Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Elektrofysiologische meting van levende hippocampale plakjes in vitro is een krachtige experimentele aanpak met tal van voordelen. De experimenteerder kan een microscoop, micromanipulatoren en een opnamesysteem gebruiken om metingen van individuele neuronen in het weefsel direct te visualiseren en te verzamelen. Weefselplakken zijn ook zeer toegankelijk voor fotostimulatie of medicijnafgifte voor optogenetische, chemogenetische of farmacologische experimenten.

Het hippocampale netwerk genereert zeer synchrone populatieactiviteit in vivo, zichtbaar als oscillaties in het extracellulaire lokale veldpotentieel^1,2,3,4,5. Hersenschijfmethoden zijn gebruikt om inzicht te krijgen in de cellulaire en circuitmechanismen die ten grondslag liggen aan deze neuronale netwerkschommelingen. Fundamenteel werk van Maier et al. toonde aan dat scherpe golf-rimpelcomplexen (SWR’s) spontaan kunnen ontstaan in plakjes van de ventrale hippocampus^6,7. Latere studies van meerdere onderzoekers hebben geleidelijk vele aspecten van SWR ‘s opgehelderd, waaronder de rol van neuromodulatoren bij het reguleren van de netwerktoestand van de hippocampus^8,9,10 en de synaptische mechanismen die de in vitro reactivering stimuleren van neuronale ensembles die eerder actief waren tijdens gedrag in vivo¹¹. Hersensegmentexperimenten hebben ook inzicht gegeven in de oscillatie van het gammabereik (30-100 Hz), een duidelijke hippocampale netwerkstatus waarvan wordt aangenomen dat deze geheugencodering ondersteunt en^12,13terugroept. Ten slotte, het erkennen van de centrale rol van de hippocampus en bijbehorende structuren in de pathofysiologie van temporale kwab epilepsie^14,15, onderzoekers hebben hippocampale plakpreparaten gebruikt om de generatie en propagatie van epileptiforme activiteit te onderzoeken. Carter et al. toonden aan dat gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex plakjes bereid van chronisch epileptische dieren spontaan epileptiforme afscheidingen kunnen genereren in vitro¹⁶. Vervolgens onderzochten Karlócai et al. de mechanismen die ten grondslag liggen aan epileptiforme lozingen in hippocampale plakjes met behulp van gemodificeerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met gewijzigde ionenconcentraties (verlaagde Mg²⁺ of verhoogde K⁺) of toegevoegde geneesmiddelen (4AP of gabazine)¹⁷.

Onderzoekers hebben tal van hippocampale segmentbenaderingen ontwikkeld die op belangrijke manieren verschillen: (1) het gebied van de hippocampus in de plak (dorsaal, gemiddeld of ventral); (2) de aan- of afwezigheid van extrahippocampale weefsels zoals de entorhinale cortex; (3) de oriëntatie die wordt gebruikt om plakjes te snijden (coronaal, sagittaal, horizontaal of schuin); en (4) de omstandigheden waaronder het weefsel wordt onderhouden na het snijden (volledig ondergedompeld in ACSF of vastgehouden op het raakvlak van ACSF en bevochtigde, carbogenrijke lucht).

De keuze van de gebruiksbenadering moet worden bepaald door de experimentele doelstelling. Transversale of coronale plakjes van de dorsale hippocampus die onder ondergedompelde omstandigheden worden gehouden , zijn bijvoorbeeld zeer effectief gebruikt voor het onderzoek naar intrahippocampale circuits en synaptische plasticiteit^18,19,20. Dergelijke preparaten genereren echter niet spontaan netwerkschommelingen zo gemakkelijk als plakjes uit de ventrale hippocampus^21,22,23. Hoewel een toestand van aanhoudende SWR-activiteit kan worden geïnduceerd door tetanische stimulatie in dwarse plakjes van de dorsale en ventrale hippocampus²⁴, worden spontane SWR ‘s gemakkelijker waargenomen in ventrale plakjes^7,25.

Een inherent fysiologisch en anatomisch onderscheid tussen de dorsale en ventrale hippocampus wordt ondersteund door studies die zowel in vivo als in vitro²⁶zijn uitgevoerd . Opnames bij ratten toonden sterk coherente thetaritmes in de dorsale en intermediaire hippocampus, maar slechte samenhang tussen het ventrale gebied en de rest van de hippocampus²⁷. SWR’s in vivo vermeerderen zich gemakkelijk tussen de dorsale en intermediaire hippocampus, terwijl SWR’s die afkomstig zijn uit de ventrale hippocampus vaak lokaal blijven²⁸. De associatieprojecties afkomstig van CA3 piramidale neuronen die zich in de dorsale en intermediaire hippocampus bevinden, projecteren lange afstanden langs de lengteas van de hippocampus. CA3-projecties afkomstig uit ventrale regio ‘s blijven relatief lokaal en zullen dus minder snel worden doorgesneden tijdens het snijproces^29,30. Ventrale segmenten kunnen daarom het terugkerende netwerk dat nodig is om populatiesynchronisatie te genereren, beter behouden. De neiging van ventrale segmenten om spontane netwerkactiviteiten in vitro te genereren , kan ook een hogere intrinsieke prikkelbaarheid van piramidale neuronen of zwakkere GABAergische remming in de ventrale hippocampus weerspiegelen in vergelijking met meer dorsale regio ‘s³¹. Ventrale hippocampale plakjes zijn inderdaad vatbaarder voor epileptiforme activiteit^32,33. Zo hebben veel studies van spontane fysiologische^8,9,11,24 of pathologische^{16,34, 35,36} netwerkschommelingen traditioneel een horizontale snijbenadering gebruikt, soms met een lichte hoek in de fronto-occipitale richting, die weefselschijfjes oplevert parallel aan het dwarsvlak van de ventrale hippocampus.

Netwerkconnectiviteit wordt onvermijdelijk beïnvloed door de snijprocedure, omdat veel cellen in het segment worden doorgesneden. De hoek en dikte van de plak en het weefsel dat in het preparaat wordt vastgehouden, moeten worden overwogen om de connectiviteit in de betrokken circuits te optimaliseren. Veel studies hebben horizontale gecombineerde hippocampal-entorhinale cortex slices (HEC) gebruikt om interacties tussen de twee structuren te verkennen in de context van fysiologische of pathologische netwerkschommelingen. Roth et al. voerden dubbele opnamen uit vanuit het CA1-subveld van de hippocampus en laag V van de mediale entorhinale cortex om de voortplanting van SWR-activiteit door het HEC-segment³⁷aan te tonen. Veel studies naar epileptiforme activiteit hebben het HEC-plakpreparaat gebruikt om te onderzoeken hoe epileptiforme lozingen zich voortplanten via het corticohippocampale netwerk^16,35,36,38. Het is belangrijk op te merken dat het behoud van de intacte corticohippocampale lus geen vereiste is voor spontane ZVR’s, epileptiforme ontladingen of gamma-oscillaties; netwerkschommelingen kunnen worden gegenereerd in dwarssegmenten van de dorsale of ventrale hippocampus zonder aangebouwde parahippocampale weefsels^{21,22,23, 25,39,40,41}. Een belangrijkere factor voor de spontane generatie van netwerkschommelingen in hippocampale segmenten kan de dikte van elke segment zijn, omdat een dikker segment (400-550 μm) meer connectiviteit in het CA2/CA3 terugkerende netwerk^21,22,25zal behouden .

Hoewel schuine horizontale HEC-segmenten (gesneden met een hoek van ongeveer 12° in de fronto-occipitale richting) zijn gebruikt om de functionele connectiviteit van de corticohippocampale lus¹¹,^16,34,35,42te bestuderen , zijn dergelijke schuine preparaten niet vereist voor spontane netwerkactiviteit^43,44,45. Het gebruik van een schuin snijvlak stelt de onderzoeker echter in staat om selectief plakjes te maken die het beste de transversaal georiënteerde lamellen van de ventrale of intermediaire hippocampus behouden, afhankelijk van het feit of een neerwaartse of een opwaartse hoek wordt toegepast (figuur 1). Deze benadering is conceptueel vergelijkbaar met die van Papatheodoropoulos et al., 2002, die elke hippocampus vrij ontleedden en vervolgens een weefselhelikopter gebruikten om dwarse plakjes te maken langs de hele dorsaal-ventrale as²¹. In het licht van het bovengenoemde functionele onderscheid tussen de ventrale en dorsaal-intermediaire hippocampus, moeten onderzoekers bij het ontwerpen van experimenten of het interpreteren van resultaten rekening houden met de anatomische oorsprong van plakjes. Het gebruik van een agar ramp tijdens de snijprocedure is een eenvoudige manier om bij voorkeur plakjes te produceren van de tussenliggende of ventrale hippocampus.

Hippocampale plakjes kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde kamer (met het weefsel volledig ondergedompeld in ACSF), of een interface-achtige kamer (bijv. Oslo- of Haas-kamer, met plakjes die alleen worden bedekt door een dunne film van vloeiende media). Interfaceonderhoud verbetert de oxygenatie van het weefsel, wat de neuronale overleving bevordert en een aanhoudend hoog niveau van interneuronale activiteit mogelijk maakt. Traditioneel gebruiken ondergedompelde opnameomstandigheden een langzamer ACSF-debiet dat onvoldoende weefsel oxygenatie biedt voor stabiele expressie van oscillaties op netwerkniveau. In ondergedompelde hippocampale plakjes worden carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties slechts tijdelijk waargenomen^46,47, terwijl ze stabiel kunnen worden onderhouden in interface-opnamekamers^10,48,49. Als zodanig hebben veel studies naar complexe spontane activiteit in vitro vertrouwd op interface-opnamekamers om scherpegolfrimpelcomplexen⁶, 7^{,8,9,10,25,37}, gamma-oscillaties^10,13en epileptiforme activiteit^16,38,45,47te onderzoeken .

In een opnamekamer in ondergedompelde stijl kan een onderdompelingsmicroscoopdoelstelling worden gebruikt om individuele cellen te visualiseren en selectief te richten op gezond uitziende cellen voor opnames. Het ondergedompelde preparaat maakt ook een fijne controle over het cellulaire milieu mogelijk, omdat onderdompeling een snelle verspreiding van geneesmiddelen of andere verbindingen naar het weefsel vergemakkelijkt. Een gewijzigde methodologie waarbij stabiele netwerkschommelingen onder ondergedompelde omstandigheden worden gehandhaafd, vertegenwoordigt dus een krachtige experimentele aanpak. Deze benadering wordt geïllustreerd door het werk van Hájos et al., waarin hippocampale plakjes zich enkele uren in een vereenvoudigde interface-achtige houdkamer herstellen voordat ze worden overgeplaatst naar een gewijzigde ondergedompelde opnamekamer met een hoog debiet van ACSF (~ 6 ml / min) om de zuurstoftoevoer naar het weefsel te verbeteren^12,48,49. Onder deze omstandigheden kunnen hoge niveaus van interneuronactiviteit en stabiele spontane netwerkschommelingen in een ondergedompelde opnamekamer worden gehandhaafd. Deze gewijzigde aanpak stelt de onderzoekers in staat om visueel geleide hele-cel patchklemopnamen uit te voeren en de bijdrage van morfologisch geïdentificeerde celtypen aan carbachol-geïnduceerde gamma-oscillaties¹²te karakteriseren. SWR ‘s kunnen ook spontaan voorkomen in ondergedompelde hippocampale plakjes met een snel debiet van ACSF^11,48,49. Maier et al. toonden aan dat hippocampale plakjes die zich in een interfacekamer herstelden voordat ze naar een ondergedompelde opnamekamer werden gebracht, op betrouwbare wijze spontane SWR’s vertoonden, terwijl plakjes die zich vóór de overdracht naar een ondergedompelde opnamekamer onder water herstelden, kleinere opgeroepen veldreacties vertoonden, lagere niveaus van spontane synaptische stromen vertoonden en slechts zeer zelden spontane ZVR’s^{vertoonden 43}. Schlingloff et al. gebruikten deze verbeterde methodologie om de rol van parvalbumine-uitdrukkende mandcellen in de generatie van spontane SWR ‘s aan te tonen⁴⁴.

Het volgende protocol presenteert een snijmethode waarmee spontaan actieve neuronen in horizontale hippocampale plakjes onder interfaceomstandigheden kunnen worden hersteld en vervolgens kunnen worden onderhouden in een ondergedompelde opnamekamer die geschikt is voor farmacologische of optogenetische manipulaties en visueel geleide opnamen.