Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Транскрипция и трансляция генов являются двумя основными процессами, участвующими в центральной догме биологии, идущими от последовательности ДНК к РНК и белку^1. В этом исследовании мы фокусируемся на производстве матричной РНК (мРНК) во время транскрипции. Зарождающаяся молекула РНК включает в себя как некодирующие интроны, так и кодирующие экзоны. Интроны совместно транскрипционно сращиваются до того, как мРНК перемещается в цитоплазму для трансляции на рибосомах^2,3.

Традиционно измерение мРНК выполняется в объемных популяциях клеток (от сотен до миллионов) с помощью классических анализов, таких как RT-qPCR или Северное пятно. Несмотря на высокую мощность, эти методы ограничены, поскольку они не дают представления о вариации между клетками (фенотипическая гетерогенность), идентификации числа транскрипционно активных аллелей и, что, возможно, более важно, недостатке пространственной информации. Совсем недавно геномные технологии, позволяющие секвенировать одноклеточную РНК (RNAseq), начали преодолевать разрыв между методами визуализации и секвенированием^4. Однако RNAseq страдает от относительно низкой эффективности обнаружения, и этапы обработки приводят к полной потере пространственной информации^5. Хотя одноклеточный RNAseq может дать представление о фенотипической гетерогенности среди популяции изогенных клеток, флуоресценция РНК in situ гибридизация (RNA-FISH) может способствовать более полному исследованию экспрессии генов-мишеней на пространственном уровне и на аллельно-аллельной^{основе 6,7.}

РНК FISH – это метод, который позволяет обнаруживать и локализовать молекулы-мишени РНК в фиксированных клетках. В отличие от более ранних, трудоемких методов, современные современные РНК-FISH используют коммерчески доступные зонды нуклеиновых кислот, которые дополняют целевые последовательности РНК, и эти зонды гибридизуются со своими целями путем спаривания оснований Уотсона-Крика^8. Ранние методы гибридизации in situ включали аналогичный протокол, установленный Галлом и Пардью в 1969 году, когда образец обрабатывался зондами нуклеиновых кислот, которые специфически гибридизировались с целевой РНК^9. Первоначально анализ проводился с использованием радиоактивного или колориметрического обнаружения; однако в 1980-х годах разработка протоколов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) к ДНК FISH и более поздним РНК FISH открыла путь к более чувствительному обнаружению и потенциалу мультиплексирования^10,11.

Дальнейшие разработки в области РНК FISH привели к способности обнаруживать и количественно определять отдельные молекулы РНК (smFISH)^12,13. Прямое обнаружение — это метод, при котором сами зонды маркируются флуорофорами. Проблема с smFISH заключается в том, что существует потребность в достаточном количестве гибридизирующих зондов/мишеней для облегчения обнаружения флуоресцентных сигналов в виде отдельных, ограниченных дифракцией пятен. Для решения этой проблемы можно использовать зондовый набор коротких одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК, комплементарных различным областям целевой РНК^8,12,14. Связывание нескольких зондов увеличивает локальную плотность флуорофора, делая РНК видимой как отдельное пятно высокой интенсивности с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод является преимуществом, поскольку внецелевое связывание олигонуклеотидов в пуле зондовых наборов может быть отличимо от истинного сигнала пятна РНК путем количественного анализа размера и интенсивности пятна для дифференциации истинного сигнала и ложного связывания олигонуклеотидов, что облегчает более точный анализ за счет снижения ложных срабатываний^12.

Альтернативными методами обнаружения мРНК являются классический метод трансляции ника на основе клонов BAC и недавно разработанная разветвленная система ДНК. В методе BAC-клонированной трансляции ника ДНК, которая должна быть помечена, ферментарно проклинируется, и новый нуклеотид добавляется к экспонированной 3′-концу. К активности ДНК-полимеразы I добавляет меченый нуклеотид, в результате чего получается нужный зонд^15,16. Метод разветвленная ДНК включает в себя олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются парами с мишенями РНК, и эти зонды усиливаются с использованием нескольких молекул амплификации сигнала. Этот метод может значительно улучшить отношение сигнал/шум, но усиление может исказить точное количественное определение, поскольку флуоресцентные пятна могут сильно различаться по размеру и интенсивности^17.

В качестве модельной системы для этого протокола, которая полностью используется в рамках участия в исследовательской программе NIEHS Superfund для количественной оценки воздействия химических веществ, разрушающих эндокринную систему, в судоходном канале Галвестон-Бей / Хьюстон, мы использовали эстрогенный рецептор (ER) положительный клеточный ряд рака молочной железы MCF-7, обработанный в течение ночи агонистом ER, 17β-эстрадиолом (E2)^7,18,19. E2 регулирует многие гены ER-мишени, включая прототипный ген ER-мишени, GREB1^7,20,21,22. Протокол smFISH, описанный здесь, использует набор из двух спектрально разделенных наборов зондов, нацеленных на GREB1; один из них гибридизуется с экзонами, а другой с интронами, что позволяет измерять как зрелую, так и зарождающуюся РНК^7. Затем мы используем эпифлуоресцентную микроскопию в сочетании с деконволюцией для изображения образцов, помеченных smFISH, а затем применяем процедуры анализа изображений для количественной оценки количества активных аллелей и зрелых РНК на клетку.