MS2-аффинная очистка в сочетании с секвенированием РНК у грамположительных бактерий

Сотни, возможно, даже тысячи мелких регуляторных РНК (сРНК) были идентифицированы в большинстве бактериальных геномов, но функции подавляющего большинства из них остаются нехарактеризованными. В целом, сРНК представляют собой короткие некодирующие молекулы, играющие важную роль в бактериальной физиологии и адаптации к флуктуирующим средам^1,2,3. Действительно, эти макромолекулы находятся в центре многочисленных сложных регуляторных сетей, влияющих на метаболические пути, стрессовые реакции, а также на вирулентность и устойчивость к антибиотикам. Логично, что их синтез запускается специфическими раздражителями окружающей среды (например, питательным голоданием, окислительными или мембранными стрессами). Большинство сРНК регулируют множественные целевые мРНК на посткрипционном уровне посредством короткого и несмежного спаривания оснований. Они обычно предотвращают инициацию трансляции, конкурируя с рибосомами за области инициации трансляции^4. Образование дуплексов сРНК:мРНК также часто приводит к активной деградации целевой мРНК путем рекрутинга специфических РНК.

Характеристика мишени сРНК (т.е. всего набора ее целевых РНК) позволяет идентифицировать метаболические пути, в которые она вмешивается, и потенциальный сигнал, на который она отвечает. Следовательно, функции конкретной сРНК обычно могут быть выведены из ее мишени. Для этой цели было разработано несколько инструментов прогнозирования in silico, таких как IntaRNA и CopraRNA^5,6,7. Они, в частности, полагаются на комплементарность последовательностей, энергию сопряжения и доступность потенциального места взаимодействия для определения предполагаемого партнера сРНК. Однако алгоритмы прогнозирования не интегрируют все факторы, влияющие на парирование оснований in vivo, такие как участие РНК-шаперонов^8, благоприятствующих неоптимальным взаимодействиям или совместной экспрессии обоих партнеров. Из-за присущих им ограничений частота ложных срабатываний инструментов прогнозирования остается высокой. Большинство экспериментальных крупномасштабных подходов основаны на совместной очистке пар сРНК:мРНК, взаимодействующих с помеченным РНК-связывающим белком (RBP)^6,9. Например, методом взаимодействия РНК путем лигирования и секвенирования (RIL-seq) идентифицировал дуплексы РНК, совместно очищенные с РНК-шаперонами, такими как Hfq и ProQ в Escherichia coli^10,11. Аналогичная технология, называемая УФ-сшиванием, лигированием и секвенированием гибридов (CLASH), была применена к RNase E- и Hfq-ассоциированным сРНК в E. coli^12,13. Несмотря на хорошо описанную роль Hfq и ProQ в сРН-опосредоточенной регуляции у нескольких бактерий^8,14,15,регуляция на основе сРНК, по-видимому, не зависит от РНК-шаперона в нескольких организмах, таких как S. aureus^16,17,18. Даже если очистка дуплексов РНК в сочетании с РНКазами осуществима, как показали Уотерс и коллеги^13,это остается сложным, поскольку РНКазы вызывают их быструю деградацию. Следовательно, MS2-аффинная очистка в сочетании с подходом^19,20 секвенирования РНК (MAPS) представляет собой надежную альтернативу в таких организмах.

В отличие от вышеупомянутых методов, MAPS использует конкретную сРНК в качестве приманки для захвата всех взаимодействующих РНК и, следовательно, не полагается на участие RBP. Весь процесс показан на рисунке 1. Короче говоря, сРНК помечена на 5′ аптамером РНК MS2, который специально распознается белком оболочки MS2. Этот белок сливается с мальтозосвязывающим белком (MBP) для иммобилизации на амилозной смоле. Поэтому MS2-сРНК и ее РНК-партнеры сохраняются на колонке аффинной хроматографии. После элюирования мальтозой коочищенные РНК идентифицируют с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК с последующим биоинформатическим анализом(рисунок 2). Технология MAPS в конечном итоге рисует интерактивную карту всех потенциальных взаимодействий, происходящих in vivo.

Технология MAPS изначально была реализована в непатогенной грамотрицательной бактерии E. coli^21. Примечательно, что MAPS помог идентифицировать фрагмент, полученный из тРНК, специфически взаимодействующий как с RyhB, так и с RybB sRNAs и предотвращающий любой транскрипционный шум сРНК для регулирования мишеней мРНК в неиндуцирующие условиях. После этого MAPS был успешно применен к другим РНК E. coli, таким как DsrA^22,RprA^23,CyaR²³ и GcvB²⁴ (таблица 1). В дополнение к подтверждению ранее известных целей, MAPS расширил мишень этих хорошо известных сРНК. Недавно MAPS был выполнен в Salmonella Typhimurium и показал, что SraL sRNA связывается с rho mRNA, кодируя фактор прекращения транскрипции^25. Благодаря этому спариванию SraL защищает мРНК ро от преждевременного прекращения транскрипции, вызванного самим Ро. Интересно, что эта технология не ограничивается сРНК и может быть применена к любому типу клеточных РНК, примером которого является использование фрагмента^26, полученного из тРНК, и 5′-нетранслированной^{области мРНК 22} (таблица 1).

Метод MAPS также был адаптирован к патогенной грамположительной бактерии S. aureus^19. В частности, протокол лизиса был широко модифицирован для эффективного разрыва клеток из-за более толстой клеточной стенки, чем грамотрицательные бактерии, и для поддержания целостности РНК. Этот адаптированный протокол уже разгадал интерактом RsaA^27,RsaI²⁸ и RsaC^29. Этот подход дал представление о решающей роли этих сРНК в регуляторных механизмах свойств клеточной поверхности, поглощения глюкозы и реакций на окислительный стресс.

Протокол, разработанный и реализованный в E. coli в 2015 году, был недавно подробно описан^30. Здесь мы предоставляем модифицированный протокол MAPS, который особенно подходит для изучения регуляторных сетей сРНК у грамположительных (более толстых клеточных стенк) бактерий, будь то непатогенные или патогенные (меры предосторожности).