中性子高分子結晶学における結晶成長の最適化

1. マイクロ透析ボタン付き透析法 サンプル準備 30mgのニワトリ卵白溶解酵素を1mLのCH3クーナバッファー(100mM酢酸ナトリウム、pH4)に凍結乾燥粉末として溶解してタンパク質溶液を調製し、30mg・mL-1の最終濃度の溶液を得た。 13,000×gでサンプルを277Kで10分間遠心する。このプロセスは、結晶化プロセスを開始する前に、凝集体を除去するのに役立ちます。 280 nmでサンプルの吸光度を確認し、ビール・ランバート方程式(A=εcl)を使用してタンパク質濃度を計算します。注:ビール・ランバート方程式によると、電子吸光度(A)は、一定の光路長(l,cm)を与えられた吸収種の濃度(c,mg·mL-1)に直接比例する。この線形関係の勾配は、モルの絶滅係数(ε、280 nmのリソチームは2.64mL·mg−1・cm−1)19である。芳香族アミノ酸の側鎖(チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン)とシステイン残基間のジスルフィド結合は、分光学的に許容されるπから生じる〜280 nmで強い吸光度を有する – π*遷移。タンパク質の大部分がこれらの残基を含むので、タンパク質濃度は、通常、280nmで吸光度を測定することによって容易に計算することができる、絶滅係数の知識を与えられる。 図 4に示すように、結晶化液を準備します。結晶化溶液を準備する前に、0.22 μm ミリポアフィルターですべてのストックソリューションをフィルター処理します。 結晶成長 適切な分子量カットオフ(6-8 kDa)でセルロース透析膜を切断し、蒸留水に浸します。注:透析膜ディスクは、マイクロ透析ボタンのために市販されていますが、透析チューブを使用している場合は、単層膜のみを持つチューブから膜の2つの層を分離するためにエッジをカットすることを忘れないでください。 図 4 に示す 2 mL の結晶化溶液で 24 ウェル トレイのウェルを充填します。注:より大きなボリュームのボタン(例えば、200 μL)を使用する場合は、50 mLのチューブに5mL以上の結晶化液を充填して、効率的な交換を行います。 図5Aに示すように、マイクロ透析ボタンのチャンバーにリソザイム溶液のピペット35 μLを追加します。注:30 μL透析ボタンを閉じるときに気泡が形成されないようにするには、5 μLの余分な容量(デッドボリューム)を追加する必要があります。この追加のタンパク質サンプルは、空気泡の形成を防ぐ 図5Bに示すように、チャンバの上にわずかにドーム状の形状を作成します。 適切なサイズのアプリケータを取り、弾性Oリングをその先端に置きます(図5C)。その後、透析ボタンのチャンバーの上に、繊維のない紙を使用して軽く拭き取られた/排水された膜を置きます。紙を塗布する際は、チャンバーにほこりを入れないように注意してください。弾性Oリングをアプリケータから透析ボタンの溝に移すことで、透析膜を所定の位置に設定します(図5C)。注:取り扱いの重要な瞬間は、アプリケータから透析ボタンの溝に弾性Oリングを転送することによって、チャンバーの上に透析膜を固定しています。すべての動きは、タンパク質チャンバー内のサンプルで気泡を囲むのを避けるために完全に同期する必要があります。適用前に弾性Oリングを伸ばして剛性を知り、ピンセットを使用して膜の一部を保持し、モデルタンパク質を用いて最初の試験実験を行う練習を行うと便利です。 ボタンをピンセットを使用してウェルまたは50 mLチューブに移します(図5D)。 ウェルをカバースリップで覆い、グリースを軽く押してウェルを密封します(図5E)。注:井戸の上にグリースがない場合は、実験を開始する前にこれを追加するか、ガラスカバースリップの代わりにテープを使用してください。マイクロ透析ボタンを使用したタンパク質結晶化の原理を 図5に示します。 試料を293Kで保ち、熱調節インキュベーターに入ります。使用するタンパク質および結晶化条件に応じて、異なる温度が必要な場合があります。注: 図4 に示す結晶化条件の同じグリッド(沈殿剤の濃度を変化させることができます)は、温度の関数としてスクリーニングすることができます。このような場合、同じ結晶板を再生する必要があり、各コピーは異なる温度で調節インキュベーターに配置する必要があります。これには、いくつかの振動を含まない耐熱制御インキュベーターが必要です。 トレイまたはチューブに結晶がないか確認し(図4)、定期的にノートを取り、通常は毎日、各トレイに何があるかを区別します。良いノートは、偽陽性の結果を避け、結晶からほこりを区別するために不可欠です。 2. オプティクライを用いた結晶成長過程 サンプル準備 1.1項に記載されているように、タンパク質溶液と透析膜を調製する。 NaCl(4 M)およびCH3COONa pH 4(1 M)のストック溶液を準備し、50 mLチューブにフィルターします。 温度制御流動リザーバ透析セットアップの透析チャンバーにタンパク質溶液(30 mg·mL -1のリソチームの15μL)を加えます。温度制御流動貯留層透析の設定の詳細については 、図6 を参照してください。OptiCrysは2つの透析室を有し、最小容積は15 μL、最大容積は250 μLである。 透析膜で室内を覆い、弾性Oリングで膜を固定します(図6B)。注:この設定は、各チャンバーが透析膜によって直接密封されているマイクロ透析ボタンとは異なります。フローセルでは、透析膜は、その除去なしに結晶の実装を可能にする室内に固定されている代わりに。この目的のために、オーバーチャンバーは単に貯蔵所からねじ込むことができる。 オーバーチャンバーをフリップし、透析チャンバーの上に置きます。ゆっくりと静かに押して、2つの部分の間に閉じ込められた空気をすべて取り除き、チャンバー内の泡を避けます(図6C)。モデルタンパク質を用いて練習することは、気泡やサンプル損失を避けるために訓練するときに有利です。 オーバーチャンバーの上にそっとねじ込んで、その位置に貯水池を固定し、再び気泡をトラップしないように注意してください。リザーバの過剰締めは、結晶化チャンバー内に泡を形成することもできる(図6D)。 結晶化液を加え、気密性の高いキャップでリザーバチャンバーを覆います。(図6G)貯蔵所の最大容積は1mLである。 このアセンブリを転送し、真鍮サポートに挿入します。このサポートは温度を制御するために使用されるペルチェ要素と接触している。 図6に示すように、気密性キャップには透析チャンバの上部照明を可能にする光学窓が装備されています。窓の上に光源(図2)を置き、室内を光が通過できるようにします。 貯蔵室は連続流れの細胞として機能することを可能にするポンプに接続することができる。 図 7に示すように、ストックソリューションと蒸留水を含む 50 mL チューブの上にチューブをロータリーバルブに接続します。注: 自動調製と結晶化液の変更が実験中に望ましくない場合は、ステップ 2.1.10 を省略してください。このような場合、結晶化溶液を調製し、貯蔵所を手動で事前充填する必要があります。 ソフトウェア コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアクロワッサンクリスタリンを起動 [クリスタル成長].この制御ソフトウェアはLabVIEW(http://www.ni.com/labview/)で書かれ、使いやすいグラフィカルインタフェースを提供します。4つの異なるグラフィカルインタフェース(アキュエイ[ようこそ]、パラメトラージ[設定]、エッサイ[テスト]、およびメンテナンス[メンテナンス])が含まれています(図8)。注: フランス語からの翻訳は括弧内にあります。 図 8に示すように、ボタンをクリックしてメンテナンスビューを選択します。このビューは現在最もよく使用され、実験中に大部分のパラメータを制御できます。注: メンテナンス ビューをクリックすると、温度や光などのパラメータを制御するための別のセクションを持つ新しいウィンドウが表示されます。 図 8 では、このビューの異なる部分が矢印とフレームで示されています。次の手順では、ソフトウェアを使用して各パラメータがどのように制御されているかを示します。 レグラトゥール・ド・テンペラチュア[温度コントローラ]セクションは、温度の制御と監視を可能にします。図 8 のボタンをクリックし、1をオンにします。 注: OptiCrys の温度範囲は 233.0 – 353.0 ± 0.1 K. 荷受人[設定点]セクションの温度を設定し、Enterキーを押します(図8(2))。このボタンの下には、2つのトレース(赤と黄色)のグラフがあります。赤のトレースは最終(順序付き)温度を示し、黄色のトレースは現在の温度を示します。図8(2)に示すように、温度は20°Cに設定されています。注:結晶成長セクションで説明されているように、結晶を成長させるためには、多くの温度を選択する必要があります。温度を変更するには、 荷受人[setpoint] セクションに新しい温度を追加し、キーボードのEnterボタンを押します。 図8のルミエール[ライト]セクションの明るさを上げることで、ライトをオンにします。光度の範囲は0から100まで、”0″は、光がオフであり、「100」で、光が最大の強度と明るさに設定されていることを示します。光を増やすことによって、顕微鏡セクションでは、透析室の内部を見ることができる。実験中、細胞の明るさは変化する可能性があります。透析チャンバ内を明確に視覚化するためにパラメータを調整してください。拡大は、より良い表示のために「ズーム」の前にある+ボタンと-ボタンを使用して、増減することができます。 顕微鏡セクションの右側には、各結晶化実験に関連する情報を保存するためのセクションがいくつかあります。各ユーザは、使用する透析膜の結晶化条件、タンパク質名および分子量カットオフに関する情報を格納するフォルダを作成することができる(図8(3))。 ユーザーは 、単にノムドシエ [フォルダ名]に入力するだけで、実験の名前を定義できます。 ドシエ[フォルダ]を クリックすると( 図8に緑色のフレームで表示)、新しいウィンドウが開きます。このウィンドウには、実験に定義されているすべての情報を含むテキスト ファイルが表示されます。さらに、タイムスタンプ付きの画像は、将来の処理のためにこのフォルダに保存されます。 [NB イメージ]セクションで、実験中に撮影するイメージの数を選択します。右側のパネルの画像の数と、これらの間の希望する時間間隔(例えば、分、時、日)を指定します。図 8は、1 分間にゼロイメージを記録するソフトウェアセットアップを示しています。注:ストック溶液を混合し、貯蔵室に結晶化溶液を注入するために ポンペ[ポンプ] セクションを使用してください。流体混合システムの原理については、セクション2.1.10および 図7 を参照してください。 Etape 1[ステップ1]:ソリューションの在庫における在庫液の入力濃度。次のセクションでの結晶化実験では、NaCl 4 MとCH3クーナ1 MPH4を使用します。注: ストック溶液の濃度は、モル単位で行います。 各溶液の最終濃度を定義します。例えば、NaCl の場合は 0.75 M、CH3COONa pH 4 の場合は 0.1 M です。Etape 2[ステップ2]:溶液アプレパラー[準備する溶液]の最終濃度セクション(図8)にこれらを入力します。図 8に赤い枠で表示されている計算 [計算]ボタンを押します。混合に使用される各ストック溶液の最終容積は、各濃度パネルの前のボリュームパネルに表示されます。 ランサープレパレーション[打ち上げ準備]ボタンを押します(図8)。図7に示すように、ロータリーバルブは各ストック溶液を取り出し、スイッチを介して混合管に注入します。 結晶化液を調製した後、Etape 3[ステップ3]:ポンプセクションのアントレ溶液[溶液エントリ]ボタンをクリックします(図8の黄色のフレーム)。スイッチは、混合チューブからリザーバーチャンバーに新しい結晶化溶液を注入するように変更します。交換処理を中止するには、Arrêt分布[配布停止]ボタンを押下します。注: 実験中に結晶化プロセスを観察し、監督ソフトウェアの対応するグラフィカルインターフェイスで温度、結晶化溶液、ズームなどのパラメータを変更します。ソフトウェアを使用することで、実験中に気密キャップやフローセルを取り外す必要がないため、ユーザーがソフトウェアを通じて変更する変数のみが表示されます。 大きな結晶成長 透析チャンバーに30 mg·mL-1の濃度でリソザイムの15 μLを加える(図6A)。注: セクション 1.1 に記述されているように、タンパク質サンプルを準備します。 温度制御流動貯留水槽透析セットアップを、セクション2.1および 図6に記載されているように組み立てます。 結晶化液を準備します。0.22 μmフィルターを使用してサンプル調製前にすべてのストックソリューションをフィルタリングすることを忘れないでください。この実験のために、結晶化液は0.75 M NaClおよび0.1 M CH3COONa pH 4を含んでいる。これは手動で加えることができるか、セクション2.2.10から2.2.12に記述されているように貯蔵室およびポンプシステムを使用して。 2.2.3 および 2.2.4 のセクションで説明した温度を 295 K に設定し、図 8 に示します。初期条件下では、約90分後に透析チャンバーとリザーバの間の平衡が得られ、22時間後に最初の可視核が現れます。 結晶のサイズが目に見えない変化が見られないまで結晶が成長することを許可します(図9、パネル1)。注:核生成時間を決定し、結晶のサイズの変動を測定するために 、NB画像 セクションで1時間あたり4または3の画像である15または20分ごとに画像を記録します。タンパク質変性の 所見 では、凝集および沈殿または結晶溶解または核化のために、典型的には数秒から数十分の間が必要である。しかし、結晶成長のために、この範囲は数分から数時間の間である。 3日後、温度を291Kに下げて結晶成長を再開します。温度を一定に保ち、結晶を発達させます(図9、パネル2)。実験のこの段階では、2時間ごとに画像を記録し、結晶のサイズの変化がないか10〜12時間ごとに確認するだけで十分です。結晶の大きさの変化が見られない場合に実験を継続することができる。注:結晶化溶液中のタンパク質と沈殿物濃度、使用されるタンパク質の量によって、各ステップの平衡に達するまでにかかる時間は異なる場合があります。 結晶成長を再開するには、温度を288 Kに下げます。ここで提示した場合の実験条件では、ある日で平衡に達するのに十分である(図9、パネル3)。 結晶の大きさを確認し、結晶が成長し続ける限り一定の温度を維持します。 4日後、結晶成長を再開するために温度を275Kに下げる(図9、パネル4)。– 提示された場合の実験条件では、1次元で500μmの結晶が約10日後に得られる(図9)。 結晶サイズの制御 タンパク質溶液と温度制御流動リザーバ透析を、セクション 2.3.1 および 2.3.2 に記載されているように準備します。 0.9 M NaClおよび0.1 M CH3COONa pH 4で結晶化液を準備する。 温度を291Kに設定し、結晶を成長させます。初期条件下では、最初の核生成イベントは約1時間後に開始され、多数の結晶が透析室で3時間成長します(図10、ステップ:1と2)。20分ごとに画像を記録し、成長過程で結晶の大きさを確認します。注: 結晶化条件の最適化は、生成された結晶の最終的な特性の大部分を制御する上で重要です。結晶化液の温度と化学組成は、均一なサイズの結晶を溶解し、再成長するように変更することができます。また、タンパク質サンプルは、変性しない限り試料を再溶解する条件として、このような実験では消費されないことに留意すべきである。温度を変えて一定の化学組成を維持して結晶を溶解する場合は、次のように実験を続けます。 結晶が291Kで成長したら、これらはより少なく、より大きな結晶を再成長させるために溶解することができます。20分を超えて徐々に温度を上げ、313 K に達します。透析チャンバー内のすべての結晶を溶解するのに約1時間かかります(図10、ステップ:3-5)。画像を5~15分ごとに記録して、溶解プロセスを監視します。注: 多くのタンパク質は高温に敏感です。タンパク質が安定している温度範囲内で動作し、損傷/変性を避けてください。タンパク質の溶解性に加えて、温度も緩衝液に影響を与える。例えば、バッファーの pH は温度、特に Tris バッファーで変化する可能性があります。このような場合、実験が行われる温度に応じてpHを設定することが重要である18.また、タンパク質の溶解は、タンパク質の結晶成長(数時間から数日)に比べて、かなり少ない時間(数分から数時間)を要することにも留意すべきである。一般に、結晶の溶解の間、温度は徐々にゆっくりと(短い全溶解時間を尊重する)、結晶モザイクの増加を避けるために結晶の部分的な溶解の場合を中心にする。結晶が成長しているとき、温度は設定温度(長い総成長時間を考慮して)に素早く(1分未満)低下する可能性があります。記録画像による結晶化チャンバの定期的なモニタリングは、タンパク質の損傷を防ぎ、研究した各タンパク質の結晶の溶解または成長に最適な時間を定義するのに役立ちます。 すべての結晶が溶解した後、2番目の核生成イベントを開始するために温度を295 Kに設定します(図10、ステップ:6,7)。画像を5分ごとに記録して、2番目の核生成プロセスを監視します。このステップでは、最初の核は約18分後に現れる。注: この温度では、溶液は核形成ゾーン、メタスタブルゾーンの近くにあります。その結果、結晶化チャンバにほんの数個の核しか現れなくなる。 より大きな結晶を成長させる場合は、セクション2.3で説明した最適化ワークフローを繰り返して実験を続けます。 図10 に示される実験の全期間は数日に過ぎない。注:核形成段階で結晶が異なる時期に現れる場合、結晶化チャンバ内で異なるサイズの結晶が得られます。このような場合、温度の上昇(直接溶解性を有するタンパク質の場合)は、より小さい結晶の迅速な溶解をもたらす。キネティック熟成効果に応じて、余分なタンパク質(溶解から得られる)は、より大きな結晶の成長に使用することができます。結晶化液の化学組成を変えて一定温度で結晶を溶解する場合は、次のように実験を続けます。また、実験中に結晶化液の化学組成を変化させて、新たな条件下で均一な大きさの結晶の集団を再成長させることにより、以前に成長した結晶を溶解させることも可能である。 上記のように、タンパク質溶液(2.3.1)、温度制御流動透析セットアップ(2.1)および結晶化溶液(2.4.2)を調製します。核形成ゾーンの初期条件下では、結晶化槽に多数の小結晶が現れ、成長し始めます(図11、ステップ:1、2)。 3時間後、結晶化チャンバーに多くの中結晶が見える場合(図11、工程:3)、NaCl濃度(0.9M)を徐々に低下させてゼロに達する。このために、0.1 M CH3COONa pH4で緩衝溶液のみを含む新しい結晶化溶液を調製する。ポンプシステムを使用して、リザーバーチャンバー内の結晶化液と交換します。新しい溶液を貯留槽室に注入するためのステップ2.2.10から2.2.12に従ってください。この新しい溶液により、溶液が交換されると、貯蔵室の最終的な溶液がCH3COONa pH 4の0.1 M以下を含み、NaClが含まれなくなるまで、チャンバー内でNaCl濃度が低下する。10分ごとに画像をキャプチャして、溶解プロセスを記録します。 結晶が完全に溶解することを許可します(図11、ステップ:4,5)。この実験では溶解時間は約2時間です。前述のように、溶解時間は、使用されるタンパク質系、結晶化条件、および透析チャンバ体積に依存する。結晶化チャンバー( 顕微鏡 セクション参照)の定期的な観察と、実験中の画像やメモの記録は不可欠です。 チャンバー内のすべての結晶が溶解されたら(図11、ステップ:5)、再度ポンプシステムを使用して、前のものよりも低い濃度でNaClを注入することによって新しい結晶化液を調製する(0.1 M CH3COONa pH4)。 新しい溶液をリザーバーチャンバーに注入し(図11、ステップ:6,7)、結晶成長最適化ワークフローを繰り返します( 2.3.より大きな結晶の均一な集団が生成されます。 図11 に示す結果は、数日後に得られた。