用于大规模表观遗传学研究的半自动ChIP-Seq程序

拉霍亚过敏和免疫学研究所（LJI;IRB 协议编号SGE-121-0714）批准了这项研究。招募了健康志愿者，并在书面知情同意后提供白细胞分离术样本。 1. 细胞固定 将细胞悬浮液浓度降至1至2 x 106 个细胞/ mL，在15 mL管（<10 mL悬浮液）或50 mL管（10-30 mL细胞）中完整的细胞培养基。如果<1×106 个细胞，请在1.5 mL管中使用0.5mL培养基。 轻轻涡旋细胞悬浮液，滴加10x细胞固定缓冲液（1：10;vol：vol），并在室温（RT）下低速旋转10分钟。 通过轻轻涡旋停止反应，并以1：20（vol：vol）的比例加入2.5M甘氨酸。将管倒置几次，并在冰上孵育至少5分钟。 在4°C或冰上进行其余步骤。在4°C下以 800×g 旋转管5分钟并丢弃上清液。 用5 mL冰冷的1x PBS轻轻重悬沉淀，并在冰上孵育2分钟。 用1 mL冰冷的1x PBS重复1.4和1.5，并将样品转移到预冷的1.5 mL管中（标记为长期储存）。如果适用，建议制备等分试样。 在4°C下以1，200×g旋转管，并在不干扰细胞沉淀的情况下除去尽可能多的上清液。 在液氮中快速冷冻颗粒。储存在-80°C。注意：处理液氮时采取适当的保护措施。 2. 染色质剪切 注意：该方案针对在0.65mL低结合管中具有0.3至3×106 个细胞的沉淀物剪切进行了优化。 从-80°C取出带有冷冻细胞沉淀的样品管并储存在干冰上，以避免在加入裂解缓冲液之前沉淀的任何解冻。此步骤至关重要。 向沉淀中加入70μL新鲜的RT完全裂解缓冲液，并在室温下保持1分钟。 在不引入任何气泡的情况下重悬沉沉淀1分钟，然后在室温下孵育细胞悬浮液1分钟，然后将样品放在冰上。 将重悬的沉淀转移到0.65mL低结合管中并保持在冰上。注意：为了获得可重复的超声处理，在对样品进行超声处理之前，仅用空白管运行3-6个周期来预热超声仪。 将样品放入超声仪的管架中，并用装满70μL水的平衡管填充任何间隙。在开始超声处理之前，将样品留在水浴中约1分钟。 执行 x 个周期 （取决于细胞类型）的超声处理，每个周期 16 s ON / 32 s OFF。注意：此步骤需要验证实验来确定有效超声处理的最佳循环数。 每3个循环后，从超声仪中取出样品，轻轻涡旋并脉冲旋转管子，然后将其放回支架中。确保管外侧没有小液滴，因为这会导致气泡形成。 完成必要的循环后，在4°C下以>14，000×g旋转样品15分钟。 将上清液转移到新的，预冷却的，低结合的0.65mL低结合管中并保持在冰上。 对部分超声处理样品进行脱杂交联，以检查超声处理效率。 将1-7μL上清液（相当于约250ng剪切染色质）转移到0.2mL PCR管中，并在室温下用短期裂解缓冲液使体积达到10μL。 加入1μL RNase A，在37°C下以800rpm孵育30分钟，然后加入1μL蛋白酶K。 在55°C下孵育2小时，以1，000转/分振荡。 使用荧光定量测定法10 除去2μL脱交联样品进行DNA定量（不建议使用分光光度计，因为肥皂和降解的蛋白质会在结果中产生偏倚）。 将剩余的样品在1.2%琼脂糖凝胶上以70 V.用核酸染料（1：20，000）染色1小时，并使用UV透射仪读取凝胶。 制备染色质储备等分试样进行储存（用完全裂解缓冲液将样品稀释至20μL中的25ng / μL）。将所有剪切的染色质储存在-80°C。 3. 用于组蛋白修饰的自动 ChIP-Seq 注意：此协议设计为在 ChIP 液体处理程序上运行。虽然系统可以使用定制的缓冲液，但所有缓冲液都随 ChIP 套件一起提供。本节中使用的带有8个管的ChIP条是特定于ChIP液体处理器的。 将16个样品等分试样与500ng剪切的染色质从-80°C转移到20μL中，并将它们放在冰上以缓慢解冻染色质。一旦完全解冻，短暂涡旋和脉冲旋转。 染色质的制备 将100μL补充有1x蛋白酶抑制剂和20mM丁酸钠（完全tC1缓冲液）的tC1缓冲液移入两个ChIP 8管条中。 将每个染色质样品的20μL转移到含有100μL完整tC1缓冲液的ChIP 8管条的适当管中。通过将80μL完整的tC1缓冲液加入染色质管中来洗涤染色质管，然后将染色质管转移回ChIP 8管条的相应管中，最终体积为200μL。 抗体的制备 计算抗体的体积，使得每个管中含有0.5μg抗体。抗体体积 = （样本数 x 每个反应的抗体） / 抗体浓度 将计算出的抗体量加入500μLtBW1缓冲液中。快速涡旋和脉冲旋转。 将70μLtBW1移液到两个ChIP 8管条中，并将30μL抗体+ tBW1加入每个管中。这将使每个试管的总体积达到100μL。 磁珠的制备 彻底涡旋蛋白质A珠溶液。对于0.5μg抗体，将5μL微珠移液到一组新的ChIP 8管条中并脉冲旋转。 用标记的空 ChIP 8 管条填充 ChIP 液体处理装置的最后一行。 遵循 ChIP-16-IPure-200D 程序规范，将所有条带放置在 ChIP 液体处理器机器中。将缓冲液添加到正确的位置，但使用tW4而不是tE1缓冲液。注意：组织这一天，以便 ChIP 液体处理程序将在一夜之间执行 ChIP。该程序将运行约16小时，用于16个样品。这标志着第1天的结束。 4. 文库适配器转座酶集成，用于文库制备 将热混混器预设为 37 °C 和 500 rpm。冷却磁铁，在冰上放置0.2 mL管条。 对于16个样品，在冰上制备440μL标签缓冲液。将 53 μL 移液到单个新的 8 管条中，并保持在冰上。 在新的0.2 mL 8管试纸中，加入220μL冷tC1缓冲液并保持在冰上。8个条形管可以保持这个体积，并且仍然可以封盖。 从ChIP液体处理机（第12排）中取出”IP样品”试纸管，并在脉冲旋转之前盖上管子。使用磁铁捕获8管条2分钟的珠子，并小心地除去上清液。 将25μL标记缓冲液转移到具有多通道的磁珠中，从磁体中取出，然后轻轻混合，直到磁珠均匀（移液器设置为20μL时上下约5次）。 盖上管子，放入预热的热混合器中，孵育3分钟。增加时间会降低文库制备的效率。 将试管转移到冷却的金属架上，并向每个样品中加入100μL冷却的tC1缓冲液。将多通道移液器设置为80μL并混合样品，直到珠子均匀，停止标记反应。 将样品放回ChIP液体处理机中，然后继续 Washing_for_IP reacts_16_Ipure的洗涤程序。确保用tC1缓冲液洗涤两次，用tW4洗涤两次。洗脱应按照程序布局的标记完成，并带有缓冲液tE1。 DNA的脱杂交联 除去ChIP液体处理程序最后一行中的ChIP 8管条，并向每个样品中加入2μL RNase A。 盖上试管，脉冲旋转，用多通道移液器轻轻混合珠子，直到混合物均匀，然后重新盖上试管。 将样品在热混合器中在37°C和900rpm下孵育30分钟。 从热混合器中取出样品，加入2μL蛋白酶K.加入后遵循与4.9.2相同的步骤。 将样品在热混合器中孵育4小时，在55°C和1，250rpm下，然后在65°C下以1，000rpm过夜。注意：这是第 2 天的结束。 5. 标记DNA片段纯化 用适当的样品编号标记16个1.5 mL试管，并从DNA纯化试剂盒中加入400μL DNA结合缓冲液。 从热混合器中取出8管条，然后脉冲旋转条带，以确保保留任何蒸发的产品。将条带放在8条磁铁上以捕获珠子。 将100μL脱杂环联的DNA转移到每个1.5mL管中。将100μLDNA结合缓冲液加入8管条中以洗涤磁珠，然后转移到适当的1.5mL管中。 涡旋约10秒，脉冲旋转1.5 mL管。 在柱中加入含有DNA结合缓冲液和ChIP样品的600μL。 在10，000 x g下旋转样品20 s，然后用流出物重新加载色谱柱。在相同的条件下再次旋转并丢弃流出。 用200μL洗涤缓冲液洗涤柱两次（与前一步相同的离心），并丢弃流出物。 通过在12，000×g下离心2分钟来干燥色谱柱。 将色谱柱转移到新的1.5 mL收集管中，并将9μL温TE缓冲液（预热至55°C）直接加入柱基质中。让色谱柱孵育1分钟，然后在10，000×g下离心1分钟。 将9μL洗脱液转移到一组适当的新8管条中。 像以前一样用8μLTE缓冲液再次完成洗脱。将洗脱液转移到适当的8管条中（每个样品的最终体积17μL）并保持在冰上。 6. 纯化样品的扩增和尺寸选择 以下步骤使用qPCR确定最佳扩增所需的循环次数（CtD – Ct测定） 通过将CtD混合缓冲液的内容物乘以样品数量来为所有样品准备CtD混合物。 将3.6μLCtD混合物分配到qPCR板中，并加入1.4μL标记的DNA样品（约占总体积的10%）。执行以下 qPCR：98 °C 持续 3 分钟，72 °C 持续 5 分钟，98 °C 持续 30 秒，在 98 °C 下循环 26 次循环 10 秒，63 °C 持续 30 秒，72 °C 循环 30 秒。 通过将 AMP 混合缓冲液的内容量乘以样本数量，为所有样品准备 Amp 混音。将14μL标记的DNA分配到PCR板的单独孔中，然后向每个样品中加入2.5μL两个测序指数引物（25μM）（最终反应体积为50μL）。 通过多通道移液器混合样品，并以适当的循环次数执行CtD中使用的扩增程序。注意：这是一个很好的停止点，因为扩增的样品可以在-20°C下储存几周。但是，纯化可以在同一天完成。对于48个样品，步骤3 – 6.5与另外两个单独的批次一起完成，然后在一个批次中扩增，如下所述。 如下所述对标记的DNA进行扩增后、大小选择和定量。这通常可以用48个样品完成（可以根据需要用更少的样品完成）。 将90μL顺磁珠（1：1.8比例）加入每个孔中，混合，并使其在室温下孵育2分钟。 使用板磁铁捕获珠子并丢弃上清液。用200μL新鲜80%乙醇洗涤珠子3次，而不会破坏珠子沉淀。 最终洗涤后，用20μL吸头去除任何多余的乙醇，并将珠子干燥10分钟或直到珠丸中出现裂缝。 当板仍在磁铁上时，向每个孔中加入40μL预热的水。密封板，彻底涡旋，并短暂脉冲旋转板。 通过将板放回磁体上并将40μL洗脱转移到新的”样品”板中来捕获磁珠。样品现在被纯化，接下来的步骤浓缩了200-1，000 bp的片段。 可选的QC步骤：从样品中取出4μL并转移到QC板中。将4μL水倒回样品中。这决定了大片段的百分比。 向样品中加入22μL顺磁珠（1：0.55比例），小心混合，并在室温下孵育2分钟。 置于磁铁上捕获磁珠5分钟，并将上清液转移到”样品”板的柱7-12中。从磁体中取出板并加入30μL磁珠（最终比例为1：1.3）。仔细混合，让它在室温下静置2分钟。 捕获珠子5分钟，然后丢弃上清液。 如前所述，用200μL新鲜80%乙醇洗涤所有微珠3次（步骤6.6.2 – 6.6.3）。 一旦沉淀干燥，用8μL预热的TE缓冲液将DNA洗脱到每个孔中，同时仍在磁铁上。 从磁铁上取下板，密封并彻底涡旋。让板在室温下孵育2分钟，脉冲旋转，然后将板放回磁铁上2分钟。将上清液转移到新板（板2）。上清液中。 为了获得最大的回收率，用额外的8μL预热的TE缓冲液重复洗脱。将样品放入适当的孔中，使每个样品具有16μL的最终文库。注意：在此步骤结束时，应该有两个板（如果没有完成QC板，则一个板）。QC板将具有预先选择的片段，第二板应具有48孔的最终文库（总共16μL）。 7. 使用荧光测定法对最终文库和 QC 样品进行定量 使用荧光定量测定或类似方法完成DNA定量。 如果QC定量完成，则确定<1，000 bp的样品损失百分比。损失不应超过约20% – 如果损失更多，则应用的珠子比率可能存在问题。 确定每个样品的片段大小，优选使用毛细管电泳机。要计算摩尔浓度，请使用以下等式：[文库浓度（ng / μL）* 106]/[660 * 中位数片段大小（bp）]）。注：文库已准备好合并（等摩尔量）并按照标准的下一代测序程序进行测序。