nL / min ושימוש מינימלי של ממיסים אורגניים מציע שיפור אישורים ירוקים וכלכליים על פני LC-MS סטנדרטי nanoLC-MS במונחים של שימוש ממס, האתגרים העיקריים עבור מטבולומיקה ומחקרי פרוטאומיקה, בהתאמה. CESI-MS מציע תוצאות ניתנות לשחזור גבוה הן עבור זמן ההעברה והן עבור אזור השיא, אשר משווים לטובה עם שיטות מבוססות LC-MS11,15. יתר על כן, בהשוואה nanoLC-MS, לשאת מעל אינו בעיה CESI-MS. לכן, ניקוי מערכת נרחב בין ניתוחי מדגם אינו נדרש, אשר משפר מאוד את תפוקת המדגם11.
לסיכום, זרימת העבודה המוצעת היא הראשונה לפרט גישה לאפיון מרכיבי החלבון והמטבוליט של הקורונה הביומולקולרית המלאה של NMs. זה פותח היבט חדש של אינטראקציות ביו-ננו, קורונה מטבולית, ובכך מאפשר איסוף של פי שניים נתונים מאותה מדגם, ומאפשר הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בממשק הביו-ננו.
The authors have nothing to disclose.
איי.ג’יי.C, J.A.T ו-I.L. מכירים במימון מהנציבות האירופית באמצעות פרויקט Horizon 2020 ACEnano (גרנט לא. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z מכיר במימון הדוקטורט ממועצת המלגות של סין (CSC, מס ‘ 201507060011). R.R מכיר בתמיכה הכספית של תוכנית המענקים Vidi של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO Vidi 723.0160330).
1,4-Dithiothreitol | Sigma | 10197777001 | |
2,2,4,4-D4-citric | Simga | 485438-1G | Internal standard anion |
Ammonium Acetate >98% | Sigma | A1542 | |
Ammonium Bicarbonate >99.5% | Sigma | 09830 | |
Capillary cartridge coolant | Sciex | 359976 | |
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | |
CESI Cap | Sciex | B24699 | |
CESI Vials | Sciex | B11648 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic, use in a fume hood |
Glacial Acetic acid | Sigma | A6283 | |
Hydrochloric acid 1mol/L | Sigma | 43617 | |
Iosoacetamide | Sigma | I1149 | |
L-methionine sulfone | Sigma | M0876-1G | Internal standard cation |
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) | Sigma | 14262 | Use in a fume hood |
Microvials | Sciex | 144709 | |
nanoVials | Sciex | 5043467 | |
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length | Sciex | B07368 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers |
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
Phospahte buffered saline 10x | Sigma | P7059 | |
Pierce C18 Tips, 100 µL bed | Thermo Fisher Scientific | 87784 | |
Polystyrene 100 nm | Polysciences Inc | 876 | |
Polystyrene carboxylated 100 nm | Polysciences Inc | 16688 | |
Polystyrene carboxylated 1000 nm | Polysciences Inc | 08226 | |
Rapigest SF (surfactant) | Waters | 186001860 | |
Sequencing Grade modified Trypsin | Promega | V5111 | |
SiO2 Ludox TM-40 | Sigma | 420786 | |
Sodium Hydroxide solution | Simga | 72079 | |
TiO2 Dispex coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 PVP coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 uncoated | Promethion particles | Bespoke particles |