Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala
Summary
Questo articolo descrive un protocollo ChIP-Seq semiautomatico e microscalato di regioni del DNA associate a una specifica modificazione degli istoni (H3K27ac) utilizzando una piattaforma di gestione dei liquidi ChIP, seguita dalla preparazione della libreria utilizzando la tagmentazione. La procedura comprende la valutazione del controllo ai fini della qualità e della quantità e può essere adottata per altre modificazioni istoniche o fattori di trascrizione.
Abstract
L’immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-Seq) è un approccio potente e ampiamente utilizzato per profilare il DNA della cromatina associato a specifiche modificazioni istoniche, come H3K27ac, per aiutare a identificare gli elementi del DNA cis-regolatori. Il processo manuale per completare un ChIP-Seq è laborioso, tecnicamente impegnativo e spesso richiede numeri di celle di grandi dimensioni (> 100.000 celle). Il metodo qui descritto aiuta a superare queste sfide. Viene descritta in dettaglio una procedura completa semiautomatica, microscalata H3K27ac ChIP-Seq che include la fissazione cellulare, il taglio della cromatina, l’immunoprecipitazione e la preparazione della libreria di sequenziamento, per un lotto di 48 campioni per input di numero cellulare inferiori a 100.000 cellule. La piattaforma semiautonoma riduce la variabilità tecnica, migliora il rapporto segnale-rumore e riduce drasticamente la manodopera. Il sistema può quindi ridurre i costi consentendo volumi di reazione ridotti, limitando il numero di reagenti costosi come enzimi, perline magnetiche, anticorpi e tempo pratico richiesto. Questi miglioramenti al metodo ChIP-Seq si adattano perfettamente a studi epigenetici su larga scala di campioni clinici con numero limitato di cellule in modo altamente riproducibile.
Introduction
L’ampio uso di saggi ChIP-Seq per determinare frammenti di DNA associati a specifiche modificazioni istoniche è in parte dovuto alla sua capacità di identificare elementi del DNA cis-regolatori, inclusi potenziatori attivi, promotori, silenziatori, eterocromatina e altri1,2,3,4. L’identificazione di regioni regolatorie non codificanti in tutto il genoma ha mostrato preziose informazioni per comprendere meglio la regolazione genica nella salute e nelle malattie4. Precedenti lavori del laboratorio hanno utilizzato ChIP-Seq per dimostrare che gli elementi cis–regolatori possono svolgere ruoli importanti in diversi tipi di cellule5. I saggi ChIP del fattore di trascrizione (TF) sono stati utilizzati per mostrare i polimorfismi a singolo nucleotide a rischio associato alla malattia6.
L’uso di ChIP-Seq con campioni clinici umani è impegnativo, principalmente a causa della limitazione del numero di cellule o del campione di tessuto desiderato. Di conseguenza, c’è stato uno sforzo concertato sul campo per migliorare e microscalare queste tecniche e, di conseguenza, sono emersi diversi saggi, come CUT & TAG5,7,8,9,10,11,12. Questo test utilizza una transposasi per il tagment e isola le regioni genomiche legate da un anticorpo specifico9. Questa tecnica è stata in grado di ridurre il numero di cellule fino a 1.000 e in alcuni casi a una singola cellula, tuttavia, l’uso di questa tecnica nella ricerca traslazionale e nell’impostazione clinica ha mostrato limitazioni dovute ai requisiti di utilizzo di cellule vive per questo metodo9,12. Il requisito delle cellule vive rende i campioni clinici logisticamente difficili da gestire e può introdurre effetti batch se i campioni non vengono elaborati contemporaneamente. Altri hanno ottimizzato le tecniche microscalate per le cellule fissate alla formaldeide, incluso lo sviluppo della ChIPmentation11, che è adattata qui in modo ad alto rendimento. L’uso di celle fisse consente di conservare i campioni fino alla raccolta e alla successiva elaborazione di tutti i campioni insieme per ridurre al minimo gli effetti del lotto.
Qui viene descritto un test ChIP-Seq microcalcato semiautomatico che riduce il tempo pratico sperimentale per profilare le modifiche degli istoni10. Il metodo semiautomatico consente saggi ChIP-Seq ad alto rendimento, consentendo di elaborare fino a 48 campioni completamente e pronti per il sequenziamento in appena 5 giorni, per un minimo di 10.000 cellule per campione utilizzando un gestore di liquidi ChIP. Il conduttore completa l’immunoprecipitazione (IP) e i successivi lavaggi in modo autonomo, il che aiuta a ridurre la variabilità tra i campioni. Il metodo semiautomatico riduce sia il tempo di intervento di oltre 15 ore per 48 campioni che la variabilità tecnica, consentendo di condurre studi epigenetici su larga scala in modo riproducibile e rapido per le cellule primarie o in coltura. Il protocollo spiega il processo dall’inizio alla fine per ChIP-Seq di alta qualità. Se le macchine specifiche non sono disponibili, il protocollo sarà comunque una risorsa utile per impostare e risolvere manualmente gli esperimenti ChIP-Seq.
Il test è stato eseguito con tre diversi tipi di cellule immunitarie umane primarie e una linea cellulare in coltura (HUT78 – ATCC: TIB-161). Per chiarezza, il protocollo è stato diviso in sette sezioni: fissazione cellulare, tosatura della cromatina tramite sonicazione, immunoprecipitazione automatizzata della cromatina, preparazione della libreria mediante tagmentazione del frammento di DNA, amplificazione della libreria, purificazione della biblioteca, seguita dalla quantificazione del DNA. Per le ricette tampone si rimanda alla Tabella supplementare 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto espande la procedura di ChIPmentation11, che implementa un protocollo di preparazione della libreria di tagmentazione prima della purificazione del DNA, automatizzando e microscalando il protocollo. Dall’inizio di ChIP-Seq, i numeri di cellule richiesti sono stati ridotti drasticamente, da circa 20 milioni di cellule per istoni fino a centinaia e persino singole cellule1,7,10,12,18,19,20,21. Questi metodi di nuova concezione hanno permesso una comprensione più profonda di come i meccanismi di regolazione cisstanno lavorando nelle cellule aumentando la sensibilità e consentendo di testare rare popolazioni di cellule cliniche5,6,12,17. Ad esempio, una delle procedure più recenti e popolari, chiamata CUT & TAG, come alternativa ChIP-Seq robusta e sensibile9. Produce un eccellente rapporto segnale-rumore in quanto l’enzima Tn5 è legato covalentemente alla proteina A e riconosce la catena Fc dell’anticorpo ChIP con elevata specificità9. L’attività di fondo dell’enzima Tn5 è ridotta in quanto l’enzima non è funzionale prima di legarsi all’anticorpo bersaglio9. Tuttavia, l’implementazione di questo metodo in un contesto clinico è limitata poiché richiede cellule vive non fisse. Inoltre, la rimozione di frammenti di DNA dal nucleo ipotonico potrebbe avere effetti negativi sulla cromatina in quanto viene rimossa durante il test. Il requisito necessario per lavorare con cellule fresche e viventi è una fonte di problemi per campioni clinici rari e per grandi coorti di campioni, poiché grandi coorti possono richiedere numerosi anni per raccogliere5. Un altro tipo di metodo, drop-ChIP, utilizza elegantemente un dispositivo di microfluidica per generare tagmention basati su goccioline prima di elaborare il ChIP19. Tuttavia, utilizza un dispositivo microfluidico altamente specializzato e, mentre è possibile completare ChIP-Seq a cella singola, è anche limitato all’uso di cellule vive7,8,9,18,19. Metodi più recenti che si basano su ChIP-Seq come PLAC-Seq o HiChIP, tentano di comprendere le interazioni a 3 dimensioni (3D) tra i picchi ChIP-Seq22,23. Questi metodi 3D sono entusiasmanti in quanto identificano le interazioni cis-regolatorieo TF mediate attraverso il genoma e migliorano la comprensione della regolazione dell’espressione genica nei tipi di cellule di interesse, nei tessuti sani e nel contesto della malattia.
Ci sono alcuni passaggi critici da considerare affinché il protocollo abbia successo, come la qualità della cromatina sonicata e la qualità dell’anticorpo. L’efficienza di taglio è fondamentale, se la cromatina non è sonicata bene, l’efficienza del saggio diminuisce drasticamente24. La sonicazione è un aspetto impegnativo di ChIP-Seq a causa dei numeri di cella richiesti. Sul sonicatore utilizzato nel protocollo, l’efficienza è stata drasticamente ridotta sotto le 300.000 celle. Questo è un aspetto impegnativo in ChIP-Seq in quanto sonicare sotto quel livello richiederebbe spesso una frammentazione enzimatica, che è meno imparziale. Di conseguenza, la sonicazione è un fattore limitato importante per il vero ChIP-Seq microscalato. Altre piattaforme di sonicazione e kit disponibili in commercio sono stati testati per la cromatina sonicante, ma il sonicatore utilizzato qui ha avuto i risultati più robusti e riproducibili. Un altro vantaggio del sonicatore è non dover acquistare tubi specializzati per eseguire la sonicazione, il che riduce i costi quando si tratta di un gran numero di campioni. Per una sonicazione ottimale, in primo luogo, è importante preriscaldare il sonicatore come descritto sopra. In secondo luogo, per lisare il pellet, si consiglia di avere la punta della pipetta che tocca il fondo del tubo durante la lisi per rompere le celle con più vincoli fisici. In terzo luogo, qualsiasi formazione di bolle prima della sonicazione ostacola la capacità del campione di essere sonicato in modo uniforme. Se ci sono bolle formate durante la lisi, è importante rimuoverle con una pipetta. Questo può essere impegnativo senza rimuovere molto campione, ma se la punta viene leggermente premuta contro la bolla può essere lentamente disegnata senza perdita di molto campione. Infine, quando si determina il numero di cicli, completare un percorso temporale in cui ogni tre cicli, il campione viene rimosso, purificato e eseguito su un gel di agarosio. Evitare la sonicazione eccessiva / insufficiente dei campioni in quanto ciò riduce l’efficienza ChIP. Se il campione è sotto sonicato, i frammenti di grandi dimensioni possono avere un effetto negativo sulla qualità ChIP-Seq24. D’altra parte, se il campione è troppo sonicato, c’è il rischio che l’epitopo bersaglio si perda nel processo.
Un’altra parte essenziale di ChIP-Seq è la qualità dell’anticorpo. Prima di eseguire qualsiasi studio su larga scala, è necessario ottimizzare l’anticorpo che verrà utilizzato. L’obiettivo è quello di ottenere un rapporto segnale/rumore significativamente elevato delle regioni conosciute del genoma e un altro è la riproducibilità. Se l’anticorpo sta tirando un sacco di segnale di fondo, potrebbe essere consigliato di utilizzare un ingresso più grande o provare un lotto / fornitore diverso. Questo aggiungerà tempo prima di iniziare un esperimento su larga scala, ma è un passo essenziale. Per testare il segnale-rumore si consiglia di utilizzare qPCR con regioni note per essere un bersaglio del vostro anticorpo e un’altra regione nota per essere assente. È stato notato che le modifiche agli istoni sono più robuste e più facili da ottimizzare rispetto ai TF.
Il protocollo sopra descritto fornisce un metodo robusto per la modifica degli istoni ad alto rendimento ChIP-Seq in modo semiautonomo e microscalato. Il metodo limita la quantità di tempo pratico e aumenta la riproducibilità rispetto al ChIP-Seq manuale. Precedenti studi completati in laboratorio utilizzavano manualmente ChIP su repliche tecniche e ottenevano una media di correlazione di Spearman di0,50 5,tuttavia, con il sistema semiautomatico, la correlazione di Spearman tra diversi donatori con una media di cellule NK di 0,66 (Tabella supplementare 2). Anche questo è stato completato con circa il 40% in meno di tempo pratico. Il metodo qui descritto è stato ottimizzato per le modifiche degli istoni (H3K27ac mostrato qui, ma il protocollo non dovrebbe aver bisogno di alcuna modifica per gli altri) e richiederebbe solo piccole modifiche per essere implementato per TF ChIP-Seq. Nonostante la qualità dell’anticorpo, la modifica principale sarebbe per il tempo di sonicazione e potenzialmente i tamponi utilizzati durante l’IP. Di solito, per i saggi TF ChIP, il metodo può funzionare meglio con frammenti leggermente più lunghi di cromatina (con un intervallo di circa 350-800 bp) poiché i complessi TF: DNA sono probabilmente meno in grado di essere mantenuti attraverso una rigorosa sonicazione6. I buffer potrebbero anche dover passare a un mix personalizzato o ad altri kit disponibili nel settore, poiché i TF possono comportarsi in modo diverso rispetto alle modifiche degli istoni.
Sebbene il gestore automatico di liquidi ChIP sia stato testato per un minimo di 10.000 cellule, c’è stata una notevole diminuzione della riproducibilità a concentrazioni di cromatina più basse. A causa di ciò, il protocollo non è stato raccomandato a meno di 10.000 cellule, con 100.000 cellule che sono le condizioni ottimali. Il protocollo è stato anche completato utilizzando buffer ChIP del settore, che era una spesa aggiuntiva ma forniva dati di qualità superiore. Il protocollo potrebbe essere modificato per quanto riguarda le condizioni di sonicazione (purché la cromatina tranciata sia mantenuta all’interno dello stesso intervallo), i tamponi potrebbero essere personalizzati per l’immunoprecipitazione (IP; potrebbe essere necessaria l’ottimizzazione) o il gestore di liquidi ChIP potrebbe non essere utilizzato. Una limitazione del protocollo è l’uso del gestore di liquidi ChIP, che può essere un investimento costoso e può eseguire solo 16 campioni contemporaneamente. Il gestore di liquidi ChIP è limitato a reazioni su piccola scala e il numero di cellule superiore a un milione non è raccomandato. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere completato senza di esso, completando l’IP e lavando manualmente i passaggi. Se l’IP e i lavaggi sono stati completati a mano, il tempo per completare il test aumenterà e la riproducibilità potrebbe diminuire, ma questa guida sarà comunque utile per eseguire un esperimento ChIP-Seq di alta qualità. Da notare, altri gestori di liquidi potrebbero essere adattati per eseguire reazioni ChIP semiautomatiche.
Per riassumere, i principali vantaggi di questo sistema sono la natura ad alta produttività, poiché l’IP e le fasi di lavaggio sono completate autonomamente. Pertanto, è possibile completare cicli sequenziali di esperimenti ChIP, consentendo di elaborare fino a 48 campioni e pronti per il sequenziamento in 5 giorni, con un tempo pratico limitato rispetto agli esperimenti Manuali ChIP-Seq. Un altro vantaggio è la maggiore riproducibilità poiché ChIP-Seq può essere difficile ottenere risultati altamente riproducibili. Altri metodi richiedono cellule vive, complessi sistemi di microtubaggio o il lavoro da completare tutto a mano. Questo sistema dovrà essere ottimizzato per campioni a basso input (<10.000 celle), consentendo in definitiva reazioni ChIP a cella singola. Il sistema è anche in grado di essere adattato per i nuovi metodi ChIP, come PLAC-Seq e HiChIP22,23.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Vijayanand per l’aiuto tecnico e le discussioni costruttive e il Dr. Sharron Squazzo e il Signor Geoffrey Berguet di Diagenode per l’assistenza tecnica con il sonicatore e la macchina e i protocolli chIP per il trattamento dei liquidi. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) e S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).
Materials
| 200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips | Diagenode | C30020002 | Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip |
| AMPure XP for PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | SPRI beads |
| Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-060-C | 0.65 mL low binding tube |
| Bioruptor Pico Sonicator | Diagenode | B01060010 | Sonicator used in the lab but others can be used |
| ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) | Zymo Research | D5205 | DNA clean-up kit |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | ThermoFisher | 10001D | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | ThermoFisher | AM9260G | |
| EGTA pH 8.0 | Millipore Sigma | E3889-25G | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000667 | |
| Formaldehyde solution | Millipore Sigma | 252549-1L | |
| Glycine | Millipore Sigma | 50046-250G | |
| H3K27ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410196 | |
| HEPES (1 M) pH 7.5 | ThermoFisher | 15630080 | |
| IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes | Illumina | 20027213 | |
| Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit | Illumina | 20034197 | |
| IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 | PCR mix |
| Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact | Diagenode | C30020003 | |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher | R0971 | |
| N,N-Dimethylformamide | Millipore Sigma | D4551-250ML | CAUTION – low flash point |
| NaCl (5 M), RNase-free | ThermoFisher | AM9760G | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | |
| PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps | USA Scientific | 1402-4700 | 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | Millipore Sigma | P8340 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| PureLink RNase A (20 mg/mL) | ThermoFisher | 12091021 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher | P7581 | Used in the flourescence quantification |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4485699 | qPCR |
| ROX Reference Dye | ThermoFisher | 12223012 | |
| Sodium butyrate | Millipore Sigma | 303410-100G | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher | S11494 | nucleic acid dye |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X concentrate in DMSO | ThermoFisher | S7563 | |
| TE Buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| Tips (bulk) | Diagenode | C30040020 | Tips for the IP Star |
| True MicroChIP Kit | Diagenode | C01010130 | Contains all the buffers for the IP; ChIP kit |
| UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 |
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