Protokollen som er beskrevet her tar sikte på å måle den hydrodynamiske diameteren av sfæriske nanopartikler, mer spesifikt gullnanopartikler, i vandige medier ved hjelp av Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Sistnevnte innebærer å spore bevegelsen av partikler på grunn av Brownian bevegelse og implementere Stokes-Einstein ligningen for å oppnå den hydrodynamiske diameteren.
Innen nanoteknologi spiller analytisk karakterisering en viktig rolle i å forstå atferden og toksisiteten til nanomaterialer (NMs). Karakterisering må være grundig og teknikken som velges, skal være godt egnet til egenskapen som skal bestemmes, materialet som analyseres og mediet der det er tilstede. Videre må instrumentdriften og metodikken være godt utviklet og tydelig forstått av brukeren for å unngå datainnsamlingsfeil. Eventuelle avvik i den anvendte metoden eller prosedyren kan føre til forskjeller og dårlig reproduserbarhet av innsytne data. Dette papiret tar sikte på å klargjøre metoden for å måle den hydrodynamiske diameteren av gullnanopartikler ved hjelp av Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Denne studien ble utført som en inter-laboratoriesammenligning (ILC) blant syv forskjellige laboratorier for å validere standard driftsprosedyrens ytelse og reproduserbarhet. Resultatene fra denne ILC-studien avslører viktigheten og fordelene ved detaljerte standard driftsprosedyrer (SOPer), beste praksisoppdateringer, brukerkunnskap og måleautomatisering.
Nanomaterialer (NMs) kan variere i både fysiske og kjemiske egenskaper som igjen påvirker deres atferd, stabilitet ogtoksisitet 1,2,3,4,5. En av de store vanskelighetene, når man utvikler en grundig forståelse av NM-egenskaper, farer og atferd, er evnen til å skaffe reproduserbar informasjon om fysiske og kjemiske nanomaterialer. Eksempler på slike fysiske egenskaper inkluderer partikkelstørrelse ogstørrelsesfordeling 6,7,8. Dette er viktige parametere, da de er et sentralt aspekt ved Europakommisjonens (EC) definisjon av begrepet “nano”9.
Å oppnå nøyaktige målinger av partikkelstørrelse er også avgjørende for mange ulike industrielle og forskningsapplikasjoner og prosesser i tillegg til å forstå skjebnen og toksisitetseffektene til NMs6,10. Det er viktig å ha veletablerte metoder som er i stand til å måle nøyaktig, pålitelig og reprodusere størrelsen på NMs. Videre bør rapportert informasjon gi dyp forståelse av teknikken som brukes, for eksempel angi type størrelsesparameter (f.eks. faktisk størrelse eller hydrodynamisk størrelse) samt prøvebetingelsen, for eksempel det spesifikke mediet der NM er til stede, og for metoden for å utføre pålitelig i forskjellige medier. For å måle størrelsen kan en rekke teknikker brukes, inkludert elektronmikroskopi (EM), dynamisk lysspødning (DLS), enkeltpartikkel induktivt sammenlignet plasmamassespektrometri (spICP-MS), differensial sentrifugalsedimentering (DCS), skanning av sondemikroskopi (SPM), småvinklet røntgenspøningsanalyse (SAXS) og nanopartikkelsporingsanalyse (NTA).
NTA er en relativt ny teknologi som har vært godt avansert de siste årene og har vist seg å måle den hydrodynamiske diameteren til sfæriske NMs i komplekse vandige medier som de med miljørelevans, for eksempel ferskvannssystemer. Den hydrodynamiske diameteren er “størrelsen på en hypotetisk hard sfære som sprer seg på samme måte som partikkelens måles”11; i praksis og i vandige medier beskriver dette en diameter større enn selve partikkelen, som også inkluderer et lag av molekyler (for det meste vann) som holdes på overflaten av partikkelen av svake elektrostatiske krefter. Den hydrodynamiske diameteren til en partikkel vil variere i forskjellige medier, og blir mindre etter hvert som den ioniske styrken i mediene der den måles blir høyere.
Et annet viktig trekk ved NTA-teknikken er at det gjør det mulig for analytikeren å oppnå tallvektede størrelsesmålinger, som kreves i sammenheng med EC nanomaterialedefinisjonen. Høy oppløsning, partikkel-for-partikkelanalyse gjør denne teknikken mindre utsatt for forstyrrelser forårsaket av agglomerater eller større partikler når den finnes i en heterogen testprøve med høy partikkelgjennomstrømning10,12.
Måleprosedyren består av å forberede en passende suspensjon av prøven, som ofte krever prøvefortynning, etterfulgt av videoopptak av partiklenes Brownian bevegelsesatferd og videoanalyse. Fra prøvekammeret blir en laserstråle passert, og suspensjonspartiklene i banen til laserstrålen sprer lys som fører til visualiseringen ved hjelp av et optisk mikroskop med et montert kamera. Kameraet fanger en videofil av det spredte laserlyset fra partiklene som beveger seg under Brownian-bevegelse. Mange partikler kan spores individuelt for å bestemme deres diffusjonskoeffisienter og deres hydrodynamiske diametre kan beregnes ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen: d = kT/3πηD der d er den hydrodynamiske diameteren, k er Boltzmann konstant, T er temperaturen, η er viskositeten og D er diffusjonskoeffisienten10. NTA kan også brukes til å spore aggregeringsatferden til partikler som generelt er kolloidalt ustabile (partiklene må imidlertid være kolloidalt stabile over måletidsskalaen)13,14. NTA er en absolutt metode, og det kreves ingen systemkalibrering på instrumentet som brukes i dette arbeidet. Hvis brukerne ønsker å sjekke systemytelsen, kan dette enkelt gjøres ved å måle størrelse standardmaterialer så ofte som ønsket.
NTA-instrumentet er enkelt å betjene med rask analysetid (under 10 min per prøve). For målinger av høy kvalitet med god datare repeatabilitet og reproduserbarhet, bør en rekke faktorer vurderes både i prøveforberedelse og i instrumentdrift. Hvis slike faktorer ikke vurderes nøye, kan målinger på samme materiale på tvers av ulike laboratorier og operatører være gjenstand for ukjente eller dårlig kvantifisert usikkerhet. Under NP karakterisering, ved hjelp av beste praksis in-house utviklet SOPs garanterer ikke alltid konsistens med andre laboratorier, som vist av Roebben et al. for DLS teknikk15.
Faktisk viste en tidlig (første runde) NTA ILC mellom ulike laboratorier, brukere og instrumenter inkonsekvente resultater. Et av hovedproblemene var bruk av ulike eldre eldre instrumenter som ikke hadde hatt regelmessige tjenester eller kalibreringskontroller, samt forskjeller i metodetolkning. En NTA ILC studie av Hole et al. fant at med fravær av felles retningslinjer for hvordan du bruker et system og forberede prøver, kan variabilitet på tvers av laboratorier være stor selv for relativt monodispede prøver16. Dette sammen med resultatene fra første runde av ILC understreker behovet for godt instrumentvedlikehold samt metodeopplæring og velutviklede standard driftsprosedyrer (SOPer). Sistnevnte fungerer som et kraftig verktøy for å beskrive og dokumentere overholdelse av god praksis. Hvis godt detaljerte, standard driftsprosedyrer (SOPer) kan tilby klarhet, forklaring, forståelse, standardisering og kvalitetssikring.
Anbefalingen for å vedta en ILC-studie er derfor ideell for både utvikling og testing av protokoller16. ILC-øvelsen handlet for å validere denne spesifikke NTA SOP og introduserte dermed tillit og klarhet i denne spesifikke nanomaterialrisikovurderingsmetoden. Det involverte tre runder. Runde 1 analyserte 60 nm gull nanopartikler på hver deltakers egne instrumenter før trening. Runde 2 involverte å analysere 100 nm latex ved hjelp av et nytt instrument med felles konfigurasjon som en enkel test for å fastslå at instrumentet ble satt opp riktig og brukerne hadde god kunnskap om hvordan de skulle bruke instrumentet. Runde 3 involverte analysen av 60 nm gull nanopartikler på det nye instrumentet med felles konfigurasjon, etter trening. Deltakerne i ILC kom fra syv forskjellige laboratorier, alle konsortiummedlemmer av Horizon 2020 ACEnano-prosjektet17.
Målet med denne artikkelen er å diskutere metoden og resultatene fra en tredje runde med benchmarking for NTA-teknologien der 60 nm gull-NPer ble analysert på nytt av syv partnere etter detaljert opplæring og SOP-utvikling. Sammenligning og referanse til resultatene oppnådd i første runde av ILC vil også bli gjort. Alle analyser fra runde 3 av ILC ble utført ved hjelp av samme instrument (se Materials tabell) av identisk konfigurasjon levert med en 405 nm laser og et høysensitivt sCMOS-kamera. Benchmarking vurderer teknologiens ytelse på prøver og fører dermed til utvikling av “beste praksis” protokoller. Dermed deler denne artikkelen også og gjør NTA-metoden for instrumentet som brukes i dette ILC tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, da det har blitt harmonisert via å gjennomføre og evaluere ILCs i henhold til internasjonale standarder.
De inkonsekvente resultatene fra Runde 1 ILC understreket behovet for instrumenthelsekontroller for eldre systemer, samt utviklingen av en mer detaljert SOP, behovet for praktisk opplæring og en bedre forståelse av måle- og analyseinnstillinger for å sikre mer konsistente resultater på tvers av de ulike laboratoriene. Faktisk fant Hole et al. at fraværet av delte retningslinjer for hvordan du bruker et NTA-system og forberede prøver resulterte i variasjon på tvers av laboratorier selv for relativt monodispede prøver16. Derfor deltok alle ILC-deltakere på et opplæringsverksted som dekker de beste praksisene for systemdrift og måleforhold, samt rengjørings- og vedlikeholdsveiledning for det spesifikke NTA-instrumentet. Alle deltakerne utførte også målinger på samme instrument i sine egne laboratorier for de påfølgende ILC-rundene. Prosedyren involverte først en runde som testet systemet lokalt i hvert laboratorium ved å kjøre et ILC på lateksstandardprøver (ILC Runde 2), før de ble brukt av partnerne til å gjenta gullmålingene (ILC Runde 3). Målet med å måle disse gullprøvene ved hjelp av NTA var å introdusere tillit og klarhet i nanomateriale risikovurderingsmetoder og praksis som trengs for å påvirke nanosikkerhetsveiledningsprotokoller.
NTA er en teknikk som kan måle den hydrodynamiske sfæriske ekvivalentdiameteren av partikler og kan brukes til partikkel ved partikkel, sanntids visuell analyse av polydispede systemer fra 10 nm – 50 nm, til ca. 1000 nm i størrelse (avhengig av prøveegenskapene og instrumentkonfigurasjonen). Minimal prøveforberedelse er nødvendig. Til tross for minimal prøveforberedelse er dette trinnet avgjørende for protokollen, og det bør tas stor forsiktighet når du fortynner en prøve og velger et fortynningsmiddel. Form kan være en begrensende faktor med hensyn til NTA som sfæriske tilsvarende størrelsesmålinger oppnås og ikke-sfæriske partikler vil ha en mindre nøyaktig størrelsesverdi.
For NTA-teknologi er det alltid noe resultatvariasjon som alltid forventes, da bare et representativt utvalg observeres fra hele prøven. Uansett oppfyller alle resultatene ISO 19430-standarden for partikkelstørrelse. Den optimale konsentrasjonen å gi er vanligvis rundt 108 partikler/ ml innen en 30-60 sekunders analysetid. For prøver med lavere partikkelkonsentrasjoner vil det være nødvendig med lengre analysetider for å sikre reproduserbare resultater. For prøver som inneholder en konsentrasjon av partikler som er større enn 109 partikler/ml, er det større sannsynlighet for å spore problemer, og prøver må fortynnes ned til et egnet område for NTA-måling.
Samlet sett viser resultatene fra 3rd Round ILC god reproduserbarhet av gull nanopartikkelmålinger med NTA med økt nøyaktighet og repeterbarhet. Alle NTA-målinger ble utført ved hjelp av automatisk kameranivå og fokusinnstillinger for å justere bildet, som valgt av funksjonen Automatisk oppsett i programvaren. Kameranivået satt av programvaren var svært konsistent, med et kameranivå på 10 eller 11 som angis i alle tilfeller som viser at som forventet, jo mer automatisering en prosess inkluderer mer konsistens oppnås. Størrelsesresultatene var sammenlignbare med de som ble oppnådd av produsenten ved hjelp av TEM som indikerer at resultatene var reproduserbare, men minimale forskjeller forventes fra forskjellige teknikker siden TEM ikke bestemmer den hydrodynamiske diameteren. Den betydelige forbedringen i konsistensen av resultatene viser viktigheten og fordelene ved instrumentvedlikehold, detaljerte, beste praksisoppdateringer, brukerkunnskap og anvendt måleautomatisering for NTA. Til slutt validerte ILC denne spesifikke NTA SOP og introduserte dermed tillit og klarhet i denne spesifikke nanomaterialrisikovurderingsmetoden.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra H2020-finansiert prosjekt: ACEnano (Grant Agreement no 720952). Dette arbeidet ble også delvis støttet av International Cooperative R&D Program finansiert av Ministry of Trade, Industry, and Energy of Korea (tilskuddsnummer N053100009, “Horizon2020 Kor-EU samarbeids-R&BD på ACEnano Toolbox”) som gjorde det mulig å delta av de koreanske partnerne i konsortiet til Horizon 2020 ACEnano Project.
60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |