中子大分子晶体学晶体生长优化

1. 微透析按钮透析方法 样品制备 通过溶解30毫克的鸡蛋清溶酶作为亲血粉在1 mL的CH3COONa缓冲液（100米醋酸钠，pH 4）中准备蛋白质溶液，以获得最终浓度为30毫克-mL-1的溶液。 将样品在 13，000 × 克 中离心 10 分钟，在 277 K。此过程有助于在开始结晶过程之前移除任何聚合物。 检查样品在280nm的吸收量，并使用啤酒-兰伯特方程（A=εcl）计算蛋白质浓度。注：根据啤酒-兰伯特方程，电子吸收（A）与吸收物种的浓度（c，mg=mL-1）成正比，因为吸收物种的光学路径长（l，cm）是恒定的。这种线性关系的梯度是摩尔灭绝系数（ε，280nm的酶为2.64 mL+mg+1+cm+1）19。芳香氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）和细胞素残留物之间的脱硫键的侧链具有很强的吸收力，在+280 nm由光谱允许的π-π*过渡产生。由于大多数蛋白质都含有这些残留物，因此，鉴于对灭绝系数的了解，蛋白质浓度通常可以通过测量280nm的吸收量来轻松计算。 准备 图 4中显示的结晶解决方案。在准备结晶溶液之前，使用 0.22 μm 毫pore 过滤器过滤所有库存解决方案。 晶体生长 切一个纤维素透析膜与适当的分子重量截止（6-8 kDa），并浸泡在蒸馏水中。注：透析膜盘在商业上可用于微透析按钮，但如果使用透析管，不要忘记切割边缘，以便将两层膜从管子中分离出，只有单层膜。 以图 4 中显示的相同顺序，用 2 mL 的结晶溶液填充 24井托盘的井。注：如果使用体积较大的按钮（例如 200 μL），则用至少 5 mL 结晶溶液填充 50 mL 管，以确保高效交换。 在微透析按钮的腔室中添加/派珀特 35 μL 溶液， 如图 5A所示。注：为了避免在关闭时在 30 μL 透析按钮中形成气泡，必须添加额外的 5 μL 额外蛋白质体积（死体积），这意味着蛋白质样本总共为 35μL。这个额外的蛋白质样本在腔室顶部形成一个略带圆顶的形状，如 图5B所示，它防止气泡的形成。 取一个适当大小的施用器，将弹性O型环放在其四肢（图5C）。然后将以前使用一张无纤维纸轻轻擦拭/排干的膜放在透析按钮的腔室顶部。涂纸时要小心不要在室内放灰尘。通过将弹性 O 形环从施用器转移到透析按钮的凹槽（图 5C）来设置透析膜。注：处理的关键时刻是通过将弹性 O 形环从施用器转移到透析按钮的凹槽中，将透析膜固定在腔室顶部。所有运动必须完全同步，以避免将气泡与蛋白质室中的样品封闭。在应用前练习拉伸弹性O-环，了解其刚性，在应用过程中使用钳子保持部分膜，并用模型蛋白进行首次测试实验是有用的。 使用钳子（图5D）将按钮转移到井或50 mL管。 用盖子盖住油井，轻轻压在油脂上密封油井（图5E）。注意：如果油井顶部没有油脂，请务必在开始实验前添加此油脂，或使用胶带而不是玻璃盖片。使用微透析按钮的蛋白质结晶原理如 图5所示。 将样品保持在 293 K 的热调节孵化器中。根据所使用的蛋白质和结晶条件，可能需要不同的温度。注： 图 4 中显示的相同结晶条件网格（允许沉淀物浓度变化）可以筛选为温度函数。在这种情况下，必须复制相同的结晶板，并且每个拷贝必须放置在不同温度下调节的孵化器中。这需要有几个无振动的热调节孵化器可用。 检查托盘或管子是否有晶体（图4），并定期（通常每天）做笔记，以区分每个托盘中的内容。良好的音符对于避免误报结果和区分晶体的灰尘至关重要。 2. 使用 OptiCrys 的晶体生长过程 样品制备 准备蛋白质溶液和透析膜，如第1.1节所述。 准备 NaCl （4 M） 和 CH3COONa pH 4 （1 M） 的库存解决方案，并将其过滤成 50 mL 管。 将蛋白质溶液（15 μL的溶酶与30mg=mL-1）添加到温度控制的流动储层透析设置的透析室中。有关温度控制流动储层透析设置的详细信息，请参阅图 6。OptiCrys 有两个透析室，最小体积为 15 μL，最大体积为 250μL。 用透析膜盖住过腔膜，用弹性O型环（图6B）固定膜。注：此设置不同于微透析按钮，其中每个腔室由透析膜直接密封。在流动细胞中，透析膜被固定在过腔腔上，允许在不去除的情况下安装晶体。为此，过蓄水池可以简单地从水库拧开。 翻转过腔，放在透析室的顶部。缓慢而轻轻地按下它，以消除被困在两块之间的所有空气，并避免在室内的气泡（图6C）。在训练时使用模型蛋白质进行练习，以避免气泡和样品流失，是有利的。 修复水库的位置，轻轻地拧在过蓄水池的顶部，再次注意避免捕获气泡。水库的过度拧紧也会在结晶室（图6D）中形成气泡。 加入结晶溶液，盖上密闭的储层。（图6G）。水库的最大容量为1mL。 转移此组件并将其插入黄铜支部。此支持与用于控制温度的佩尔蒂埃元素保持接触。 如图 6所示，气密盖配有光学窗口，允许透析室的顶部照明。将光源（图2）放在窗户上，让光线穿过房间。 储层室可以连接到泵，使其能够作为连续流动单元发挥作用。将包含库存溶液和蒸馏水的 50 mL 管顶部的管子连接到旋转阀，如 图 7所示。注：如果实验期间不需要自动制备和更换结晶溶液，请省略步骤 2.1.10。在这种情况下，必须准备结晶溶液，并手动预填充储层。 软件 打开计算机并启动软件 克罗伊萨斯纵横交错[水晶生长]。此控制软件使用 LabVIEW（http://www.ni.com/labview/）编写，并提供用户友好的图形界面。它包括 4 个不同的图形界面（Accueil [欢迎]， 帕拉梅特拉格 [设置]， Essai [测试]， 和 维护 [维护]（图 8） 。注：法语翻译在括号内。 单击图 8中所示的按钮，选择维护视图。此视图是当前最常用的视图，允许用户在实验期间控制大多数参数。注：单击 维护 视图后，将出现具有不同部分以控制温度或光线等参数的新窗口。在 图 8 中，此视图的不同部分以箭头和帧显示。在以下步骤中，我们演示如何使用软件控制每个参数。 温度控制器（温度控制器）部分允许控制和监测温度。单击图 8中的头号（1）按钮以打开它。注：奥普蒂克里斯的温度范围为233.0-353.0±0.1 K。 设置 托运人 [设置点] 部分的温度，然后按输入 （图 8（2）。在此按钮下方，有一个带有 2 个痕迹的图形（红色和黄色）。红色痕迹显示最终（有序）温度，黄色痕迹显示当前温度。如图 8（2）所示，温度设置为 20 °C。注：为了生长晶体，正如晶体生长部分所解释的，需要选择许多温度。要更改温度，在 托运人 [设置点] 部分添加每个新温度，然后按键盘上的”输入”按钮。 通过增加图 8中的Lumiéres [灯]部分的亮度来打开灯。亮度范围从 0 到 100，”0″表示光关闭，在”100″时，光设置为最大强度和亮度。通过增加光线，在显微镜部分，人们可以看到透析室内。在实验过程中，细胞的亮度可能会有所不同：调整参数以清楚地显示透析室内部。也可以通过使用”缩放”前的+和–按钮来增加或减少放大倍率，以便更好地查看。 在显微镜部分的右侧，有几个部分用于存储每个结晶实验的相关信息。每个用户可以创建一个文件夹来存储有关所用透析膜的结晶条件、蛋白质名称和分子重量截止的信息（图 8（3）。 用户只需在名号[文件夹名称]上键入实验名称即可定义该实验的名称。点击档案[文件夹按钮]（图8中的绿色框架显示）打开一个新的窗口。在此窗口中，将有一个文本文件，其中包含为实验定义的所有信息。此外，此文件夹中还保存了时间戳图像，以供将来处理。 从 NB 图像 部分， 选择在实验过程中应拍摄的图像数量。指定右侧面板中的图像数量以及它们之间的所需时间间隔（例如，最小、小时、一天）。 图 8 显示软件设置，在一分钟内记录零图像。注：使用庞培 [泵]部分混合库存溶液，并将结晶溶液注入储层腔室。有关流体混合系统原理的解释，请参阅第2.1.10 节和图 7。 Etape 1 [步骤 1]中库存解决方案的输入浓度：解决方案库存。对于下一节的结晶实验，将使用 NaCl 4 M 和 CH3COONa 1 M pH 4。注：库存溶液的浓度在摩尔单元中。 定义每个解决方案的最终浓度。例如，NaCl 为 0.75 M，CH3COONa pH 4 为 0.1 M。将这些输入到 Etape 2 [步骤 2]中的最后浓度部分 （图8）：解决方案 [ 准备的解决方案] 。按下微积分 [计算]按钮，该按钮在图 8中显示红色帧。用于混合的每个库存解决方案的最终体积将显示在每个集中面板前的音量面板中。 按 下兰瑟（启动准备） 按钮（图8）。如 图7所示，旋转阀需要每个库存溶液，并通过开关将其注入搅拌管。 在准备结晶解决方案后，单击 Etape 3 中的 Entrée 解决方案 [解决方案条目] 按钮 [步骤 3]： 泵部分的通量（ 图 8中的黄色框架）。开关改变，将新的结晶溶液从混合管注入储层腔室。要停止交换过程，请按 Arrét 分发 [分发停止] 按钮。注：在实验过程中观察结晶过程，并在监理软件的相应图形界面中修改温度、结晶溶液和缩放等参数。通过使用该软件，无需在实验过程中拆下密闭的上限或流动单元，因此唯一的变量将是用户通过软件更改的变量。 大晶体生长 在透析室（图6A）中加入浓度为30毫克-mL-1的15微升溶酶。注：准备第1.1节所述的蛋白质样本。 组装第2.1节和 图6中描述的温度控制流动水库透析设置。 准备结晶溶液。不要忘记在用 0.22 μm 过滤器进行样品准备之前过滤所有库存解决方案。对于此实验，结晶溶液包含 0.75 M NaCl 和 0.1 M CH3COONa pH 4。这可以通过手动添加，也可以使用第 2.2.10 至 2.2.12 节中描述的储层室和泵送系统。 将温度设置为 2.2.3 节和 2.2.4 节中解释的 295 K，并显示在图像 8 中。在初始条件下，透析室和储层之间的平衡将在大约90分钟后达到，第一个可见的核将在22小时后出现。 允许晶体生长，直到观察到晶体大小不再明显变化（图9，面板1）。注：为了确定原子核时间并测量晶体大小的变化，每 15 或 20 分钟记录一次图像，NB 图像部分每小时分别记录 4 或 3 张图像 。对于蛋白质去自然、聚集和沉淀或晶体溶解或核化的 现场 观察，通常需要几秒钟到几十分钟。然而，对于晶体生长，这个范围在几分钟到几个小时之间。 三天后，将温度降低到291K，以重新启动晶体生长。保持温度恒定，让晶体发育（图9，面板2）。对于实验的这个阶段，每2小时记录一次图像，每10到12小时检查一次晶体大小的任何变化。如果观察到晶体大小没有变化，实验可以继续进行。注：根据结晶溶液中的蛋白质和沉淀物浓度以及所使用的蛋白质量，达到每个步骤的平衡所需的时间可能会有所不同。 将温度降低到288K以重新启动晶体生长。在此处介绍的案例的实验条件下，一天就足以达到平衡（图9，面板3）。 检查晶体的大小，并保持恒定的温度，只要晶体继续生长。 4天后，将温度降低到275K，以重新启动晶体生长（图9，面板4）。–在所展示的案例的实验条件下，大约10天后，将获得一个尺寸为500μm的晶体（图9）。 控制晶体尺寸 准备蛋白质溶液和温度控制的流动储层透析，如第 2.3.1 节和第 2.3.2 节所述。 使用 0.9 M NaCl 和 0.1 M CH3COONa pH 4 准备结晶解决方案。 将温度设置为 291 K，并允许晶体生长。在初始条件下，第一个核事件将在大约一小时后开始，许多晶体将在透析室中生长三个小时（图10，步骤：1和2）。每 20 分钟记录一次图像，以检查晶体在生长过程中的大小。注：晶体条件的优化对于控制生成晶体的大部分最终特性至关重要。结晶溶液的温度和化学成分可以改为溶解和重新生长均匀大小的晶体。还应指出，在这样的实验中不消耗蛋白质样本，因为只要样品不变自然，就可以逆转以重新溶解样品的条件。通过改变温度和保持恒定的化学成分溶解晶体时，请继续以下实验： 一旦晶体以291K的速度生长，这些晶体就可以溶解，以重新生长更少、更大的晶体。温度逐渐升高超过20分钟，达到313K。溶解透析室内的所有晶体大约需要一个小时（图10，步骤：3-5）。每 5 到 15 分钟记录一次图像，以监控解散过程。注意：许多蛋白质对高温很敏感。请务必在蛋白质稳定的温度范围内工作，以避免任何损伤/自然。除了蛋白质溶解性，温度也影响缓冲液。例如，缓冲器的 pH 度会随着温度的变化而变化，尤其是在 Tris 缓冲区。在这种情况下，根据实验进行18的温度设置 pH 至关重要。还应指出，与蛋白质晶体生长（从几个小时到几天）相比，蛋白质溶解所需的时间（从几分钟到几个小时）要少得多。一般来说，在晶体溶解期间，温度逐渐缓慢上升（尊重总溶解时间短），主要是在晶体部分溶解的情况下，以避免晶体马赛克的增加。当晶体生长时，温度会迅速（在不到一分钟内）降低到设定的温度（尊重漫长的总生长时间）。通过记录图像定期监测结晶室是可取的，以防止对蛋白质的损害，并帮助确定每个研究的蛋白质的晶体溶解或生长的最佳时间。 在所有的晶体溶解后，将温度设置为295K，以启动第二个核事件（图10，步骤：6，7）。每5分钟记录一次图像，以监控第二次核过程。在此步骤中，第一个核在大约 18 分钟后出现。注：在此温度下，溶液将位于可转移区域附近的核区。因此，只有少数核会出现在结晶室中。 继续实验，重复第 2.3 节中描述的用于生长较大晶体的优化工作流程。 图 10 中表示的实验的总持续时间只有几天。注：如果在原子核阶段，晶体在不同时间出现，则不同尺寸的晶体在结晶室中获得。在这种情况下，温度的升高（在具有直接溶解性的蛋白质的情况下）将导致更小的晶体更快地溶解。根据动能成熟效果，额外的蛋白质（从溶解中获得）可用于较大的晶体的生长。通过改变结晶溶液的化学成分在恒温下溶解晶体时，请继续以下实验：在实验中改变结晶溶液的化学成分，以在新的条件下重新生长一定大小的晶体，也有可能溶解以前生长的晶体。 准备蛋白质溶液（2.3.1）、温度控制的流动储层透析设置（2.1）和结晶溶液（2.4.2），如上文所述。在远离可转移区域的核区的初始条件下，许多小晶体将出现在结晶室中并开始生长（图11，步骤：1，2）。 三个小时后，当许多中型晶体在结晶室（图11，步骤：3）中可见时，逐渐降低NaCl浓度（0.9M），达到零。为此，准备一个新的结晶溶液，仅包含缓冲液与0.1M CH3COONa pH 4。使用抽水系统与储层室中的结晶溶液交换。按照步骤 2.2.10 到 2.2.12 准备和注入新的解决方案到储层室。有了这个新的解决方案，当解决方案交换时，NaCl浓度在储藏室中降低，直到储层室中的最终解决方案包含不超过0.1M的CH3COONa pH 4和没有NaCl。每 10 分钟拍摄一次图像，以记录解散过程。 让晶体完全溶解（图11，步骤：4，5）。这个实验的解散时间大约是两个小时。如前所述，溶解时间取决于所使用的蛋白质系统、结晶条件和透析室体积。在实验期间定期观察结晶室（见 显微镜 部分）并记录图像和笔记至关重要。 当腔室内的所有晶体溶解时（图 11，步骤：5），再次使用抽水系统准备新的结晶溶液，将 NaCl 的浓度低于前一个晶体（0.75 M NaCl 在 0.1 M CH3COONa pH 4 中）。 将新溶液注入储层室（图 11，步骤：6，7），并重复第 2.3 节中描述的结晶生长优化工作流程。将产生一个更大的晶体的均匀种群。 图 11 中显示的结果是在几天后得出的。