革兰阴性细菌败血症的新生儿成像模型
Summary
新生儿小鼠感染生物发光大肠杆菌O1：K1：H7导致败血症感染，引起严重的肺部炎症和肺部病理。 在这里，我们描述了使用纵向病毒内成像对新生儿败血症进行建模和进一步研究的程序，同时列举全身细菌负担、炎症特征分析和肺组织病理学。
Abstract
新生儿在生命最初几个月表现出独特的免疫特征，因此患细菌败血症的风险增加。我们已经建立了一个协议，用于研究 大肠杆菌 O1：K1：H7的发病机制，这是一种对新生儿高死亡率负责的血清型。我们的方法利用在感染过程中不同时间点的新生儿幼崽的病毒内成像。这种成像与血液中细菌的测量、炎症特征和组织组织病理学的测量平行，意味着对败血症期间的感染动态的严格理解。在本报告中，我们模拟了两种传染性接种，以比较细菌负担和疾病严重程度。我们发现，亚皮外感染导致感染后10小时传播感染。到24小时，发光 大肠杆菌的感染在 血液、肺和其他周围组织中是丰富的。肺部炎症细胞因子的表达在24小时时显著，随后是细胞渗透和组织损伤的证据，随着感染剂量的增加。病毒内成像确实有一些局限性。这包括发光信号阈值和麻醉期间新生儿可能出现的一些并发症。尽管存在一些局限性，我们发现我们的感染模型为了解新生儿毛虫败血症期间的纵向感染动态提供了见解，而迄今为止，这种感染模型尚未经过彻底检查。我们预计这个模型也可以适应研究其他关键的细菌感染在早期生活。
Introduction
细菌败血症是新生儿的一个重大关注，在生命的最初几天表现出独特的免疫特征，不能提供足够的保护，免受感染1。新生儿败血症仍然是美国严重的医疗保健问题，仅美国每年就有75，000多例。为了深入研究这些感染，需要新的动物模型来概括人类疾病的各个方面。我们已经建立了一个新生儿小鼠感染模型使用大肠杆菌，O1：K1：H73。大肠杆菌是导致美国新生儿败血症的第二大原因，但占败血症相关死亡率的4，5。然而，当早产儿和极低出生体重（VLBW）婴儿被独立考虑5时，这是主要的原因。K1血清型最常与侵入性血液感染和脑膜炎在新生儿6，7。目前，除了抗生素和支持性护理之外，没有其他治疗选择。同时，许多致病菌的抗生素耐药率继续上升，一些大肠杆菌菌株对治疗中常用的多种抗生素具有耐药性。因此，我们必须继续制定方法，研究新生儿败血症的机制和宿主反应。这些结果可以帮助改善目前的治疗和感染结果。
与成人相比，新生儿的免疫状态具有表型和功能差异的特点。例如，抗炎和调节细胞因子的升高水平，如白细胞间（IL）-10和IL-27，已被证明由脐带血衍生的巨噬细胞产生，并存在于更高水平的穆林新生儿9，10，11。这与与成人10 α中经常报告的Α、IFN-ɣ、IL-12和TNF-α水平一致。此外，与12岁的成年人相比，新生儿免疫系统偏向于Th2和调节T细胞反应。新生儿中也存在增加的嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，但有显著的功能损伤。这包括细胞表面标记和抗原表达的缺陷，表明不成熟13，14，15。此外，新生儿中性粒细胞在迁移到化疗因子16的能力上明显不足。骨髓源抑制细胞（MDSC）在新生儿的高水平也被发现，最近被证明是IL-2711的来源。MDSC对T细胞17具有很强的抑制性。总的来说，这些数据表明新生儿免疫力有限，增加了感染的易感性。
为了研究新生儿败血症期间细菌负担的进展和保护性宿主免疫反应，我们开发了一种新的感染模型。新生儿小鼠在3-4天的生活是很难注射在内皮内空间或尾静脉。在我们的模型中，第3天或第4天幼崽被施用细菌注射或PBS皮下到肩骨区域。全身感染的发展和使用发光 大肠杆菌 O1：K1：H7，我们可以纵向成像个别新生儿小鼠，以遵循周围组织传播的细菌负担。这是首次报告模型，利用病毒内成像，以了解在穆林新生儿3败血症期间传播细菌的动力学。
在这里，我们描述了一个在新生儿小鼠3 中 诱导化粪池大肠杆菌感染的协议。我们描述了如何为注射准备细菌注射的内分，以及如何收获组织以评估病理学，通过基因表达分析测量炎症标记，并枚举细菌负担。此外，还介绍了使用发光 大肠杆菌对 受感染的新生儿进行病毒内成像和新生儿免疫细胞细菌杀伤的定量。这些协议也可以适应研究新生儿的其他重要的细菌感染。此处提供的数据代表了在可翻译的新生儿败血症模型中理解感染动态的总体新方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
我国诱导新生儿小鼠细菌败血症的亚帽感染模型是实时研究细菌病原体纵向传播的一种新方法。病毒内成像为探索新生儿中细菌实时传播提供了机会。这对于了解细菌传播的动力学和进一步研究宿主反应和疾病适当阶段的损伤至关重要。小鼠幼崽被施用皮下，下皮注射细菌性结节。这种注射技术比其他常用的替代品（如尾静脉和内皮内感染）更简单，因为它在注射部位内需要的精度较低。考虑到?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了C.R..M的支持。
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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