Summary

穆林切除伤口愈合模型与组织学形态性伤口分析

Published: August 21, 2020
doi:

Summary

该协议描述了如何在小鼠中生成双边全厚度切除伤口,以及如何随后监测、收获和准备伤口以进行形态分析。其中包括一个深入的描述,说明如何使用串行组织学部分来定义、精确量化和检测形态缺陷。

Abstract

穆林切除伤口模型已被广泛使用,用于研究伤口愈合的每个连续重叠阶段:炎症,增殖和重塑。Murine 伤口具有组织学上定义明确且易于识别的伤口床,这些不同阶段的愈合过程是可测量的。在该领域,通常使用任意定义的伤口”中间”进行组织学分析。然而,伤口是一个三维实体,往往不是组织对称的,支持需要一个定义明确和稳健的定量方法,以检测小效果尺寸的形态缺陷。在该协议中,我们描述了在小鼠中创建双边全厚度切除伤口的过程,以及有关如何使用特定序列部分的图像处理程序测量形态参数的详细说明。伤口长度、表皮长度、表皮面积和伤口面积的两维测量与各部之间的已知距离相结合,以推断覆盖伤口、整体伤口面积、表皮体积和伤口体积的三维表皮面积。虽然这种详细的组织学分析比常规分析更耗时和资源,但其严谨性增加了在固有的复杂伤口愈合过程中检测新表型的可能性。

Introduction

皮肤伤口愈合是一个复杂的生物过程,连续重叠阶段。它要求协调在时间和空间上调节的细胞和分子过程,以恢复受损上皮的屏障功能。在第一阶段,炎症,嗜中性粒细胞和巨噬细胞迁移到伤口,调动局部和全身防御1。炎症阶段的跟随和重叠是增殖阶段。成纤维细胞开始迅速增殖并迁移到造粒组织中。角膜细胞远离前缘方向扩散到伤口,因为前缘的分化角细胞迁移至伤口2的再上皮化。最后,改造和成熟阶段开始,在此期间,造粒组织中的成纤维细胞开始合成和沉积胶原蛋白。新矩阵的改造和组织可以持续长达1年后受伤3。由于涉及多种细胞类型交谈的重叠事件的复杂性,尽管经过多年的研究,许多细胞和分子机制的基础伤口愈合仍然不太了解。

小鼠模型是研究伤口愈合机制的主要哺乳动物模型,由于其易用性,相对较低的成本和遗传操纵1,4,5。虽然在穆林模型中描述了不同类型的伤口,但最常见的是切除伤口(双边冲孔或直接打孔活检),其次是切口伤口模型4。切除伤口模型比切口模型有明显的优势,因为它固有的产生控制组织,没有经过愈合过程。作为手术方案的一部分切除的冲孔活检组织可以与受伤组织相同的方式进行处理,并用于确定所需标准的恒时条件。如果评估皮肤预处理的效果或在受伤时确认成功的基因改变,可切除控制组织也很有用

治疗参数可以通过许多不同的技术进行评估,包括平面学或组织学。然而,平面测量只能评估伤口的可见特征,由于有疤痕的存在,往往与组织学所可视化的愈合测量不相关,从而使组织学成为分析4的”黄金标准“。尽管组织学分析是金本位标准,但它通常对伤口6、7的任意集进行。例如,在嵌入和切段伤口之前将伤口切割到”一半”是目前常见的做法,以减少用于分段材料和数据分析所花费的时间和资源。本协议中描述的形态分析方法被开发为包括整个伤口组织,准确反映伤口的形态特征,并增加检测伤口愈合缺陷的可能性,效果较小。在该协议中,我们详细介绍了产生最常研究的穆林伤口的手术方法、双边全厚切除伤口,以及一种详细而严格的组织学分析方法,这种方法在实地很少使用。

Protocol

所有实验都按照联邦法规完成,爱荷华大学的政策和程序已获爱荷华大学 IACUC 批准。 1. 畜牧业 在毛囊阶段为细胞原时,在8-10周大时使用所需小鼠线的成年小鼠。 在手术当天,将老鼠分开进入干净的笼子和单独的房子,以尽量减少伤口的破坏。 2. 手术 注:没有必要保持无菌的手术条件。虽然应注意保持动物之间的…

Representative Results

图5描述了通过对多个外科医生在不同小鼠菌株中产生的野生型伤口进行形态分析,并由不同个体进行分析,获得的测量和计算值的范围。不同菌株的野生小鼠可以显示统计差异,如我们的研究和文献9,10所述。根据这些具有代表性的结果,我们建议在一项研究中,只使用一种菌株的小鼠。虽然我们建议同一个人在特定研究中执行?…

Discussion

双边切除伤口模型是一种高度可定制的程序,可用于研究伤口愈合的许多不同的方面。在开始伤口愈合项目之前,调查人员应执行功率分析,以确定检测特定效果大小的缺陷所需的伤口数量。文献中对于单个小鼠或伤口是否应用作生物复制,存在不一致之处,然而,最近的一项研究表明,单个动物4上的两个伤口之间没有显著的相关性。这表明,单个动物的伤口彼此独立,可以被…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢邓恩瓦尔德实验室的所有成员,他们多年来为优化该协议做出了贡献,并感谢吉娜·沙特曼,他坚持推广使用串行分段进行伤口分析,使该协议的创建成为可能。这项工作得到了国家卫生和、国家艾滋病和国家卫生系统向马丁·邓恩瓦尔德(AR067739)的资助。

Materials

100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

Referenzen

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

View Video