تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH
Summary
جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH) هو وسيلة لتحديد مستويات بدقة وتوطين الحمض النووي الريبي محددة على مستوى الخلية الواحدة. هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات المختبر المعتمدة لدينا لمعالجة مقاعد البدلاء الرطبة والتصوير وتحليل الصور للقياس الكمي لخلايا واحدة من RNAs محددة.
Abstract
النسخ الجيني هو عملية أساسية في بيولوجيا الخلايا، ويسمح للخلايا بتفسير الإشارات الداخلية والخارجية والاستجابة لها. تفتقر الطرق السكانية السائبة التقليدية (البقعة الشمالية، PCR، وRNAseq) التي تقيس مستويات الحمض النووي الريبي إلى القدرة على توفير معلومات عن الاختلاف بين الخلايا في الاستجابات. خلية واحدة دقيقة والتصور allelic والتحديد الكمي ممكن عن طريق جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH). يتم تنفيذ RNA-FISH عن طريق تهجين الحمض النووي الريبي المستهدف مع مسابير أوليغونوكليوتيد المسماة. ويمكن تصوير هذه الأساليب في طرائق متوسطة/عالية الإنتاجية، ومن خلال خطوط أنابيب تحليل الصور، توفر بيانات كمية عن كل من الرنانات الناضجة والناضجة، وكلها على مستوى الخلية الواحدة. وقد تم تحسين التثبيت، permeabilization، التهجين وخطوات التصوير في المختبر على مدى سنوات عديدة باستخدام نظام النموذج الموصوف هنا، مما يؤدي إلى تحليل خلية واحدة ناجحة وقوية من وسم سمك البحر المتوسط. الهدف الرئيسي مع إعداد العينات ومعالجتها هو إنتاج صور عالية الجودة تتميز بنسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء للحد من الإيجابيات الكاذبة وتوفير بيانات أكثر دقة. هنا، نقدم بروتوكول يصف خط الأنابيب من إعداد العينات إلى تحليل البيانات بالتزامن مع الاقتراحات وخطوات التحسين لتكييفها مع عينات محددة.
Introduction
النسخ الجيني والترجمة هما عمليتان رئيسيتان تشاركان في العقيدة المركزية لعلم الأحياء ، من تسلسل الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي إلى البروتين1. في هذه الدراسة، ونحن نركز على إنتاج الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) أثناء النسخ. جزيء الحمض النووي الريبي الوليدة يتضمن كل من introns غير الترميز وإكسونات الترميز. Introns هي مقسمة نسخا قبل أن ينتقل إلى الخلايا مرنا للترجمة على ريبوسوم2,3.
تقليديا، يتم إجراء قياس الحمض النووي الريبي في مجموعات كبيرة من الخلايا (مئات إلى ملايين) مع المقايسات الكلاسيكية مثل RT-qPCR أو النشاف الشمالي. في حين قوية جدا، وهذه الأساليب محدودة لأنها لا توفر رؤى في الاختلاف من خلية إلى خلية (التغايرية الظاهري)، وتحديد عدد الأليل النشطة نسخيا، وربما الأهم من ذلك، تفتقر إلى المعلومات المكانية. وفي الآونة الأخيرة، بدأت تقنيات الجينوم واسعة تسمح لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (RNAseq) لسد الفجوة بين أساليب التصوير والتسلسل4. ومع ذلك، يعاني RNAseq من كفاءات الكشف منخفضة نسبيا وخطوات المعالجة تؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية5. على الرغم من أن RNAseq خلية واحدة يمكن أن توفر رؤى في التغايرية phenotypic بين مجموعة من الخلايا متساوية المنشأ، RNA مضان في التهجين الموقعي (RNA-FISH) يمكن أن تسهل استكشاف أكثر اكتمالا للتعبير الجيني الهدف على المستوى المكاني، وعلى أساس أليل من قبل أليل6،7.
RNA FISH هي تقنية تسمح باكتشاف وتوطين جزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة في الخلايا الثابتة. وخلافا لأساليب سابقة شاقة، الحالية للدولة من بين الفن الجيش الملكي النيبالي-FISH يستخدم مسابير الحمض النووي المتاحة تجاريا التي هي مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي الهدف، وهذه المسابير تهجين لأهدافها من قبل قاعدة واتسون كريك الاقتران8. وشملت تقنيات التهجين في وقت مبكر في الموقع بروتوكول مماثل أنشأته غال وPardue في عام 1969، كما تم تجهيز عينة مع مسابير الحمض النووي التي هجينت على وجه التحديد إلى هدف الجيش الملكي النيبالي9. في الأصل تم إجراء الفحص باستخدام الكشف الإشعاعي أو colorimetric; ومع ذلك ، في 1980s ، وتطوير الفلورسينس في الموقع بروتوكولات التهجين (FISH) لسمك الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت لاحق الأسماك فتحت الطريق نحو الكشف أكثر حساسية ، واحتمال تعدد10،11.
وقد أدت التطورات الأخرى في RNA FISH إلى القدرة على الكشف عن وقياس جزيئات الحمض النووي الريبي واحد (smFISH)12،13. الكشف المباشر هو الطريقة التي يتم تسمية المسابير نفسها مع الفلوروفوريس. ويتمثل أحد التحديات التي تواجهها هذه الأسماك في أن هناك حاجة إلى ما يكفي من المسابير/الأهداف المهجنة لتيسير الكشف عن الإشارات الفلورية باعتبارها بقعا متميزة محدودة الحيود. لمعالجة هذه المسألة، يمكن للمرء استخدام مجموعة من التحقيق قصيرة وحيدة تقطعت بهم السبل Oligonucleotides الحمض النووي التكميلية لمختلف المناطق من RNA الهدف8،12،14. الربط بين مسابير متعددة يزيد من كثافة الفلوروفور المحلية، مما يجعل الحمض النووي الريبي مرئية كقعة متميزة، وكثافة عالية عن طريق المجهر الفلوري. هذه الطريقة مفيدة لأن الربط خارج الهدف من oligonucleotides في مجموعة التحقيق تجمع يمكن تمييزها عن إشارة بقعة الحمض النووي الريبي الحقيقي عن طريق تحليل كمي حجم بقعة وكثافة للتمييز بين إشارة حقيقية وملزمة oligonucleotide زائفة، وبالتالي تسهيل تحليل أكثر دقة عن طريق الحد من الإيجابيات كاذبة12.
طرق بديلة للكشف عن مرنا هي الكلاسيكية BAC استنساخ القائم على طريقة الترجمة ونظام الحمض النووي المتفرعة التي تم تطويرها مؤخرا. في BAC المستنسخة، طريقة الترجمة، والحمض النووي أن يكون المسمى هو انزيميا ويتم إضافة نيوكليوتيد جديدة إلى نهاية 3 ‘المكشوفة. نشاط بوليمرات الحمض النووي أضيف النيوكليوتيدات المسمى مما أدى إلى التحقيق المطلوب15،16. تقنية الحمض النووي المتفرعة ينطوي على مسابير أوليغونوكليوتيد التي تهجين في أزواج لأهداف الجيش الملكي النيبالي ويتم تضخيم هذه المسابير باستخدام جزيئات تضخيم إشارة متعددة. هذه الطريقة يمكن أن تحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن التضخيم يمكن أن ينحرف كمية دقيقة منذ البقع الفلورية يمكن أن تكون مختلفة بعنف في الحجم والكثافة17.
كنظام نموذجي لهذا البروتوكول، الذي يعمل بكامل العاملين كجزء من مشاركة برنامج أبحاث NIEHS Superfund لتحديد آثار المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء في خليج غالفستون / قناة هيوستن للسفن، استخدمنا مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) خط خلايا سرطان الثدي الإيجابي MCF-7 المعالجة بين عشية وضحاها مع ناهض ER، 17β-استراديول (E2)7،18،19. E2 ينظم العديد من الجينات المستهدفة ER، بما في ذلك الجين الأولي ER الهدف، GREB17،20،21،22. يستخدم بروتوكول smFISH الموصوف هنا مجموعة من مجموعتين مسابير مفصولتين طيفيا تستهدفان GREB1؛ واحد أن تهجين إلى exons والآخر إلى introns، مما يسمح لقياس كل من الجيش الملكي النيبالي ناضجة والناضجة7. ثم نستخدم المجهر epifluorescence مقرونة deconvolution لصورة smFISH المسمى عينات، ومن ثم تطبيق إجراءات تحليل الصور لتحديد عدد الأليل النشطة ورنا ناضجة لكل خلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستند منهجية smFISH الموصوفة إلى البروتوكولات المنشورة سابقا7و12و14. في هذا البروتوكول، نشرح الخطوات الحرجة التي تم تحسينها من المختبر الرطب (بما في ذلك كثافة البذر، ووقت التثبيت، والبيرمابيلية، وتركيز المسبار)، إلى التصوير وتحليل الصور، وت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل MAM و FS و MGM من قبل NIEHS (المشروع 4 ، P42ES027704 ، PI ، Rusyn). يتم دعم MAM و FS و RMM و MGM و PKS من قبل مركز دول مجلس التعاون الخليجي الممول من CPRIT للتنظير المتقدم والمعلوماتية بالصور (RP170719). كما يدعم التصوير من قبل الأساسية المجهر المتكاملة في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد القومية للصحة (DK56338، وCA125123)، CPRIT (RP150578)، ومركز دان ل. دنكان الشامل للسرطان، واتحاد جون س. دان ساحل الخليج لعلم الجينوم الكيميائي.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
Referenzen
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
