Implantation de pompes osmotiques et induction du stress pour établir un modèle de souris pharmacologique symptomatique pour la dystonie DYT/PARK-ATP1A3

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives internationales, nationales et/ou institutionnelles applicables en matière de soins et d’utilisation des animaux. Les autorités locales du Regierung von Unterfranken, würzburg, Allemagne, ont approuvé toutes les expériences animales. 1. Amorçage des pompes osmotiques REMARQUE : Cette étape doit être effectuée au moins 48 h avant la chirurgie. Les pompes osmotiques ALZET doivent être préremplies afin de s’assurer que le taux de pompage atteint un état stable avant l’implantation. Préparez la solution souhaitée pour la perfusion chronique à l’avance. Assurez-vous que le solvant et l’agent sont compatibles avec les pompes et les cathéters osmotiques. Pour le projet dans le présent, décongeler une solution de 10 x de stock d’ouabain (stockée à -20 °C) à température ambiante et vortex pendant 10 s.ATTENTION: Ouabain est toxique: il doit être manipulé uniquement avec des gants et ouvert uniquement sous une hotte stérile pour éviter l’inhalation. Allumez le capot stérile; désinfecter le capot ainsi que tous les instruments et matériaux nécessaires avant de les mettre sous le capot. Mettez des gants chirurgicaux avant de manipuler les pompes osmotiques. Préparer séparément la solution ouabain désignée pour les pompes du striatum et du cervelet.REMARQUE : Considérez que la concentration de la solution dans la pompe du striatum doit être doublée par rapport à la concentration de la solution dans la pompe désignée pour le cervelet. Cela est dû au fait que la pompe pour le striatum est reliée à une double canule, le débit, cependant, est le même que pour la pompe du cervelet, qui est relié à une seule canule. Calculez la quantité de solution nécessaire à l’aide de la formule suivante :taux de livraison de masse (ko) = taux de livraison en volume (Q) x concentration de l’agent dans le véhicule (Cd)Pour le présent projet, les pompes osmotiques ont été amorçées et remplies d’une solution ouabain à une concentration de 11,2 ng/h ou de 0,9% de solution saline pour le groupe témoin. Vortex à la fois des solutions ouabain pour 10 s et filtre stérile (c.-à-d. 0,22 μm filtre à l’extrémité de seringue) les dans séparés, nouveaux tubes microcentrifuge, à l’aide d’un filtre différent pour chaque solution. Peser les pompes osmotiques vides avec le modérateur de débit (environ 0,4 g). Remplissez une seringue de 1 mL d’une canule de remplissage de 27 G (de préférence avec une pointe émoussée) avec une solution ou solution de véhicule filtrée stérile. Sortez toutes les bulles d’air de la seringue, maintenez la pompe osmotique en position verticale, insérez la canule jusqu’à la pompe et remplissez lentement le réservoir jusqu’à ce que l’excès de solution apparaisse sur le dessus (évitez le remplissage rapide car cela peut conduire à des bulles d’air dans la pompe). Ensuite, insérez le modérateur d’écoulement dans la pompe (l’excès de solution doit apparaître sur le dessus). Retirez le modérateur de flux (environ 5 mm), retirez soigneusement la bride blanche avec des ciseaux et connectez un morceau de tubes en vinyle au modérateur de flux. Assurez-vous que le cathéter a une longueur d’environ 2 cm pour permettre une bonne mobilité de l’animal. Peser une fois de plus la pompe osmotique remplie pour s’assurer que la différence de poids entre la pompe remplie et la pompe vide est conforme au poids attendu de la solution chargée.REMARQUE : Pour la plupart des solutions aqueuses, ce poids est égal au volume des microlitres. Si le poids ne correspond pas au volume prévu, l’air peut être emprisonné à l’intérieur de la pompe, qui doit être vidée et rechargée. Pour l’amorçage des pompes, préparer deux tubes microcentrifuges de 2 mL, un tube pour le striatum et un pour le cervelet. Submergez les pompes dans les tubes microcentrifuge remplis à mi-chemin avec une solution saline de 0,9%. Ne submergez pas l’extrémité ouverte du cathéter. Placez les tubes de microcentrifuge dans un thermocycler pendant 48 h à 37 °C afin de s’assurer que la pompe a atteint un taux de pompage régulier avant l’implantation et que les cathéters sont préremplis. 2. Implantation de la canule et de la pompe osmotique Placer la souris (mâle, C57Bl/6N, 11-12 semaines) dans une chambre conçue pour l’anesthésie par inhalation; fixer le débit d’isoflurane à 2-3% et le débit d’oxygène à 2 L/min. Une fois que la souris est profondément anesthésiée selon les protocoles approuvés, raser le haut de la tête de l’animal, le cou dorsal et le tiers proximal du dos. Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique et continuez l’anesthésie avec isoflurane via un masque d’anesthésie de souris conçu pour l’instrument stéréotaxique (débit isoflurane 1,5-2%, 2 L/min d’oxygène). À l’aide d’embouts en caoutchouc ou de barres d’oreille non rompues, fixer la tête de l’animal dans le cadre stéréotaxique, en prenant soin que la tête soit nivelée. Afin de prévenir l’hypothermie, placez un coussin chauffant sous l’animal, insérez une sonde rectale et réglez la température à 37 °C. Protéger les yeux de l’animal contre le dessèchement en utilisant une goutte d’onguent ophtalmique sur chaque œil. Appliquer un analgésique, comme le carprofène (5 mg/kg de poids corporel), sous-cutanéement avant de commencer la chirurgie. Avec une seringue sous-cutanéement injecter jusqu’à 0,2 mL de bupivacaine 0,25% et attendre 30 s pour l’anesthésie locale à prendre effet. Désinfecter complètement les zones rasées à l’arme d’un antiseptique, comme le dihydrochlorure d’octénidine. Après une désinfection complète de la zone chirurgicale, utiliser un scalpel pour placer une incision au sommet de la tête et utiliser des ciseaux pour continuer l’incision jusqu’aux membres avant. Exposez le crâne à l’aide de pinces de bouledogue et essuyez le périoste à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton. Aligner soit un stylo, soit la pointe d’une canule tachée d’encre noire avec du bregma et utiliser les coordonnées appropriées pour marquer les trois points d’entrée des canules cérébrales sur le crâne (coordonnées pour les trous bilatéraux nécessaires à la perfusion des ganglions basaux: antérieur/postérieur: + 0,74 mm, médial/latéral: +/- 1,50 mm (+ indiquant le côté droit, – le côté gauche par rapport au bregma); coordonnées pour le trou à la ligne médiane du cervelet: antérieur/postérieur: – 6,90 mm). Ensuite, percer soigneusement les trous pour la double canule désignée pour les ganglions basaux et la canule unique désignée pour le cervelet (figure 1A). Percer un quatrième trou pour une petite vis entre le striatum et le cervelet. Cette vis sera éventuellement incorporée dans le ciment dentaire et fournira la cale supplémentaire pour les canules. À l’aide de forceps fins et d’un tournevis, introduisez soigneusement la vis dans le petit trou jusqu’à ce qu’elle soit fermement fixée dans le crâne. N’implantez pas la vis trop profondément car cela endommage le tissu cérébral.REMARQUE : Il est recommandé de poursuivre l’implantation de la pompe osmotique avant d’insérer les canules osmotiques. Cela évite de causer des dommages accidentels aux canules lors de l’implantation des pompes. Afin de créer une petite poche pour la pompe osmotique de chaque côté des animaux de retour, utiliser des forceps tissulaires pour séparer les couches de tissu sous-cutané. Avancez les forceps vers une jambe arrière et ouvrez légèrement les forceps afin d’élargir la poche sous-cutanée. Répétez la même procédure pour l’autre côté, d’abord enlever les forceps de l’incision, puis les pousser doucement vers la deuxième jambe arrière.REMARQUE : La poche devrait permettre à la pompe de glisser facilement, cependant, elle ne devrait pas avoir trop d’espace pour se déplacer sous la peau. Avec l’aide de forceps de tissu prendre la première pompe avec le morceau connecté de tubes et le glisser dans une poche sous-cutanée. Répétez la même procédure avec la deuxième pompe. À l’aide d’un support de minipompe, introduire une seule canule osmotique d’une longueur personnalisée de 3,0 mm dans le trou percé dans la ligne médiane du cervelet. Détachez soigneusement la tête de la canule et fixez la canule ainsi que la petite vis avec du ciment dentaire, en prenant soin de ne pas couvrir la pièce de raccordement pour le tube de la pompe osmotique. Assurez-vous que le ciment dentaire entourant la canule a complètement séché avant de poursuivre la chirurgie. Avant d’insérer une double canule d’une distance centrale à centre de 3,0 mm et d’une longueur sur mesure de 4,0 mm dans les trous forés bilatéralement au-dessus des ganglions basaux, attachez deux courts morceaux de tubes en vinyle (0,5 cm) aux deux pièces de raccordement de la double canule. Connectez les tubes en vinyle à un adaptateur de bifurcation et remplissez soigneusement l’ensemble du système de tubes, y compris l’adaptateur et la canule avec une solution ouabain ou un véhicule (température ambiante, stérile filtré à l’avance). Cela peut être fait mieux avec une seringue de 1 mL et une canule de remplissage de 27 G introduite dans l’extrémité arrière unique de l’adaptateur de bifurcation (Figure 1B). À l’aide d’un support de minipompe, insérez soigneusement la double canule dans les trous bilatéraux. Utilisez une pince pour détacher la tête de la canule et fixer la double canule avec du ciment dentaire. Connectez les cathéters des pompes osmotiques à l’adaptateur de bifurcation ainsi qu’à la canule unique, respectivement. Assurez-vous que les cathéters ont une forte emprise sur les morceaux de raccordement des canules.REMARQUE : Les deux pompes ont un débit égal, alors veillez à connecter la pompe osmotique à la solution double concentrée à l’adaptateur de bifurcation pour s’assurer que la même concentration atteint à la fois les ganglions basaux et le cervelet. Fermez l’incision sur le dos des animaux avec des points de suture dans la mesure du possible dans la direction du crâne, en prenant soin de ne pas surmener la peau (Figure 1C). Injecter sous-cutanéement 0,5 mL de saline de 0,9%, qui devrait avoir la température du corps, dans un pli de la peau de chaque côté de l’arrière des animaux afin d’éviter la déshydratation des souris, en évitant soigneusement les pompes. 3. Défi moteur Sujet des souris ouabain- ou véhicule-perfused à des tâches motrices difficiles comme une forme d’exposition légère de stress 4 h après la chirurgie et répétitivement tous les 24 h par la suite afin d’induire des mouvements dystonia-like. Cela n’inclut pas une caractérisation comportementale; son but est d’induire un niveau de stress plus élevé par rapport à l’élevage normal de cage. Placez la souris sur un poteau en bois à surface rugueuse de 50 cm d’un diamètre de 1 cm, le nez orienté vers le bas. Assurez-vous que le poteau est placé dans une grande cage avec suffisamment de literie en cas de chutes. Il n’est pas nécessaire de mesurer le temps de descente, mais de surveiller les hyperextensions involontaires des membres avant et des pattes postérieures présentées par les animaux ouabain-perfusés lors de la descente du pôle. Laissez les souris descendre le pôle trois fois et laisser 2 min de récupération entre les descentes.REMARQUE : Les souris perfusées d’Ouabain devraient présenter les premiers symptômes comme la bradykinésie 4 h après la chirurgie. Cependant, 24 h après la chirurgie des souris devraient commencer à présenter des hyperextensions involontaires des membres avant et des hindlimbs comme signe des mouvements dystonia-like pendant la descente. Pour la deuxième tâche motrice, placez les souris sur la tige tournante comme cela a été fait pour le test de performance Rotarod. L’appareil Rotarod n’est pas utilisé comme une mesure de la latence de tomber, le but est de soumettre les souris à l’activité forcée. Placez les souris sur la tige tournante trois fois et laissez 2 min de récupération entre les tests.REMARQUE : Pour augmenter l’exposition au stress, utilisez un appareil Rotarod qui accélère. Pour le projet décrit ci-après, la tige accélère de 5 à 50 tr/min sur une période de temps définie de 300 s. Laissez les animaux récupérer pendant 30 min entre le test de pôle et le test de performance rotarod et encore 30 minutes avant de marquer pour des mouvements semblables à la dystonie comme décrit dans l’étape 4 du protocole. Entre les expositions répétitives de stress, permettre aux souris de récupérer pendant 24 h-intervalles. 4. Systèmes de notation pour l’évaluation des mouvements semblables à la dystonie REMARQUE : L’expérimentateur doit être aveuglé par l’affectation de groupe analysée pour prévenir les biais. Les tests comportementaux utilisés pour caractériser le phénotype des souris sont deux systèmes de notation : une échelle de notation de dystonie marquant anormale, des mouvements de dystonie-comme et un score comportemental utilisant le test de suspension de queue. Évaluer les mouvements semblables à la dystonie après un temps de récupération de 30 min après l’exposition à un stress léger. Échelle d’évaluation dystonieNOTE : En raison de l’absence de tâches comportementales prédéfinies, l’échelle d’évaluation de la dystonie a été établie comme un système de notation basé sur les observateurs semblable aux échelles d’évaluation cliniques de la dystonie humaine. Il s’agit d’une version modifiée de l’échelle de notation de la dystonie utilisée par Calderon et al.13. Enregistrer la posture et la démarche des animaux sur une période de 4 min après que les animaux ont été placés dans une boîte en plastique ou en bois. Score pour la fréquence et la distribution des mouvements de dystonie-like de 0 à 4 points : (0) comportement moteur normal ; (1) comportement moteur anormal, pas de mouvements semblables à la dystonie; (2) l’affaiblissement doux de moteur avec les mouvements focals doux de dystonie-comme ; (3) déficience motrice modérée avec des mouvements graves de dystonie focale; (4) une déficience grave, avec des mouvements soutenus et généralisés de dystonie (figure 2). Considérez les mouvements ou les postures suivants comme dystonia-like : hyperextension des membres avant, position large ou hyperextension des hindlimbs aussi bien que cyphose. Considérez la dystonie comme focale dans le cas où une seule partie du corps est affectée et comme généralisée au cas où le tronc et au moins deux autres parties du corps sont affectés. Test de suspension de queueREMARQUE : Le test de suspension de la queue est souvent utilisé pour observer et marquer pour les fermoirs postérieurs. Il s’agit cependant d’un phénotype très peu spécifique indiquant une déficience motrice. Le protocole suivant propose un système de notation spécifique aux mouvements semblables à la dystonie. En raison de la généralisation de la dystonie chez les patients atteints de DYT/PARK-ATP1A3, les mouvements semblables à la dystonie devraient être évalués dans les membres avant, le tronc et les pattes postérieures. Un nouveau système de notation de 0 à 8 points a été mis au point, un score total < 2 indiquait qu’aucun mouvement semblable à la dystonie n’était présent (figure 3). Ramassez la souris près de la queue près de sa base et soulevez l’animal. Enregistrez une vidéo de 2 min du test de suspension de la queue et attribuez une note dans une analyse ultérieure et approfondie de l’enregistrement. Marquer les membres avant de 0 à 4 points, où les rétractions toniques répétées ou soutenues d’un ou des deux membres avant, ainsi qu’une hyperextension combinée avec le croisement des membres avant, ont été classées comme dystonia-like: (0) aucun mouvement anormal; (1) mouvement réduit des membres avant avec hyperextension des pattes vues ≥ 50% du temps enregistré; (2) les mouvements légers de dystonie des membres avant des membres avant et de 50 % du temps enregistré; (3) les mouvements semblables à la dystonie légère des membres avant(s) ≥ 50 % du temps enregistré ou graves < 50 % du temps enregistré; (4) mouvements graves semblables à la dystonie des membres avant (s) ≥ 50 % du temps enregistré.NOTE : Le fermoir hindlimb est un mouvement anormal qui ne devrait pas être marqué comme dystonie-comme. Marquer les hindlimbs de 0 à 3 points, où la rétraction et le serrage des membres arrière ainsi que l’hyperextension soutenue ont été évalués comme dystonie-like : (0) aucun mouvement anormal ; (1) mouvement réduit des hindlimbs avec hyperextension des pattes vues ≥ 50% du temps enregistré; (2) les mouvements semblables à la dystonie d’un anti-hindlimb; (3) les mouvements dystonia-like des deux hindlimbs. En cas de distorsion truncale > 80% du temps enregistré, un point supplémentaire est ajouté au score. Remettre l’animal dans sa cage.