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Biologie

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

Published: September 01, 2020
doi:
10.3791/61733
, , ,
1Department of Biophysics,University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer’s and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la transferencia criogénica de muestras congeladas a la sonda de resonancia magnética nuclear (RMN) de ángulo mágico de polarización nuclear (DNP) de giro mágico (MAS). El protocolo incluye instrucciones para el almacenamiento del rotor antes del experimento e instrucciones para las mediciones de viabilidad antes y después del experimento.

Abstract

La polarización nuclear dinámica (DNP) puede aumentar drásticamente la sensibilidad de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de giro de ángulo mágico (MAS). Estas ganancias de sensibilidad aumentan a medida que disminuyen las temperaturas y son lo suficientemente grandes como para permitir el estudio de moléculas a concentraciones muy bajas a las temperaturas de funcionamiento (~ 100 K) de la mayoría de los espectrómetros de RMN equipados con DNP comerciales. Esto lleva a la posibilidad de biología estructural en células criopreservadas para macromoléculas en sus niveles endógenos en sus entornos nativos. Sin embargo, las tasas de congelación requeridas para la criopreservación celular se exceden durante el manejo típico de muestras para DNP MAS NMR y esto resulta en la pérdida de integridad celular y viabilidad. Este artículo describe un protocolo detallado para la preparación y transferencia criogénica de una muestra congelada de células de mamíferos en un espectrómetro de RMN MAS.

Introduction

La introducción de la polarización nuclear dinámica para la espectroscopia de resonancia magnética nuclear giratoria de ángulo mágico puede aumentar la sensibilidad de la RMN MAS en varios órdenes de magnitud. Esto ha permitido la detección de biomoléculas en o cerca de sus concentraciones fisiológicas. DNP puede y proporciona la sensibilidad requerida para detectar una proteína isotópicamente etiquetada a concentraciones endógenas (~1 μM) en un entorno biológico complejo1. Debido a que existen protocolos bien establecidos para introducir moléculas etiquetadas isotópicamente en células de mamíferos no etiquetadas sin afectar su viabilidad, esto abre la posibilidad de estudiar biomoléculas enriquecidas isotópicamente a sus niveles endógenos en su entorno nativo. Además, debido a que las mejoras de DNP son más eficientes a temperaturas más bajas2,3,4, las temperaturas experimentales para DNP MAS NMR se alinean perfectamente con las requeridas para el almacenamiento a largo plazo de células de mamíferos viables5. Sin embargo, el método convencional de transferencia de una muestra a un espectrómetro de RMN DNP MAS la somete a tasas de fluctuación de temperatura que rompen las células de mamíferos.

Los experimentos de RMN MAS requieren que la muestra gire alrededor del ángulo mágico a frecuencias iguales o mayores que la magnitud de la interacción anisotrópica para que se promedie a cero, típicamente al menos 4 kHz y a menudo mucho más alto6,7,8,9. Por lo tanto, las muestras se empaquetan en rotores que tienen una punta con aletas que se utiliza para impulsar la rotación del rotor por una corriente de gas y tienen una marca en el otro extremo para que la frecuencia de rotación pueda ser monitoreada por un tacómetro. La transferencia de muestras para la mayoría de los instrumentos de RMN MAS se realiza inyectando el rotor desde el exterior del instrumento en el estator al final de la sonda de RMN con una corriente de aire seco o gas nitrógeno. Después de que el rotor llega al estator, que mantiene el rotor en el ángulo mágico, la rotación de la muestra es impulsada por un mecanismo de turbina de aire. Corrientes separadas de soporte de gas, propulsar y controlar la temperatura del rotor. Insertar un rotor en el espectrómetro de RMN y lograr un giro MAS estable requiere puntas de accionamiento finamente mecanizadas y un control estricto de la temperatura y la presión de las corrientes de gas separadas. A pesar de estas demandas técnicas, la inserción y el logro de MAS estables están en gran medida automatizados para sondas comerciales de RMN MAS para aplicaciones a temperatura ambiente.

Sin embargo, la situación es más complicada para aplicaciones de baja temperatura. Las muestras para aplicaciones de baja temperatura generalmente se insertan en el espectrómetro a temperatura ambiente y se congelan en el estator. En el primer minuto, la temperatura de la muestra disminuye rápidamente (> −100 °C/min) y la temperatura del sistema requiere varios minutos para equilibrarse. Debido a la interacción de la temperatura y la presión, la inserción y el acercamiento del MAS deseado a menudo se manejan manualmente para aplicaciones de baja temperatura. A pesar del requisito de intervención manual, congelar el rotor dentro del instrumento es beneficioso porque minimiza la introducción de agua y condensación en la sonda, lo cual es fundamental para un giro exitoso. La condensación y la acumulación de hielo de la humedad ambiental no solo pueden bloquear las líneas de gas, la condensación o la escarcha en el propio rotor pueden prevenir mecánicamente el MAS. Por lo tanto, las muestras para RMN MAS a baja temperatura generalmente se congelan dentro del instrumento a velocidades que exceden los -100 ° C / min.

Las células de mamíferos pueden conservar su integridad a través de un ciclo de congelación-descongelación si el enfriamiento es lento5,10, 11,12, a una velocidad igual o más lenta que 1 ° C / min. Alternativamente,las células también conservan su integridad si la velocidad de enfriamiento es ultrarrápida de13, 14,15, a una velocidad más rápida que 104 ° C / min. Las tasas intermedias a estos dos extremos rompen y matan las células de mamíferos debido a la formación de cristales de hielo tanto dentro como fuera de las células, incluso en presencia de agentes crioprotectores16. Las velocidades de enfriamiento de la muestra para un rotor a temperatura ambiente dentro de una sonda preenfriada caen entre estos dos extremos, por lo tanto, para estudiar las células de mamíferos viables intactas criogénicamente preservadas, las muestras deben congelarse antes de transferirse al instrumento y transferirse al instrumento sin fluctuaciones de temperatura que puedan dañar la muestra o la acumulación de escarcha en el rotor que podría evitar que el rotor gire. El protocolo describe un método para la inserción de rotor preenfriado y libre de heladas en un sistema criogénico de RMN MAS para el estudio de muestras de células de mamíferos viables intactas preservadas criogénicamente. La transferencia criogénica de muestras descrita aquí fue desarrollada para la caracterización por RMN de células intactas viables. Sin embargo, es aplicable a cualquier sistema donde las fluctuaciones de temperatura puedan comprometer la integridad de la muestra. Esto incluye cualquier variedad de sistemas complejos, como las reacciones apagadas por congelación para la caracterización química y estructural de los intermedios de reacción atrapados17,18,enzimología19,20 o plegamiento deproteínas 21,22.

Protocol

1. Cultivo y crioprotección de células de mamíferos Cultivo y recolección de células de mamíferos Descongelar una alícuota de células renales embrionarias humanas congeladas (HEK 293). Cultivo de células HEK 293 en medios de crecimiento (p. ej., DMEM con 10% de suero fetal bovino y 1% de Pen-Strep) a 37 °C con 5% de CO2 en placas de 100 mm durante dos o tres pasajes (7-10 días). Dividir las células y cultivarlas en una placa de 150 mm hasta que las células alcancen una confluencia del 90-95%.NOTA: Una placa de 150 mm a > 90% de confluencia será suficiente para llenar dos rotores de zafiro con un diámetro de 3,2 mm. Cosechar células utilizando 4 ml de tripsina (ver Tabla de materiales)y 10 ml de medios. Transfiera la suspensión a una centrífuga cónica estéril de 15 ml a 673 x g (1000 rpm) durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante. Lavar el pellet celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2). Crioprotección de células Recoger un pellet celular de 50 μL en un tubo de microcentrífuga. Prepare una mezcla de 50 μL de PBS y 18 μL de glicerol en un tubo separado. Mezcle suavemente el pellet de células de 50 μL con 68 μL de mezcla de glicerol-PBS agregando la mezcla de glicerol-PBS a la parte superior del pellet y resuspensando el pellet golpeando suavemente el costado del tubo hasta que no queden grumos.NOTA: El pipeteo suave también se puede usar para resuspend la celda, sin embargo, asegúrese de que la integridad celular no se vea comprometida. 2. Criopreservación de células de mamíferos en un rotor de RMN Transferencia de células a un rotor de zafiro de 3,2 mm. Para hacer un embudo, corte una punta de pipeta de 200 μL e inserte el extremo estrecho de la punta de la pipeta cortada en el rotor de 3,2 mm. Transfiera las células al embudo que se encuentra en el rotor. Coloque el rotor junto con el embudo en un tubo de microcentrífuga y peletice las células en la parte inferior del rotor por centrifugación a 673 x g durante 2-3 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y cualquier exceso de muestra del rotor. Repita estos dos pasos hasta que el rotor esté completamente lleno de células.NOTA: Opcionalmente, determine la viabilidad celular de la muestra antes de congelarla. Resuspend 10 μL del exceso de gránulo celular en 100 μL de DMEM libre de FBS. Mezcle 10 μL de la suspensión con una solución de azul de tripano al 0,4% y evalúe inmediatamente la viabilidad utilizando un contador de células automatizado. Use solo medios libres de FBS para diluir las células, ya que el suero interfiere con la tinción de azul tripano. Selle el rotor con un tapón de silicio utilizando una herramienta de embalaje disponible en el comercio. Cierre el rotor con una punta de accionamiento de cerámica presionándolo verticalmente hacia abajo. Evite tocar las delicadas aletas en el costado de la punta de la unidad. Marque la mitad del borde inferior del rotor de zafiro con un marcador permanente plateado y la otra mitad del borde inferior del rotor con un marcador permanente negro para permitir un monitoreo preciso del giro del rotor dentro del espectrómetro.NOTA: Las imperfecciones en el marcado del rotor impedirán el conteo preciso de la frecuencia de giro, lo que resultará en la falla para lograr un giro estable. Debido a que los marcadores no se escribirán en un rotor congelado y el calentamiento del rotor compromete la integridad de la muestra, marcar el rotor antes de congelarlo es un paso crítico. Criopreservación de células dentro de un rotor de zafiro de 3,2 mm. Coloque un cojín hecho por un trozo de pañuelo de papel o toalla de papel debajo de la tapa y en la parte inferior del vial criogénico (ver Tabla de materiales).NOTA: El papel de seda protege la marca del rotor de los daños sufridos por golpes contra los lados de los viales criogénicos. Coloque el rotor de zafiro de 3,2 mm en el vial criogénico acolchado con el papel de seda con el extremo marcado hacia la parte inferior del vial criogénico. Congele lentamente el rotor colocando el vial criogénico en el recipiente de enfriamiento de velocidad controlada (-1 °C/min) y coloque el recipiente en un congelador de -80 °C durante un mínimo de 3 h. Transfiera el vial criogénico que contiene el rotor congelado al almacenamiento de nitrógeno líquido. 3. Transferencia criogénica de una muestra congelada al espectrómetro de RMN Transportar la muestra congelada a la instalación de RMN. Transfiera el vial criogénico que contiene el rotor congelado a un pequeño dewar lleno de nitrógeno líquido para su transporte a la instalación de RMN. Transferencia del rotor congelado al baño de nitrógeno líquido. Llene un dewar de espuma de boca ancha seco y aislado térmicamente con 500 ml – 1 L de nitrógeno líquido. Transfiera el rotor del vial criogénico al dewar de espuma de boca ancha lleno de nitrógeno líquido. Tome el vial criogénico del dewar de transferencia en la mano y sosténgalo justo encima de la superficie del nitrógeno líquido para protegerlo de la atmósfera. Mientras sostiene el vial criogénico con la boca apuntando ligeramente hacia abajo, desenrosque la tapa y deje que el rotor se deslice hacia el baño de nitrógeno líquido.NOTA: Una vez que la tapa se desenrosca, el rotor debe caer del vial criogénico al baño de nitrógeno líquido rápidamente (menos de 1 segundo) para evitar que la condensación se acumule en el rotor. La evaporación del nitrógeno líquido forma una “nube de nitrógeno” en el dewar de espuma de boca ancha y evita la condensación en el rotor antes de que se sumerja en el nitrógeno líquido. Una exposición más prolongada del rotor al aire puede provocar la condensación de humedad en las paredes del rotor que se recondensará en hielo. Transferencia criogénica del rotor al captador de muestras de RMN. Prechill un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sumergiéndolo en el baño de nitrógeno líquido. No cierre el tubo.NOTA: Inspeccione el rotor antes de transferirlo al tubo de la microcentrífuga. Con pinzas, sostenga el rotor justo debajo de la superficie del nitrógeno líquido y verifique que las marcas del rotor estén intactas, que no se hayan formado depósitos de hielo en sus paredes y que la punta de accionamiento esté intacta. Los depósitos de cristal de hielo en las paredes del rotor aparecen como polvo blanco. Tenga cuidado de sostener siempre el rotor por su cuerpo y no por la punta de accionamiento. No raye la marca del rotor con las puntas de las pinzas. Debajo de la superficie del baño de nitrógeno líquido, use pinzas para transferir el rotor al tubo de la microcentrífuga con la punta de accionamiento orientada hacia la parte inferior del tubo de la microcentrífuga y las marcas frente a la abertura del tubo.NOTA: Siempre seque las pinzas antes de sumergirlas en nitrógeno líquido o tocar el rotor. Usando pinzas, sostenga el tubo que contiene el rotor bajo nitrógeno líquido por su cuello. Con un segundo par de pinzas en la mano, prepárese para sumergir el captador de muestras de RMN en el baño de nitrógeno líquido y sostenlo de modo que esté inclinado en un ángulo agudo con respecto al tubo de la microcentrífuga.NOTA: Minimice el tiempo que el captador de muestras está en contacto con el nitrógeno líquido para evitar la congelación de la o-ring. Si la otorrilla se congela, será muy difícil insertar el receptor en el espectrómetro. Transferencia criogénica del rotor del captador de muestras de RMN al espectrómetro de RMNNOTA: Este paso requiere dos personas, una para operar el criocabinet y otra para transferir la muestra del nitrógeno líquido a la sonda. Coloque el criocabinet en modo de eyección presionando ‘EJECT’ en el gabinete.NOTA: El modo de eyección purga el flujo de gas nitrógeno seco y frío a alta presión desde la sonda a la atmósfera para evitar la entrada de humedad atmosférica. Transfiera el rotor al captador de muestras de RMN. Inserte el extremo abierto del captador de muestras de RMN en el tubo de la microcentrífuga mientras aún está debajo de la superficie del nitrógeno líquido. Levante tanto el tubo de la microcentrífuga como el captador de muestras de RMN para permitir que el rotor caiga en el captador de muestras. Agite el captador de muestras de RMN y el tubo de la microcentrífuga en caso de que el rotor esté atascado en el borde del captador de muestras. Deje el tubo de microcentrífuga vacío en la parte superior del captador de muestras de RMN para proteger el rotor del aire. Retire el otro captador de muestras de RMN vacío de la sonda y póngalo en el suelo. Transfiera el captador de muestras de RMN que contiene el rotor a su mano libre, retire el tubo de la microcentrífuga e insértelo inmediatamente en la sonda.NOTA: Si la oroca se congela, será difícil apretar el captador de muestras. Siga aplicando fuerza hasta que se deslice en su lugar. Indique a la persona que opera el criocabinet que ‘STOP EJECT’ e ‘INSERT’.NOTA: El modo de inserción guía el rotor desde el captador de muestras hasta la sonda. Haga girar la muestra a la velocidad de centrifugado deseada (por ejemplo, 12 kHz) ajustando el rodamiento y la presión de flujo de conducción controlada por el criocabinet. (por ejemplo, aumente inmediatamente el gas del rodamiento a ~ 200 mBar y el gas de accionamiento a 10 mBar. Una vez que la muestra gire, aumente el gas del rodamiento a 1000 mBar y impulse el gas a 200 mBar. A medida que el giro se estabiliza, aumente el rodamiento a 2400 mBar y luego aumente el gas de accionamiento de 200 mBar a 1700 mBar durante varios minutos. El gas de enfriamiento VT es constante a ~ 1070 L / h.)NOTA: Al levantar el tubo de la microcentrífuga y el captador de muestras de RMN fuera del baño de nitrógeno líquido, asegúrese de que el tubo de la microcentrífuga tenga suficiente nitrógeno líquido en su interior para rodear el rotor. Minimice el tiempo entre la transferencia del rotor al captador de muestras de RMN y la inserción del captador de muestras de RMN en el espectrómetro. Todos los pasos en 3.4 deben completarse dentro de los 30 s. 4. Eliminación criogénica de la muestra del espectrómetro de RMN Preparación del baño de nitrógeno líquido y el vial criogénico Vierta 500 ml – 1 L de nitrógeno líquido en el dewar de espuma de boca ancha y coloque el baño debajo del espectrómetro. Preenfríe el vial criogénico. Sumerja el vial criogénico vacío que contiene un trozo de papel de seda en el baño de nitrógeno líquido. Transferencia criogénica del rotor de la sonda al vial criogénico Reduzca la velocidad de giro a 0 kHz reduciendo el flujo de gas de conducción y rodamiento y expulse el rotor cambiando al modo de eyección. Mantenga el modo de eyección encendido, retire el captador de muestras de la sonda, deje caer el rotor directamente en el dewar de espuma de boca ancha que contiene nitrógeno líquido. Usando pinzas pre-enfriadas, transfiera el rotor a un vial criogénico pre-enfriado debajo de la superficie del nitrógeno líquido. Tapa el vial criogénico. Prechill la tapa del vial criogénico sumergiéndola en nitrógeno líquido. Retire el vial criogénico que contiene el rotor y el nitrógeno líquido del baño y tape el tubo con una tapa preenlazada. No apriete la tapa para que el nitrógeno vaporizante pueda liberarse de manera segura. Vuelva a sumergir el vial criogénico en nitrógeno líquido. La muestra puede transferirse al almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo o desempaquetarse inmediatamente para su posterior análisis. 5. Desembalaje del rotor y mediciones de viabilidad Desembalaje del rotor y medición de la viabilidad Medios libres de suero precalentado (DMEM) o PBS a 37 °C. Retire el rotor del nitrógeno líquido. Retire la punta de la unidad y el enchufe de silicio.NOTA: El zafiro es un excelente conductor de calor. Evite tocar el rotor con los dedos porque la transferencia de calor puede causar eventos locales de congelación-descongelación que comprometen la viabilidad celular. Medición de la viabilidad Agregue 20 μL de medios calientes al pellet de celda congelado en el rotor y resuspenda las células. Retire la suspensión con una pipeta y mezcle la suspensión con 100 μL de soporte. Retire 10 μL de suspensión celular y mezcle con el mismo volumen de solución de azul de tripano al 0,4% (v/v). Incubar a temperatura ambiente durante 30 s a 1 min. Mida la viabilidad utilizando el contador de celdas automatizado.

Representative Results

La inserción criogénica de muestras precongeladas de células de mamíferos en el espectrómetro de RMN apoya la viabilidad a lo largo del experimento de RMN. Los esquemas de transferencia criogénica de una muestra congelada a una sonda de RMN preenfriada se muestran en la Figura 1. La viabilidad celular y la integridad se pueden evaluar utilizando una variedad de métodos. Aquí utilizamos una medida estándar basada en tinte de la integridad de la membrana, que se alinea bien con otros métodos23. Las células intactas son impermeables al azul tripano, mientras que las células con integridad de membrana comprometida son permeables. El número de células permeables e impermeables al azul tripano se puede evaluar rápidamente utilizando un contador de células automatizado. Utilizando el protocolo descrito aquí, la permeabilidad del azul tripano de las células de mamíferos después de la RMN MAS (es decir, en el punto 5.2.3) es similar a la permeabilidad del azul tripano de las células de mamíferos antes de cualquier cambio de temperatura (es decir, el punto 2.1.3). Sin embargo, si las células se congelan lentamente, luego se calientan a temperatura ambiente antes de la inserción (es decir, siguiendo el protocolo del punto 3 antes de calentar el rotor a temperatura ambiente antes de insertarlo en la sonda refrigerada), la viabilidad celular evaluada por el azul de tripano disminuye a menos del 10% de las células (Figura 2). Por lo tanto, la congelación de células dentro del espectrómetro resulta en la pérdida de la integridad de la membrana celular, mientras que la inserción criogénica de muestras congeladas de células de mamíferos apoya la viabilidad celular a lo largo del experimento de RMN. Figura 1: Esquema de transferencia criogénica de una muestra congelada a una sonda de RMN preenfriada. (A) Acérquese a la superficie del nitrógeno líquido y desenrosque la parte superior del vial criogénico. (B) Deslice el rotor en el baño de nitrógeno líquido. (C) Sumergir un tubo de microcentrífuga con pinzas y mantenerlo en su lugar hasta que se enfríe por completo. (D) Inserte el rotor en la microcentrífuga con la punta de accionamiento orientada hacia la parte inferior del tubo. Empuja, en lugar de agarrar, con las pinzas. (E) Sostenga el tubo de la microcentrífuga justo debajo de la superficie del baño de nitrógeno líquido e inspeccione visualmente el rotor para asegurarse de que esté libre de heladas y bien marcado. (F) Mantenga el captador de muestras en un ángulo por encima de la superficie. (G) Levante el captador de muestras y el tubo fuera del nitrógeno líquido tan pronto como el captador de muestras esté dentro del tubo de la microcentrífuga. (H) Agite el captador de muestras si el rotor queda atrapado en la llanta. (I) Retire el captador de muestras vacío de la sonda y póngalo en el suelo. (J) Retire el tubo de la microcentrífuga del captador de muestras con el rotor dentro, inserte, apriete el captador de muestras en la sonda y presione “INSERTAR” en la consola de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: La inserción criogénica de una muestra precongelado de células de mamíferos da como resultado mediciones de la integridad celular que son similares a las muestras de células de mamíferos que nunca se han congelado. El porcentaje de células impermeables de azul tripano para muestras que nunca se han congelado (por ejemplo, paso 2.1.3) es similar al de células para muestras después de LA RMN MAS (por ejemplo, paso 5.2.3 con MAS de 12 kHz). Las células congeladas lentamente (por ejemplo, el paso 3) que se calentaron a temperatura ambiente antes de la inserción en el instrumento de RMN que se habían enfriado previamente a 100 K tenían porcentajes mucho más bajos de células intactas después de la RMN MAS con MAS de 12 kHz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La transferencia criogénica de muestras congeladas a un espectrómetro de RMN tiene éxito en la preservación de la viabilidad de las células de mamíferos congeladas a través de la adquisición de datos de RMN. El éxito de esta metodología se demuestra en las mediciones de viabilidad de RMN pre y post MAS. Este enfoque es exitoso y generalizable a cualquier sistema donde las fluctuaciones de temperatura puedan comprometer la integridad de la muestra. El protocolo presentado actualmente se realiza con la línea celular HEK 293. Debido a que las condiciones de criopreservación para muchas líneas celulares de mamíferos son muy similares, es probable que las condiciones reportadas aquí sean traducibles a otros sistemas celulares; sin embargo, pueden requerir una mayor optimización de los crioprotectores, los volúmenes de muestra y las tasas de congelación para lograr los mismos resultados.

Esta metodología se puede mejorar desempaquetando el rotor más rápido después del experimento de RMN. Este paso es actualmente sub óptimo y su ejecución afecta a la viabilidad de las células. Antes de que las células puedan ser resuspendidas en medios, la punta de la unidad y el tapón de silicio deben retirarse del rotor. La muestra se descongela de manera desigual cuando el rotor se mantiene durante la extracción de la punta de accionamiento y el tapón de silicio, por lo que los tiempos de manejo del rotor más cortos dan como resultado mayores viabilidades. El desarrollo de soportes de rotor u otras herramientas para facilitar la descongelación uniforme y la eliminación rápida de la punta de accionamiento y el tapón de silicio ayudaría a hacer que la evaluación posterior a la RMN de la viabilidad sea más precisa.

El enfoque de la carga criogénica de muestras descrito en este artículo se limita a las sondas de RMN que admiten la inserción y eyección de muestras con la sonda en su lugar en el orificio del imán de RMN. Si bien la inserción y eyección de muestras externas es estándar para los sistemas DNP comerciales, las sondas personalizadas no siempre tienen esta opción. Además, este enfoque para la carga criogénica de muestras puede requerir alguna modificación para las sondas de RMN construidas para ser compatibles con rotores de diferentes tamaños. Este protocolo se ha optimizado para rotores de 3,2 mm y puede requerir modificaciones si el diámetro exterior del captador de muestras excede el diámetro interior de un tubo de microcentrífuga (por ejemplo, paso 3.4.2).

Con la aplicación de DNP a MAS NMR, ahora es posible detectar proteínas y otras biomoléculas a concentraciones fisiológicas endógenas24,25,26. Esto abre la posibilidad de estudiar biomoléculas dentro de sus entornos nativos. Es probable que el mantenimiento de la integridad celular y la viabilidad a lo largo del experimento sea fundamental para conectar los resultados experimentales de la espectroscopia con los fenómenos biológicos. La congelación incontrolada de muestras que contienen proteínas purificadas o lisatos celulares no suele comprometer la calidad de la muestra7,27, aunque hay algunos indicios de que la tasa de congelación puede ser una variable importante incluso en sistemas purificados28. Sin embargo, las muestras de células de mamíferos deben congelarse a un ritmo controlado si la preservación de la integridad celular y la viabilidad es importante para la interpretación. Aquí presentamos un protocolo para congelar y transferir muestras congeladas de células de mamíferos a un instrumento de RMN DNP MAS preenfriado que evita fluctuaciones de temperatura potencialmente dañinas y admite la medición en células viables.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas [RR150076], la Fundación Nacional de Ciencias [1751174]; los Institutos Nacionales de Salud [NS-111236], la Fundación Welch [1-1923-20170325]; la Fundación Lupe Murchison, la Fundación Ted Nash Long Life y la Fundación Kinship (Searle Scholars Program) a K.K.F.

Materials

0.4% Trypan blue stain Invitrogen T10282
100 mm cell culture dish Thomas Scientific 430167
150 mm cell culture dish Nunc 157150
3.2 mm sapphire rotor Bruker
45 ° angled forceps Hampton Research HR4-859
AMUPol Cortecnet C010P005
Black and Silver marker Sharpie
Cap removing tool Bruker ?
Cell culture grade water HyClone SH30529.03
Ceramic cap Bruker
CoolCell Corning/ Biocision UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10288
Countess II automated cell counter Invitrogen AMQAF1000
Cryogen tubes Nalgene 03-337-7Y
d8-glycerol Aldrich 447498
Deuterium oxide, 99.8 % atom D Aldrich 756822-1
DMEM Gibco 10569-010
DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron Bruker
Foam dewar Spearlab FD-800
Kimwipes Kimwipes
Packaging tool Bruker ?
Pen-Strep Gibco 15140-122
Powdered PBS VWR VWRRV0780
Protonated PBS Gibco 10010-023
Silicon plug Bruker
Standard Vessel forceps
Tryp-L Gibco 12605010
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Referenzen

  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer’s disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemie. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemie. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

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Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability. J. Vis. Exp. (163), e61733, doi:10.3791/61733 (2020).
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