JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Published: August 13, 2020
doi:
10.3791/61617
, , , , ,
1Division of Vaccine Discovery,La Jolla Institute for Immunology

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

Abstract

אימונופרציפיטציה של כרומטין ואחריה רצף (ChIP-Seq) היא גישה רבת עוצמה ונפוצה לפרופיל כרומטין DNA הקשור לשינויים ספציפיים histone, כגון H3K27ac, כדי לסייע בזיהוי יסודות DNA cis-רגולטורי. התהליך הידני להשלמת ChIP-Seq הוא עבודה אינטנסיבית, מאתגר מבחינה טכנית, ולעתים קרובות דורש מספרים גדולים של תאים (>100,000 תאים). השיטה המתוארת כאן מסייעת להתגבר על אתגרים אלה. הליך H3K27ac ChIP-Seq מלא, בעל קנה מידה זעיר, כולל קיבוע תאים, גיזת כרומטין, אימונופרציפיטציה והכנת ספריית רצף, עבור אצווה של 48 דגימות עבור כניסות מספר תא פחות מ-100,000 תאים מתואר בפירוט. הפלטפורמה החצי-אוטונומית מפחיתה את השונות הטכנית, משפרת את יחסי האות לרעש ומפחיתה באופן דרסטי את העבודה. המערכת יכולה ובכך להפחית עלויות על ידי מתן אפשרות לנפחי תגובה מופחתים, הגבלת מספר ריאגנטים יקרים כגון אנזימים, חרוזים מגנטיים, נוגדנים וזמן מעשי נדרש. שיפורים אלה בשיטת ChIP-Seq מתאימים באופן מושלם למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול של דגימות קליניות עם מספרי תאים מוגבלים באופן רב לשחזור.

Introduction

השימוש הנרחב של ChIP-Seq assays לקביעת שברי DNA הקשורים לשינויים ספציפיים histone הוא בין היתר בשל יכולתו לזהות אלמנטים DNA cis-רגולטורי, כולל משפרים פעילים, מקדמים, משתיקי קול, heterochromatin, ואחרים1,2,3,4. זיהוי של אזורים רגולטוריים שאינם קידוד ברחבי הגנום הראה תובנה חשובה כדי להבין טוב יותר את ויסות הגנים בבריאות ובמחלות4. עבודה קודמת מהמעבדה השתמשה ב- ChIP-Seq כדי להראות כי cis–אלמנטים רגולטוריים יכולים לשחק תפקידים חשובים בסוגי תאים שונים5. בדיקת גורם שעתוק (TF) ChIP נוצלה כדי להראות מחלה הקשורה לפולימורפיזם נוקלאוטידיחיד 6.

השימוש ב- ChIP-Seq עם דגימות קליניות אנושיות הוא מאתגר, בעיקר בשל הגבלת מספרי התאים או דגימת הרקמה הרצויה. כתוצאה מכך, היה מאמץ מרוכז בתחום לשפר ולצמצם את הטכניקות האלה וכתוצאה מכך, כמה בדיקות הופיעו, כגון CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. בדיקות אלה משתמשות בתחומים כדי לתייג ולבודד אזורים גנומיים הקשורים לנוגדן מסוים9. טכניקה זו הצליחה להפחית את מספרי התאים עד 1,000s ובמקרים מסוימים לתא אחד, עם זאת, השימוש בטכניקה זו במחקר תרגומי וגדיר קליני הראה מגבלות בשל הדרישות של שימוש בתאים חיים לשיטה זו9,12. דרישת התא החי מקשה לוגיסטית על דגימות קליניות ויכולה להציג אפקטי אצווה אם הדגימות אינן מעובדות בו זמנית. אחרים יש טכניקות microscaled ממוטב עבור תאים קבועים פורמלדהיד, כולל הפיתוח של ChIPmentation11, אשר מותאם כאן באופן תפוקה גבוהה. השימוש בתאים קבועים מאפשר לאחסן דגימות עד איסוף ועיבוד לאחר מכן של כל הדגימות יחד כדי למזער את אפקטי האצווה.

כאן, מתוארת צ’י-אי-סייק מיקרו-קנה-קנה מיקרו-קנה למחצה, המקצרת את זמן הניסויים לפרופיל של שינויים בהיסטון10. השיטה חצי-אטומית מאפשרת תפוקה גבוהה של ChIP-Seq, ומאפשרת עיבוד מלא של עד 48 דגימות ומוכנות לרצף תוך 5 ימים בלבד, עבור עד 10,000 תאים לכל דגימה באמצעות מטפל בנוזל ChIP. המטפל משלים את האימונופרציפיטציה (IP) ולאחר מכן שוטף באופן אוטונומי, אשר מסייע להפחית את השונות בין דגימות. השיטה החצי-אטומית מורידה הן את הזמן הידיים על ידי מעל 15 שעות עבור 48 דגימות ואת השונות הטכנית, ומאפשר מחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול להתבצע באופן רב לשחזור ומהיר עבור תאים ראשוניים או תרבית. הפרוטוקול מסביר את התהליך מתחילתו ועד סופו עבור ChIP-Seq באיכות גבוהה. אם המחשבים הספציפיים אינם זמינים, הפרוטוקול עדיין יהיה משאב שימושי כדי להגדיר ולירות בעיות ChIP-Seq ניסויים באופן ידני.

ההסתה בוצעה עם שלושה סוגי תאי חיסון אנושיים עיקריים שונים וקו תאים בתרבית אחד (HUT78 – ATCC: TIB-161). לבהירות, הפרוטוקול חולק לשבעה חלקים: קיבוע תאים, גיזום כרומטין באמצעות sonication, אימונופרציפיטציה אוטומטית של כרומטין, הכנת ספריה על ידי תגית שבר DNA, הגברה בספרייה, טיהור הספרייה, ואחריו כימות DNA. למתכוני חוצץ אנא עיינו בטבלה משלימה 1.

Protocol

ועדת הביקורת המוסדית (IRB) של מכון לה ג’ולה לאלרגיה ואימפונולוגיה (LJI; פרוטוקול IRB לא. SGE-121-0714) אישר את המחקר. מתנדבים בריאים גויסו וסיפקו דגימות לויקוספירזיס לאחר הסכמה מדעת בכתב. 1. קיבוע תאים להביא את ריכוז השעיית התא ל 1 עד 2 x 106 תאים / מ”ל עם מדיום תרבית תאים מלאה בצינור 15 מ”ל (<10 מ"ל של השעיה) או צינור 50 מ"ל (10-30 מ"ל של תאים). אם <1 x 106 תאים, השתמש 0.5 מ”ל של המדיום בצינור 1.5 מ”ל. מערבולת בעדינות את ההשעיה של התא, הוסף 10x חיץ קיבוע תא dropwise (1:10; vol:vol) ולסובב במהירות נמוכה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). עצור את התגובה על ידי מערבולת בעדינות ולהוסיף 2.5 M גליצין ביחס של 1:20 (vol:vol). הפוך את הצינורות כמה פעמים ודגרה על קרח לפחות 5 דקות. בצע את השלבים הנותרים ב 4 °C (75 °F) או על קרח. לסובב את הצינורות ב 800 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F) ולהשליך את supernatant. resuspend הכדור בעדינות עם 5 מ”ל של קרח קר 1x PBS ודגרה במשך 2 דקות על קרח. חזור על 1.4 ו 1.5 עם 1 מ”ל של PBS קר כקרח 1x ולהעביר את המדגם לצינור 1.5 מ”ל מ”ל מכושל מראש (מסומן לאחסון לטווח ארוך). אם ישים, מומלץ להיפטר מהכנת עליקוטים. לסובב את הצינורות ב 1,200 x g ב 4 °C (50 °F) ולהסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה התא. הצמד להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי. יש לאחסן ב-80 °C (70 °F).אזהרה: יש לנקוט בהגנה מתאימה בעת טיפול בחנקן נוזלי. 2. גיזת כרומטין הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור גיזת כרומטין של כדורי עם 0.3 עד 3 x 106 תאים בצינורות כריכה נמוכה 0.65 מ”ל. הסר את צינור הדגימות עם כדורי תאים קפואים מ -80 מעלות צלזיוס ולאחסן על קרח יבש כדי למנוע כל הפשרה של הכדור לפני הוספת מאגר תמה. צעד זה הוא קריטי. הוסף 70 μL של טרי, RT מלא תמיר חיץ לכדור ולשמור על RT במשך 1 דקות. Resuspend הכדור במשך 1 דקות ללא הקדמה של כל בועות ולאחר מכן לדגור על השעיית התא ב RT במשך 1 דקות לפני לשים את המדגם על קרח. מעבירים את הכדור המחודש לצינור כריכה נמוך של 0.65 מ”ל ושומרים על קרח.הערה: כדי להשיג sonication לשחזור, מראש לחמם את sonicator על ידי הפעלת אותו עם צינורות ריקים בלבד עבור 3-6 מחזורים לפני sonicating הדגימות. מניחים את הדגימות לתוך מחזיק הצינור של sonicator ולמלא את כל הרווחים עם צינורות איזון מלא 70 μL של מים. השאירו את הדגימות באמבט המים במשך כ 1 דקות לפני תחילת sonication. בצע sonication עבור מחזורי x (בהתאם לסוג התא) עם 16 s ON / 32 s OFF למחזור.הערה: שלב זה ידרוש ניסויי אימות כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורים עבור sonication יעיל. לאחר כל 3 מחזורים, להסיר את הדגימות מן sonicator, מערבולת בעדינות ואת הדופק לסובב את הצינורות לפני לשים אותם בחזרה לתוך המחזיק. ודא שאין טיפות קטנות בצד החיצוני של הצינור כמו זה יכול לגרום היווצרות בועה. לאחר השלמת המחזורים הדרושים, ספין דגימות ב >14,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). העבר את הסופר-נט לצינור כריכה נמוך חדש, מקורר מראש, בעל כריכה נמוכה של 0.65 מ”ל, והמשיך לקרח. Decrosslink שבריר של דגימות sonicated כדי לבדוק את יעילות sonication. העבר 1-7 μL של supernatant (שווה ערך כ 250 ננוגרם של כרומטין גיהר) לצינור PCR 0.2 מ”ל ולעשות את הנפח עד 10 μL עם מאגר תמן לטווח קצר ב RT. הוסף 1 μL RNase A ודגר במשך 30 דקות ב 37 °C (800 סל”ד, ולאחר מכן להוסיף 1 μL proteinase K. דגירה במשך 2 שעות ב 55 °C (55 °F) עם רועד ב 1,000 סל”ד. הסר 2 μL של מדגם decrosslinked לכימות DNA באמצעות כימות פלורסנט assay10 (ספקטרופוטומטר אינו מומלץ כמו סבון וחלבון מושפל יכול לייצר הטיה בתוצאות). הפעל את המדגם הנותר על ג’ל אגרוז 1.2% עבור 1 שעה ב 70 V. כתם עם צבע חומצה גרעין (1:20,000) ולקרוא את הג’ל באמצעות transilluminator UV. הכן aliquots מלאי כרומטין לאחסון (לדלל את המדגם ל 25 ng/ μL ב 20 μL עם מאגר תמה מלאה). יש לאחסן את כל הכרומטין הנמרץ ב-80 °C (70 °F). 3. צ’י-פי-סאק אוטומטי לשינוי היסטון הערה: פרוטוקול זה מיועד לפעול על מטפל בנוזל ChIP. למרות שהמערכת יכולה להשתמש במאגרים מותאמים אישית, כל המאגרים מסופקים עם ערכת ChIP. רצועות ChIP עם 8 צינורות המשמשים בסעיף זה הם ספציפיים המטפל בנוזל ChIP. העבר 16 aliquots מדגם עם 500 ננוגרם של כרומטין גזוז ב 20 μL מ -80 °C (70 °F) ומניחים אותם על קרח כדי להפשיר לאט את הכרומטין. לאחר שהופשרה במלואה, מערבולת לזמן קצר ודופק ספין. הכנת כרומטין Pipette 100 μL של חיץ tC1 בתוספת מעכב פרוטאז 1x ו 20 mM נתרן butyrate (חיץ tC1 מלא) לתוך שתי רצועות ChIP 8-tube. העבר 20 μL של כל דגימת כרומטין לתוך צינור מתאים של ChIP 8-tube רצועות המכילות את 100 μL של חיץ tC1 מלא. לשטוף את צינורות הכרומטין על ידי הוספת 80 μL מלא tC1 חוצץ צינורות הכרומטין ולאחר מכן להעביר בחזרה לתוך הצינור המתאים של רצועות ChIP 8-tube עבור נפח סופי של 200 μL. הכנת הנוגדן חשב את נפח הנוגדנים כך 0.5 מיקרוגרם של נוגדן הוא בכל צינור.נפח הנוגדנים = (מספר הדגימות x נוגדן לתגובה) / ריכוז נוגדנים הוסף את הכמות המחושבת של נוגדן לתוך 500 μL של מאגר tBW1. מערבולת במהירות ודופק ספין. Pipette 70 μL של tBW1 לתוך כל אחד משני רצועות ChIP 8-tube ולהוסיף 30 μL של הנוגדן + tBW1 לכל אחד הצינורות. זה יביא את הנפח הכולל בכל אחד הצינורות ל 100 μL. הכנת החרוז המגנטי מערבולת את החלבון פתרון חרוזים ביסודיות. עבור 0.5 מיקרוגרם של נוגדן, pipette 5 μL של חרוזים לתוך קבוצה חדשה של ChIP 8-tube רצועות ספין דופק. מלא את השורה האחרונה של המטפל בנוזל ChIP עם רצועות ChIP 8-tube מסומנות, ריקות. בצע את מפרטי התוכנית ChIP-16-IPure-200D למיקום כל הרצועות במכונת המטפל הנוזלי ChIP. הוסף את המאגרים במיקום הנכון אך השתמש ב- tW4 במקום במאגר tE1.הערה: לארגן את היום כך המטפל בנוזל ChIP יבצע את ChIP לילה. התוכנית תפעל במשך כ 16 שעות עבור 16 דגימות. זה מסמן את סוף היום הראשון. 4. שילוב של מתאמי ספריה להכנת הספרייה הגדר מראש תרמומיקסר ל 37 °C (500 סל”ד). קרר מגנט עבור רצועות צינור 0.2 מ”ל על קרח. עבור 16 דגימות, להכין 440 μL של מאגר tagmentation על קרח. Pipette 53 μL לתוך רצועה אחת חדשה 8 צינור ולשמור על קרח. ברצועת 8 צינור חדשה בגודל 0.2 מ”ל, הוסיפו 220 מיקרו-אל של חיץ tC1 קר ושמרו על קרח. 8 צינורות הפסים יכולים להכיל את הנפח הזה ועדיין להיות מכוסים. הסר את צינור הפס “דגימות IP” ממכונת המטפל הנוזלי ChIP (שורה 12) וכובע הצינורות לפני ספינינג דופק. ללכוד את החרוזים באמצעות המגנט עבור רצועות 8-tube במשך 2 דקות ולהסיר בזהירות את supernatant. מעבירים 25 μL של מאגר התגים אל החרוזים עם רב ערוצים, מסירים מהמגנט ומערבבים בעדינות עד החרוזים הומוגניים (בערך 5 פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה מוגדרת 20 μL). מכסים את הצינורות ומניחים לתוך התרמומיקס המחומם מראש ודגרה במשך 3 דקות. הגדלת הזמן תקטין את היעילות של הכנת הספרייה. מעבירים את הצינורות למתלה מתכת צונן ומוסיפים 100 μL חוצץ tC1 צונן לכל דגימה. הגדר pipette רב ערוצי ל 80 μL ולערבב את המדגם עד החרוזים הם הומוגניים, לעצור את תגובת tagmentation. החזירו את הדגימות למטפל בנוזל של ChIP והמשיכו בהליך הכביסה Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. ודאו שהשטיפה מבוצעת פעמיים עם חיץ tC1 ופעמיים עם tW4. יש להשלים את ההתחמקות כפי שמסומנת בפריסת התוכנית, עם מאגר tE1. ביטול ה-DNA הסר את רצועות ChIP 8-tube בשורה האחרונה של המטפל בנוזל ChIP ולהוסיף 2 μL RNase A לכל מדגם. מכסים את הצינורות, מסובבים את הדופק, מערבבים בעדינות את החרוזים עם פיפטה רב-ערוצית עד שהתערובת הומוגנית, ומכסים מחדש את הצינורות. לדגור על הדגימות בתרמומיקסר במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F) ו 900 סל”ד. הסר את הדגימות מן thermomixer, להוסיף 2 μL של Proteinase K. בצע את אותו הליך כמו 4.9.2 לאחר התוספת. לדגור את הדגימות בתרמומיקסר עבור 4 שעות ב 55 °C (55 °F) ו 1,250 סל”ד, ואחריו 65 °C (70 °F) ב 1,000 סל”ד לילה.הערה: זהו סוף היום השני. 5. טיהור שברי דנ”א מתויגים סמן 16 צינורות 1.5 מ”ל עם מספר המדגם המתאים והוסף 400 μL של מאגר כריכת DNA מערכת ניקוי DNA לכל אחד. הסר את רצועות 8 הצינורות מן thermomixer ואת הדופק לסובב את הרצועות כדי להבטיח כל מוצר מתאדה נשמר. מניחים רצועות על מגנט 8 רצועות כדי ללכוד את החרוזים. העבר 100 μL של DNA decrosslinked לתוך כל אחד צינורות 1.5 מ”ל. הוסף 100 μL של מאגר כריכת DNA לרצועות 8 צינור לשטוף את החרוזים ולאחר מכן להעביר צינור 1.5 מ”ל המתאים. מערבולת בערך 10 שניות ודופק לסובב את צינורות 1.5 מ”ל. טען את העמודות עם 600 μL המכיל את מאגר כריכת DNA ודגימת ChIP. ספין דוגמאות עבור 20 s ב 10,000 x g ולטעון מחדש את העמודה עם הזרימה דרך. הסתחררו שוב עם אותם תנאים והשליכו את הזרימה. לשטוף את העמודים פעמיים עם 200 μL לשטוף חוצץ (אותו צנטריפוגה כמו השלב הקודם) ולבטל את הזרימה דרך. יבש את העמודות על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 12,000 x g. העבר את העמודה לצינור אוסף חדש של 1.5 מ”ל והוסף מאגר TE חם של 9 μL (מחומם מראש ל- 55 °C (55 °C) ישירות למטריצת העמודות. אפשר לעמודה לדגור במשך דקה אחת לפני צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 10,000 x g. העבר את 9 μL של elute לסט חדש מתאים של רצועות 8 צינור. השלם את ההתחמקות שוב עם מאגר TE של 8 μL כבעבר. מעבירים את האלגנטיות לרצועות 8 הצינורות המתאימות (נפח סופי 17 μL לדגימה) ושומרים על קרח. 6. הגברה ובחירת גודל של הדגימות המטוהרות השלבים הבאים משתמשים ב- qPCR כדי לקבוע את מספר המחזורים הדרושים להגברה אופטימלית (CtD – Ct) הכן את תערובת CtD עבור כל הדגימות על-ידי הכפלת התוכן של מאגר תערובת CtD במספר הדגימות. יש לפזר 3.6 μL של תערובת CtD לתוך צלחת qPCR ולהוסיף 1.4 μL של דגימות DNA מתויגות (~ 10 % מהנפח הכולל). בצע את qPCR הבא: 98 °C (5 דקות), 72 °C (5 דקות), 98 °C (70 °F) עבור 30 °C (50 °F), 26 מחזורים של 98 °C (78 °F) עבור 10 °C (63 °F) עבור 30 °C (70 °F) ו- 72 °C (72 °F) למשך 30 מעלות צלזיוס. הכן את תערובת המגבר עבור כל הדגימות על-ידי הכפלת התוכן של מאגר תערובת AMP במספר הדגימות. יש לפזר 14 μL של DNA מתויג לבארות נפרדות של צלחת PCR, ולאחר מכן להוסיף 2.5 μL של שני פריימרים אינדקס רצף (25 μM) לכל מדגם (נפח התגובה הסופי הוא 50 μL). מערבבים את הדגימות על ידי pipette רב ערוצי ולבצע את תוכנית ההגברה המשמשת CtD עם המספר המתאים של מחזורים.הערה: זוהי נקודת עצירה טובה כמו דגימות מוגברת ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך כמה שבועות. עם זאת, ניתן להשלים את הטיהור באותו יום. עבור 48 דגימות, השלבים 3 – 6.5 הושלמו עם שתי אצוות נפרדות אחרות ולאחר מכן מוגבר באצווה אחת כמתואר להלן. בצע לאחר הגברה, בחירת גודל וכימות של DNA מתויג כמתואר להלן. זה בדרך כלל ניתן להשלים עם 48 דגימות (ניתן להשלים עם פחות דגימות כרצונך). הוסף 90 μL של חרוזים paramagnetic (יחס 1:1.8) לתוך כל באר, לערבב, ולאפשר לו לדגור ב RT במשך 2 דקות. ללכוד את החרוזים באמצעות מגנט צלחת ולהשליך את supernatant. לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 200 μL של אתנול טרי 80% מבלי לשבש את גלולה חרוזים. הסר כל עודף אתנול עם 20 טיפים μL לאחר לשטוף הסופי ולהשאיר את החרוזים להתייבש במשך 10 דקות או עד סדקים מופיעים כדורי חרוזים. עם הצלחת עדיין על המגנט, להוסיף 40 μL של מים מחוממים מראש לכל באר. אוטמים את הצלחת, מערבולת ביסודיות, ולזמן קצר דופק לסובב את הצלחת. ללכוד את החרוזים על ידי הצבת הצלחת בחזרה על המגנט ולהעביר את 40 μL elute לצלחת “מדגם” חדש. הדגימות מטוהרות כעת, והשלבים הבאים מעשירים שברים הנעים בין 200-1,000 bp. שלב QC אופציונלי: הסר 4 μL מהדגימות והעבר ללוח QC. הוסף 4 מים μL בחזרה לדגימות. פעולה זו קובעת את אחוז הקטעים הגדולים. הוסף 22 μL של חרוזים paramagnetic (יחס 1:0.55) לדגימות, לערבב בזהירות, ודגור ב RT במשך 2 דקות. מניחים על מגנט כדי ללכוד את החרוזים במשך 5 דקות ולהעביר את supernatants לעמודים 7-12 של צלחת “מדגם”. הסר את הצלחת מהמגנט והוסף 30 μL של חרוזים (יחס סופי של 1:1.3). מערבבים בזהירות ומאפשרים לו לשבת ב RT במשך 2 דקות. ללכוד את החרוזים במשך 5 דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant. לשטוף את כל החרוזים 3 פעמים עם 200 μL טרי 80 % אתנול כפי שתואר קודם לכן (שלב 6.6.2 – 6.6.3). לאחר שהכדורים יבשים, יש לחמוק מדנ”א עם חיץ TE מחמם מראש של 8 μL לכל באר, בעודם על המגנט. מוציאים את הצלחת מהמגנט, החותם והמערבולת ביסודיות. אפשר לצלחת לדגור במשך 2 דקות ב RT, פולס-ספין, ולהניח את הצלחת בחזרה על המגנט במשך 2 דקות. מעבירים את הסופר-נט לצלחת חדשה (לוח 2). לשחזור מרבי, חזור על ההתחמקות עם תוספת של 8 מיקרו-אל של מאגר TE מחומם מראש. מקם את הדגימות לתוך בארות המתאימות, כך שלכל דגימה יש 16 μL של ספריה סופית.הערה: בסוף שלב זה צריכות להיות שתי צלחות (אחת אם לא הושלמה צלחת QC). לוח QC יהיה שברים שנבחרו מראש ואת הלוח השני צריך 48 בארות של ספריה סופית (16 μL סה”כ). 7. לכמת את הספריות הסופיות ואת דגימות QC באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות כימות דנ”א מלא באמצעות פלואורסצנטיות הממתמת בדיקת או שיטה דומה. אם כימות QC הושלם, לקבוע את אחוז אובדן המדגם שהיו < 1,000 bp. לא צריך להיות יותר מ 20% הפסד – אם היה יותר, יכול להיות שיש בעיה עם יחסי החרוזים החלים. לקבוע את גודל שברי כל מדגם, רצוי באמצעות מכונת אלקטרופורזה נימית. כדי לחשב את ריכוז הטוחנת השתמש במשוואה הבאה: [ריכוז הספרייה (ng/μL) * 106]/[660 * גודל קטע חציוני (bp)]).הערה: הספריות מוכנות לאגוס (כמויות שימולריות) ולרצף בהתאם להליכי רצף סטנדרטיים של הדור הבא.

Representative Results

כהוכחה לרעיון, ChIP-Seq הושלם עבור שישה תורמים אנושיים עם שלושה סטים של סוגי תאי חיסון: תאי CD4 T נאיביים (CD4), מונוציטים קלאסיים (MO) ותאי הרג טבעיים (NK), מועשרים על ידי מיון FACS כמתואר לפני13. הנוהל בקו תחתון מורכב מתשעה הליכים נפרדים כפי שהם מיוצגים באיור 1. איור 1: תרשים זרימה כללי להליך. (A) קריקטורה של ההליך הכולל (שנוצר ב- BioRender). (B)תרשים זרימה עבור כל השלבים העיקריים עבור הפרוטוקול והזמן המוערך של הידיות והזמן הכולל המשויך לכל יום. הרצף יכול לקרות בסוף היום החמישי או מאוחר יותר עם סיבובים מרובים. ציר הזמן יכול גם להיות מתנדנד לאורך כל השבוע, שבו יום רציף 3-4 ניתן להשלים מספר פעמים בשבוע כדי ליצור 48 דגימות ChIP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לאחר בידוד תאים על ידי ציטומטריהזרימה 13, תאים ממוינים היו צנטריפוגות ותאים קבועים ומאוחסנים כמתואר לעיל. לאחר שכל הדגימות נאספו, הדגימות היו lysed והוכנו לגיזה כרומטית בקבוצות של 12 כמתואר לעיל. עבור כל מדגם, מספר המחזורים להגיע sonication אופטימלי הושלם10. מדידה כמותית, כמו גם מדידות גודל שבר כרומטין גועתי הראו שחזור נהדר של השיטה שלנו בשלושת הסטים של תאי מערכת החיסון (איור 2A). תאי החיסון האנושיים השונים היו sonicated בקבוצות נפרדות והניבו בעקביות רבה עם > 70% של המדגם בין 100 – 500 bp עבור 14 מחזורים (16 s ON, 32 s OFF למחזור). בשלב זה, דגימות עם שברים גדולים לאחר sonication (< 70% של המדגם בין 100 – 500 bp) נחשבו ככושל. דגימות אלה יכול גם sonicated עבור 1-2 מחזורים נוספים או הושלכו והוחלפו מאוחר יותר עם תאים מכדור אחר. השיטה שלנו הראתה שאף אחת מהדגימות לא דרשה יותר sonication או בוטלו, מה שמרמז על חוסן מוחלט של ההליך. איור 2: דוגמאות QC טרום רצף. (A) 1.2% ג’לים אגרוז להראות רבייה של sonication. דגימות Sonication עבור 6 תורמים בשלושה סוגי תאים: תאי CD4 T נאיביים (CD4), מונוציטים קלאסיים (MO) ותאי רוצח טבעיים (NK). הדגימות היו sonicated במשך 14 מחזורים (16 s ON, 32 s OFF למחזור). עבור כל מדגם כ 200 ננוגרם של כרומטין decrosslinked נטענו על ג’ל אגרוז 1%. דגימות נחשבו טובות אם יותר מ – 70 % מהשברים נמצאים בתוך 100-500 bp. (B) עקומות הגברה למעלה – ניתוח qPCR כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורים להגברה (Ct שבו יש 1/2 את העוצמה המרבית). הדגימות האידיאליות יש Ct של כ 15 וגברת ניתן להשלים עד 2 מחזור יותר של Ct נמדד. החץ הוא דוגמה של דוגמה רעה שבו Ct הוא גדול מ 18. למטה – דוגמה של קבוצה גרועה של דגימות מוצגת אשר יש Ct גדול מ 18. דגימות אלה הראו גם עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר. (C)עקבות אלקטרופורזה של מנתח שברים הראו את התפלגות הספריות הסופיות לאחר ההגברה ובחירת הגודל. דגימות עם יותר מ -85% מספריית הקטעים נמצאות בתוך 200-1,000 bp נחשבו כדוגמאות טובות. מדידת עוצמת שיא של פלואורסצנטיות נחשבת גם לפרמטר QC חשוב, אכן אם האות נמוך, המדגם לא סביר לרצף היטב. מימין – מוצגות דוגמאות לדגימות חיוביות ב- CD4, MO ו- NK. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לאחר הכימות, הדגימות היו לרוץ על מטפל נוזלי ChIP עם נוגדנים H3K27ac, ואחריו tagmentation עם אנזים טרנספוסאז Tn5. כדי לקבוע את המספר המתאים של מחזורי הגברה על-ידי qPCR, נעשה שימוש ב-10% מהדגימות המתויגות. לקביעת מספר המחזורים להגברת הדגימות, אנו מוצאים את המחזור שבו עוצמת המדגם היא חצי מהממוצע המרבי לקביעת מחזור (איור 2B). דוגמאות עם ערכי Ct של יותר מ- 18 לא ביצעו רצף טוב לאחר הרצף וערך ה- Ct שלהם הצביע על כך מדגם ChIP שנכשל. דגימות אלה בדרך כלל גם הניבו כמות נמוכה יותר של DNA לאחר הגברה. דגימות (100,000 תאים קלט) עם ערך Ct שווה או פחות מ 15 היו אידיאליים ודגימות בין 15 ל 18 היו מקובל אבל פחות עקבי לאחר רצף. עבור דגימות עם פחות מ -100,000 תאי קלט, ערכי ה- Ct נמצאו בדרך כלל בין 15 ל – 18 אך לא היו זקוקים ליותר מ – 18 מחזורים כדי להניב מספיק מוצר לרצף. לאחר הגברה עם תיוג DNA, ספריות טוהרו ונבחרו בגודל כדי לקבל התפלגות גודל אידיאלית, החל מ-200 עד 1,000 bp, לרצף NextGen. הערכת התפלגות הגודל בכל אחת מהספריות הושלמה מכיוון שנתוני הריצוף הטובים ביותר הושגו כאשר יותר מ-85% מרסיסי הדנ”א נעו בין 200 ל-1,000 bp (איור 2C). ראוי לציין, כמו אותה כמות של DNA (נמדד על ידי כימות פלואורסצנטיות) היה טעון, זה הבחין הדגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה בדרך כלל רצף גרוע (איור 2C). לאחר רצף, פקדי איכות סטנדרטיים המבוססים על הנחיות ENCODE ChIP-Seq הוחלו5,14,15. איור 3: שחזור של דגימות תאי החיסון. (A)רצועות H3K27ac (דפדפן הגנום של UCSC, עוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4, כולן עם ציר Y בקנה מידה שווה) עבור 6 תורמים (100,000 תאים לשכפול) בכל סוג תא (CD4, MO ו- NK). ארבעה loci למופת מוצגים, שניים עם (איל 2RA לוקוס ו PTPRC) ושניים ללא העשרה עבור H3K27ac (CCR4 ו- MS4A1). (B)מתאם פירסון בין התורמים לבין חלקות מתאם תואמות שנוצרו באמצעות הרחבה של 300 bp וחלון 500 bp בתוך חבילת MEDIPS עבור כל אחד מסוג התא משכפל16. (C)קבצי תורמים ממוזגים עבור כל סוג תא המציגים רצועות H3K27ac (דפדפן הגנום של UCSC בעוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4) באזורים ספציפיים לסוג התא (IL17R עבור CD4, CCR2 עבור MO ו- KLRC1 עבור NK) ובגן שמירת הבית B2M, הנמצא בכל סוגי התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. לבקרת איכות חזותית, הוכנו מסלולי העשרה H3K27ac לתצוגה בדפדפן הגנום של UCSC. עבור ארבעה לוקים גנטיים, מסלולים בודדים עבור כל מדגם הראו איכות מיפוי גבוהה ויחס אות לרעש המשקף את העקביות הגבוהה והחוסן של בדיקת ה- assay שלנו (איור 3A). שני הלוקי משמאל מתבטאים היטב בגנים בסוגי תאים אלה, בעוד שהגנים בשני הלוקי מימין אינם באים לידי ביטוי ומזוהים כבקרות רקע13 (איור 3A). יתר על כן, חבילת הניתוח MEDIPS שימשה כמשתנה לאחר הרצף להערכת מדד המתאם בין שכפולים טכניים (איור 3B)5,16,17, קביעת מידת המתאם עבור רמת העשרת קריאות עבור 500 bp פחים16. ברוב ההשוואות הזוגיות, מדדי המתאם של פירסון הראו יותר מ-90% מתאם המצביע על רמת עקביות גבוהה בין המשכפלים הביולוגיים (איור 3B). שכפולים עם מתאם מקובל מוזגו כדי להגדיל את יחס האות לרעש. בעוד שלוצי ספציפי לסוג התא הראה העשרה גבוהה בתאים המתאימים, גן לשמירת הבית (B2M) הראה שינוי היסטון עקבי מאוד(איור 3C). לצורך הניתוח, מיזוג מסלולים משכפולים יגביר את ההעשרה, יחזק את האות הספציפי, כולל עבור משפרים חשובים ספציפיים לסוג התא, ויפחית את השונות הבין-אישית הטמונה בדגימות אנושיות5. למרות 100,000 תאים שימשו למחקר זה, הייתה רבייה גבוהה עבור מעטים ככל 10,000 תאים בקו תא T בתרבית אנושית (HUT78). ניתוח מתאם בין ערכת הנתונים ChIP-Seq שבוצעה מדגימות עם פחות מ-100,000 תאים הראה יכולת רבייה ומתאם גבוהים עד 10,000 תאים (איור 4A). איור 4: יכולת רבייה של דגימות קלט נמוכות. (A) דוגמאות לעקביות של H3K27ac ChIP-Seq עבור תאים 100,000 עד 10,000 בתאי HUT-78 (קו תאי לימפומה של תאי T). הרצועות (דפדפן הגנום של UCSC, עוצמה מרבית, פונקציית החלקה של 4, כולן עם ציר Y בקנה מידה שווה) מציגות את לוקוס IL4. (B)מתאמי פירסון של המשכפלים באמצעות הרחבה של 300 bp וחלון 500 bp בתוך חבילת MEDIPS16.  (C)מתאם פירסון בין קבוצות מספר התאים השונות (100,000, 50,000 ו- 10,000 תאים) באמצעות אותם פרמטרים של MEDIPS כמו ב- (B)16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. ניתוח מתאם פירסון הראה מדד מתאם גבוה (83% עד 92%), מה שמרמז על תחזוקת האות בדגימות מספר תאים נמוך. עם זאת, היה רקע מוגבר ככל שמספר התאים צומצם, כמו גם ירידה של מקדמי המתאם (איור 4B). כדי לשמור על אותות רקע נמוכים, מוזגו כפילויות טכניות והמתאם נבדק בין קבוצות (איור 4C). מאגר קיבוע תאים 10X תרכובת ריכוז סופי פתרון פורמלדהיד 11% NaCl 100 מ”ר EDTA, pH 8.0 1 מ”מ EGTA, pH 8.0 0.5 מ”מ HEPES, pH 7.5 50 מ”ר מאגר תמיסת מלא תרכובת ריכוז סופי טריס-HCI, pH 8.0 50 מ”ר EDTA, pH 8.0 10 מ”ר SDS 0.25% נתרן בות’ראט 20 מ”ר קוקטייל מעכב פרוטאז פי 1 מאגר תמיס לטווח קצר תרכובת ריכוז סופי טריס-HCI, pH 8.0 50 מ”ר EDTA, pH 8.0 10 מ”ר SDS 0.25% תערובת תגיות תרכובת ריכוז סופי טריס-HCI, pH 8.0 10 מ”ר MgCl2 5 מ”ר N,N-דימתילפורמיד 10% אנזים תיוג אילומינה 1:24 וולט:vol תערובת CtD תרכובת לכל דגימה (μL) NextEra Index פריימר A (25 מיקרומטר) 0.275 NextEra Index פריימר B (25 מיקרומטר) 0.275 2X KAPA HiFi חם סטארט-אפ מוכן לערבב 2.75 1:1000 צבע ירוק SYBR 0.11 ROX צבע פסיבי 0.11 מים מלא ל- 4 מיקרו-אל תערובת AMP תרכובת לכל דגימה (μL) 2X KAPA HiFi חם סטארט-אפ מוכן לערבב 27.5 מים מלא ל- 31 μL טבלה משלימה 1: מתכוני חוצץ. טבלה משלימה 2: ספירמן ופירסון מדגימים מתאמים עבור 6 התורמים וכל סוג תא. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מרחיבה על הליך ChIPmentation11, המיישם פרוטוקול הכנת ספריית תגים לפני טיהור ה- DNA, על ידי אוטומציה ומיקרו-חישוב של הפרוטוקול. מאז תחילת ChIP-Seq, מספרי התאים הנדרשים צומצמו באופן דרסטי, החל בכ -20 מיליון תאים עבור היסטונים עד למאות ואפילו תאים בודדים1,7,10,12,18,19,20,21. שיטות אלה שפותחו לאחרונה אפשרו הבנה עמוקה יותר של האופן שבו מנגנוני cis-רגולטוריים פועלים בתאים על ידי הגברת הרגישות ומאפשרים לאוכלוסיות תאים קליניים נדירים להיבדק5,6,12,17. לדוגמה, אחד ההליךים האחרונים והפופולריים יותר, הנקרא CUT&TAG, כחלופה חזקה ורגישה של ChIP-Seq9. הוא מייצר יחס אות לרעש מצוין מכיוון שהאנזים Tn5 קשור באופן קוולנטי לחלבון A ומזהה את שרשרת ה- Fc של נוגדן ChIP עם ספציפיות גבוהה9. פעילות הרקע של Tn5-אנזים מופחתת כמו האנזים אינו פונקציונלי לפני קשירה נוגדן היעד9. עם זאת, היישום של שיטה זו בהקשר קליני מוגבל שכן הוא דורש תאים חיים לא קבועים. כמו כן, הסרת שברי DNA מהגרעין ההיפוטוני יכולה להיות השפעות שליליות על הכרומטין כפי שהוא מוסר במהלך בדיקה. הדרישה הדרושה לעבוד עם תאים טריים וחיים היא מקור לבעיות עבור דגימות קליניות נדירות עבור קבוצות גדולות של דגימות, שכן קבוצות גדולות יכול לקחת שנים רבות כדי לאסוף5. סוג אחר של שיטה, drop-ChIP, משתמש באלגנטיות התקן microfluidics כדי ליצור tagmention מבוסס טיפה לפני עיבוד ChIP19. עם זאת, הוא משתמש במכשיר microfluidic מיוחד מאוד, בעוד שניתן להשלים ChIP-Seq תא יחיד, הוא מוגבל גם לשימוש בתאים חיים7,8,9,18,19. שיטות חדשות יותר המסתמכות על ChIP-Seq כגון PLAC-Seq או HiChIP, מנסות להבין אינטראקציות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בין פסגות ChIP-Seq22,23. שיטות תלת-ממד אלה מרגשות כאשר הן מזהות אינטראקציות רגולטוריותאו TF מתווכות ברחבי הגנום ומשפרות את ההבנה של הרגולציה של ביטוי גנים בסוגי תאים של עניין, ברקמות בריאות ובהקשר של מחלות.

ישנם כמה צעדים קריטיים לשקול עבור הפרוטוקול להיות מוצלח כגון איכות הכרומטין sonicated ואיכות הנוגדן. יעילות הגיהה היא קריטית, אם הכרומטין אינו sonicated היטב, היעילות של בדיקה פוחתת באופן דרסטי24. Sonication הוא היבט מאתגר של ChIP-Seq בשל מספרי התאים הנדרשים. על sonicator בשימוש בפרוטוקול, היעילות צומצמה באופן דרסטי תחת 300,000 תאים. זהו היבט מאתגר ב ChIP-Seq כמו sonicate תחת רמה זו לעתים קרובות ידרוש פיצול אנזימטי, וזה פחות משוא פנים. כתוצאה מכך, sonication הוא גורם מוגבל עיקרי עבור ChIP-Seq מיקרו-קנה מידה אמיתי. פלטפורמות sonication אחרות וערכות זמינות מסחרית נבדקו עבור sonicating כרומטין, אבל sonicator בשימוש כאן היו התוצאות החזקות ביותר לשחזור. יתרון נוסף של sonicator הוא לא צריך לרכוש צינורות מיוחדים כדי להפעיל את sonication, אשר מפחית עלויות בעת התמודדות עם מספר רב של דגימות. עבור sonication אופטימלי, ראשית, חשוב לחמם מראש את sonicator כמתואר לעיל. שנית, כדי ללזר את הכדור, מומלץ לקבל את קצה pipette נוגע בתחתית הצינור תוך ליסינג לשבור את התאים עם מגבלות פיזיות יותר. שלישית, כל היווצרות בועה לפני sonication מעכב את היכולת של המדגם להיות sonicated באופן שווה. אם יש בועות שנוצרו במהלך תמהה, חשוב להסיר אותם עם pipette. זה יכול להיות מאתגר מבלי להסיר הרבה מדגם, אבל אם הקצה הוא לחוץ קלות נגד הבועה זה יכול להיות נמשך לאט ללא אובדן של מדגם רב. לבסוף, בעת קביעת מספר המחזורים, להשלים קורס זמן שבו כל שלושה מחזורים, מדגם מוסר, מטוהר, רץ על ג’ל אגרוז. הימנע over/under sonication של דגימות כמו זה מקטין את יעילות ChIP. אם המדגם הוא תחת sonicated, שברים גדולים יכולים להיות השפעה שלילית על איכות ChIP-Seq24. מצד שני, אם המדגם הוא over sonicated, קיים סיכון של אפיטופ היעד ללכת לאיבוד בתהליך.

חלק חיוני נוסף של ChIP-Seq הוא איכות הנוגדן. לפני הפעלת כל מחקר בקנה מידה גדול, יש צורך לייעל את הנוגדן אשר ישמש. המטרה היא להשיג יחס אות לרעש גבוה באופן משמעותי של אזורים ידועים של הגנום ועוד אחד הוא הרבייה. אם הנוגדן מושך הרבה אות רקע, מומלץ להשתמש בקלט גדול יותר או לנסות הרבה / ספק אחר. זה יוסיף זמן לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדול, אבל זה צעד חיוני. כדי לבדוק אם יש אות לרעש מומלץ להשתמש ב-qPCR עם אזורים הידועים כיעד לנוגדן שלך ואזור אחר שידוע שהוא נעדר. זה כבר הבחין שינויים histone הם חזקים יותר וקל יותר לייעל מאשר TFs.

הפרוטוקול המתואר לעיל מספק שיטה חזקה לשינוי Histone-Seq בעל תפוקה גבוהה באופן חצי-אוטונומי, מיקרו-קנה מידה. השיטה מגבילה את כמות הזמן מעשי ומגדילה את יכולת הרבייה על פני ChIP-Seq ידני. מחקרים קודמים שהושלמו במעבדה השתמשו ב- ChIP ידני על שכפולים טכניים והשיג ממוצע מתאם ספירמן של 0.505, עם זאת, עם המערכת חציautomated, מתאם ספירמן בין תורמים שונים עם ממוצע תאי NK של 0.66 (טבלה משלימה 2). זה גם הושלם עם כ -40% פחות זמן מעשי. השיטה המתוארת כאן עברה אופטימיזציה לשינויי histone (H3K27ac המוצג כאן, אך הפרוטוקול לא צריך שום שינוי עבור אחרים) וידרוש רק שינויים קלים ליישום עבור TF ChIP-Seq. למרות איכות הנוגדן, השינוי העיקרי יהיה עבור זמן sonication ואולי את המאגרים המשמשים במהלך ה- IP. בדרך כלל, עבור בדיקות TF ChIP, השיטה עשויה לעבוד טוב יותר עם שברים מעט ארוכים יותר של כרומטין (עם טווח של סביב 350-800 bp) כמו TF: מתחמי DNA נוטים פחות להישמר באמצעות sonication קפדני6. ייתכן שהמאגרים יצטרכו גם לעבור לתערובת מותאמת אישית או לערכות זמינות אחרות בתעשייה, מכיוון ש- TFs יכול להתנהג באופן שונה משינויי histone.

למרות המטפל הנוזלי האוטומטי ChIP נבדק עבור כמה שפחות עד 10,000 תאים, חלה ירידה ניכרת בשחזור בריכוזים כרומטין נמוכים יותר. בשל כך, הפרוטוקול לא הומלץ על פחות מ -10,000 תאים, עם 100,000 תאים להיות התנאים האופטימליים. הפרוטוקול הושלם גם באמצעות מאגרי ChIP בתעשייה, אשר היה הוצאה נוספת אך סיפק נתונים באיכות גבוהה יותר. הפרוטוקול יכול להיות שונה לגבי תנאי sonication (כל עוד הכרומטין הגועה נשמר באותו טווח), מאגרים ניתן להתאים אישית עבור immunoprecipitation (IP; אופטימיזציה עשויה להידרש), או המטפל בנוזל ChIP לא ניתן להשתמש. מגבלה של הפרוטוקול היא השימוש של המטפל בנוזל ChIP, אשר יכול להיות השקעה יקרה יכול רק להפעיל 16 דגימות בבת אחת. המטפל בנוזל ChIP מוגבל לתגובות בקנה מידה קטן ומספרי תאים הגדולים ממיליון אינם מומלצים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להסתיים בלעדיו, על ידי השלמת שלבי ה- IP והשטיפה באופן ידני. אם ה- IP והכבסות הושלמו ביד, הזמן להשלים את בדיקת ה- Assay יגדל והשחזור עשוי לרדת, אך מדריך זה עדיין יהיה שימושי בהפעלת ניסוי ChIP-Seq באיכות גבוהה. ראוי לציין, מפעילים נוזליים אחרים יכולים להיות מותאמים להפעלת תגובות ChIP חציautomated.

לסיכום, היתרונות העיקריים של מערכת זו הם אופי התפוקה הגבוהה, שכן שלבי הקניין הרוחני והשטיפה הושלמו באופן אוטונומי. ככזה, ניתן להשלים סבבים רציפים של ניסויי ChIP, המאפשרים עד 48 דגימות להיות מעובדות במלואן ומוכנות לרצף תוך 5 ימים, עם זמן מעשי מוגבל בהשוואה לניסויים ידניים של ChIP-Seq. יתרון נוסף הוא רבייה מוגברת מאז ChIP-Seq יכול להיות קשה להשיג תוצאות רבייה מאוד. שיטות אחרות דורשות תאים חיים, מערכות מיקרו-צנרת מורכבות, או שהעבודה תושלם במלואה ביד. מערכת זו תצטרך להיות ממוטבת עבור דגימות קלט נמוך (<10,000 תאים), ובסופו של דבר מאפשר תגובות ChIP של תא יחיד. המערכת מסוגלת גם להיות מותאמת לשיטות ChIP החדשות יותר, כגון PLAC-Seq ו- HiChIP22,23.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי המעבדה של ויג’יאאנאנד על העזרה הטכנית והדיונים הבונים ועל ד”ר שרון סקוואזו ומר ג’פרי ברגוט מדיאגנודה על הסיוע הטכני עם מכונת הניקול והפרוטוקולים של Sonicator ו- ChIP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) ו- S10OD016262 (אילומינה HiSeq 2500).

Materials

200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips Diagenode C30020002 Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip
AMPure XP for PCR Purification Beckman Coulter A63880 SPRI beads
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube Corning MCT-060-C 0.65 mL low binding tube
Bioruptor Pico Sonicator Diagenode B01060010 Sonicator used in the lab but others can be used
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) Zymo Research D5205 DNA clean-up kit
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation ThermoFisher 10001D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free ThermoFisher AM9260G
EGTA pH 8.0 Millipore Sigma E3889-25G
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 2231000667
Formaldehyde solution Millipore Sigma 252549-1L
Glycine Millipore Sigma 50046-250G
H3K27ac polyclonal antibody – Premium Diagenode C15410196
HEPES (1 M) pH 7.5 ThermoFisher 15630080
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Illumina 20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit Illumina 20034197
IP-Star Compact Automated System Diagenode B03000002 Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KK2601 PCR mix
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact Diagenode C30020003
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher R0971
N,N-Dimethylformamide Millipore Sigma D4551-250ML CAUTION – low flash point
NaCl (5 M), RNase-free ThermoFisher AM9760G
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011044
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps USA Scientific 1402-4700 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip
Proteinase Inhibitor Cocktail Millipore Sigma P8340
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
PureLink RNase A (20 mg/mL) ThermoFisher 12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent ThermoFisher P7581 Used in the flourescence quantification
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher 4485699 qPCR
ROX Reference Dye ThermoFisher 12223012
Sodium butyrate Millipore Sigma 303410-100G
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) ThermoFisher S11494 nucleic acid dye
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X concentrate in DMSO ThermoFisher S7563
TE Buffer ThermoFisher 12090015
Tips (bulk) Diagenode C30040020 Tips for the IP Star
True MicroChIP Kit Diagenode C01010130 Contains all the buffers for the IP; ChIP kit
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 ThermoFisher 15568025
UltraPure SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science. 316, 1497-1502 (2007).
  3. Mikkelsen, T. S., et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).
  4. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).
  5. Seumois, G., et al. Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility. Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).
  6. Schmiedel, B. J., et al. 17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells. Nature Communication. 7, 13426 (2016).
  7. Ai, S., et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).
  8. Brind’Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communication. 6, 6033 (2015).
  9. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).
  10. Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies. Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).
  11. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, 21856 (2017).
  13. Schmiedel, B. J., et al. Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression. Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).
  14. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  15. Chen, L., et al. Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells. Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).
  16. Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments. Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).
  17. Engel, I., et al. Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs. Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).
  18. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  19. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  20. Wang, Q., et al. CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  21. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  23. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  24. Diagenode. The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus. Diagenode. , (2012).

Tags

ChIP-SeqEpigenetic StudiesChromatin ShearingHistone ModificationProtein A BeadsTagmentationHigh-throughputSemiautomatedReproducibilityHands-on Time Reduction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., Schmiedel, B. J., Chandra, V., Vijayanad, P., Seumois, G. A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. J. Vis. Exp. (162), e61617, doi:10.3791/61617 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image