JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

Published: May 15, 2021
doi:
10.3791/61575
, , , , , ,
1Department of Immunology,University of São Paulo, 2Department of Medicine, Nephrology Division,Federal University of São Paulo

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) ב זברה-דג מבוגר באמצעות ציספלטין כסוכן נטרוקסי. פירטנו את השלבים כדי להעריך את הרבייה של הטכניקה ושתי טכניקות לניתוח דלקת ומוות תאים ברקמת הכליה, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL, בהתאמה.

Abstract

ציספלטין משמש בדרך כלל ככימותרפיה. למרות שיש לו השפעות חיוביות אצל אנשים שטופלו בסרטן, ציספלטין יכול בקלות לצבור בכליה בשל המשקל המולקולרי הנמוך שלה. הצטברות כזו גורמת למוות של תאים צינוריים ויכולה לגרום להתפתחות של פגיעה בכליות חריפה (AKI), המאופיינת בירידה מהירה בתפקוד הכליות, נזק לרקמות וחדירה לתאי החיסון. אם ניתנת במינונים ספציפיים ציספלטין יכול להיות כלי שימושי כמו AKI inducer במודלים בעלי חיים. דג הזברה הופיע כמודל מעניין לחקר תפקוד הכליות, התחדשות הכליות ופציעה, שכן מבני כליות משמרים קווי דמיון תפקודיים עם יונקים. דג זברה למבוגרים מוזרק עם ציספלטין מראה ירידה בהישרדות, מוות תאי כליות, סמנים דלקת מוגברת לאחר 24 שעות לאחר הזרקה (hpi). במודל זה, חדירת תאים חיסוניים ומוות תאים ניתן להעריך על ידי cytometry זרימה ו- TUNEL assay. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לגרום AKI ב זברה למבוגרים על ידי הזרקת ציספלטין תוך-אישית ולאחר מכן מדגים כיצד לאסוף את רקמת הכליה לעיבוד cytometry זרימה ומוות תאים TUNEL assay. טכניקות אלה יהיה שימושי כדי להבין את ההשפעות של ציספלטין כסוכן nephrotoxic יתרום להרחבת מודלים AKI ב זברה למבוגרים. מודל זה יכול לשמש גם כדי ללמוד התחדשות כליות, בחיפוש אחר תרכובות המטפלות או למנוע נזק לכליות וללמוד דלקת ב- AKI. יתר על כן, השיטות המשמשות בפרוטוקול זה ישפרו את האפיון של נזק לרקמות ודלקת, שהן מטרות טיפוליות בתחלואה הקשורה לכליות.

Introduction

הכליות אחראיות על מספר פונקציות פיזיולוגיות חשובות השומרות על הומאוסטזיס, כגון סינון דם, הסרת שאריות עודפות ורגולציה של ריכוזי היונים1. נזק של רקמת כליות יכול להוביל למצב הטרוגניים הנקרא פגיעה בכליות חריפה (AKI), אשר קלינית מתוארת כירידה מהירה בתפקוד הכלייתי הנגרמת על ידי הרס ומוות של תאי אפיתל צינורי, פגיעה בתאי אנדותל, וחדירת לויקוציטים 2,3. AKI הוא מצב צפוי לקרות 8-16% של אשפוז בבית החולים4, עם שיעור תמותה גבוה הנע בין 20 ל 50% ביחידה לטיפול נמרץ (ICU)5. מחלות אלה קשורות להגברת השהות בבית החולים ולשימוש ניכר במשאבים כספיים5. גורמים אציולוגיים כוללים התייבשות, הלם, זיהומים, אלח דם, מחלות לב וכלי דם, ותרופות nephrotoxic6. Nephrotoxicity מוגדר כפגיעה בכליות הנגרמת על ידי סמים, גרימת השפעות כמו AKI, tubulopathies, ו גלומרולופתיות7. Nephrotoxicity משפיע על שני שלישים של חולי טיפול נמרץ, כמו כ 20% של תרופות שנקבעו בטיפול נמרץ נחשבים nephrotoxic8,9, זה כולל תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידים (NSAIDs), אנטיביוטיקה כגון vancomycin ו aminoglycosides, וסוכנים כימותרפיים כמו מטוטרקסט וציספלטין7. ציספלטין היא אחת התרופות הכימותרפיות החזקות והנפוצות ביותר, המשמשות לטיפול בגידולים מוצקים, כגון ראש וצוואר, אשכים, שחלות ושלפוחית השתן10. בכליה, ציספלטין מופנם בצינור המפותל הפרוקסימלי (PCT) באמצעות טרנספורטר קטיוני אורגני 2 (OCT-2) ובריכוזים גבוהים נקשר ל- DNA המפעיל מסלולי מוות של תאים7,10,11,12. הצטברות של תרופה זו בכליה תורמת nephrotoxicity עם מוות ודלקת13. תופעת לוואי מזיקה זו משפיעה מאוד על החיים ועל הפרוגנוזה של שליש מחולי הסרטן העוברים טיפול ציספלטין, ולכן הוא הכרחי המחקר של טיפולים חדשים שיכולים להוריד את nephrotoxicity מבלי לאבד את ההשפעה הרג על תאים סרטניים10.

בגלל אפקט נפורוטוקסי זה, ציספלטין משמש בדרך כלל משרן של AKI במודלים ניסיוניים של בעלי חיים, כמתואר קדימה. במכרסמים, מודל AKI הראשון המושרה על ידי ציספלטין דווח בשנת 197114 אבל כרגע, פרוטוקולים רבים ושונים הופיעו באמצעות ההשפעות תלויות המינון המצטבר של ציספלטין15. ובכך, בהתאם המינון ומספר הבקשות, ציונים שונים של חומרת פגיעה בכליות יכול להיות המושרה16,17,18,19,20,21. השיטה השכיחה ביותר מורכבת זריקה תוך-פיטונית (i.p. ) של מנה אחת של ציספלטין ואחריו המתת חסד בימים הבאים. בפרוטוקול קלאסי זה, מנה נטרוקסית גבוהה אחת של ציספלטין (10-13 מ”ג/ק”ג בעכברים ו/או 3-8 מ”ג/ק”ג בחולדות) גורמת לשינויים היסטולוגיים חמורים, כגון אובדן גבול מברשת ופסולת תא בתוך לומן צינורי, כמה ימים לאחר הזרקת ציספלטין. חומרת השינויים ההיסטולוגיים תלויה במינון, וסימני התחדשות נצפו 7 ימים לאחר הזרקת ציספלטין16,17.

למרות מודלים מכרסמים מבוססים היטב, החלטנו לנצל את המאפיינים של בעלי חוליות אחר, מיקוד המחקרים שלנו על זברה (דניו rerio). דג זה שימש בהרחבה למידול מחלות אנושיות, בשל גודלו הקטן, הפריה חיצונית, שיעורי רבייה גבוהים, התפתחות מהירה, שקיפות העוברים והזחלים, עלות תחזוקה נמוכה, אנטומיה דומה ליונקים (למעט כמה יוצאים מן הכלל), יכולת התחדשות רקמות גבוהה, התנהגות חברתית, 70% מהדמיון הגנטי עם בני אדם ו -84% עם גנים הקשורים למחלות אנושיות22. Streisinger et al.23,24,25 החלו את המחקרים עם זברהפיש שאישרו את הפרקטיקה של ניצול אורגניזם מודל זה לניתוח גנטי של התפתחות בעלי חוליות. במחקר כליות, דג הזברה התפתח לא רק במחקרים התפתחותיים אלא גם ככלי גנטי בחיפוש אחר גנים חדשים הקשורים לתנאי כליות26. יתר על כן, היכולת של התחדשות ללא היווצרות צלקת ואת היכולת ליצור nephrons דרך חייהם, הנקרא neonephrogenesis, להפוך את זברה דג מודל חיה מפתח למחקרהתחדשות 27,28. יתר על כן, הזמינות של מודלים ניסיוניים למחלות כליות שונות, כולל פגיעה בכליות חריפה וכרונית, מדגימה את הרבגוניות של האורגניזם הניסיוני הזה26,29. כמו ביונקים, אבות הכליות של דג הזברה נגזרים מהמזודרם המתווך. אבות כליות כאלה ליצור את נוטה כי מאוחר יותר לפתח mesonephros, אשר יישמרו כמו איבר בוגר עדהבגרות 29,30.

הכליה הבוגרת של דג הזברה ממוקמת על דופן הגב של הגוף, בין שלפוחית השחייה לעמוד השדרה29. מנקודת מבט גחונית, ניתן לחלק את דג הזברה לשלושה אזורים (איור 1A):ראש (H), תא מטען (Tr) וזנב (Ta)29. בדומה ליונקים, דג הזברה כולל את הנפרונים כיחידות פונקציונליות של הכליה, המחולקות למקטעי צינורית(איור 1A):קורפוסקל כליות (RC), צינורית מפותלת פרוקסימלית (PCT), טובולה ישרה פרוקסימלית (PST), דיסטל מוקדם (DE), דיסטל מאוחר (DL) ואיסוף צינורית (CD)29. זברה-פיש חולקת שימור גנטי ודמיון מבני עם נפרונים אנושיים (איור 1B), אך חסרה להם קונפורמציות מסוימות כגון צינורית הביניים, הידועה גם בשם הלולאה של הנל (LH)29,31. דגי מים מתוקים כמו דגי זברה מוקפים בדרך כלל במדיום עם אוסמולריות נמוכה מאוד, בגלל זה, הם נוטים להיות hyperosmotic ותלויים הזימים, העור בשלבים מוקדמים, ואת הכליה כדי לווסת את osmolarity ואת הפרשת מים32. סינון הדם מאב העורקים הגבי על ידי נוטה מתחיל סביב 48 שעות לאחר ההפריה (hpf)33,34. הכליה של דג הזברה היא לא רק איבר הפרשת פסולת מטבולית, אלא גם פועלת כאיבר hematopoietic מ 4 ימים לאחר ההפריה (dpf) לבגרות וזה שווה למח העצם ביונקים35. במהלך הפיתוח, תאי גזע hematopoietic (HSCs) יהיה לזרוע את הכליה, לשפץ את עצמו, וליצור שושלת מיאלואידית, אריתרואיד, תאי הלימפה, שמירה על גורמי שעתוק, מולקולות איתות, ותוכניות גנטיות שמורות מאוד עם יונקים36,37. מחקרים גילו כי רוב תאי אריתרואיד, תרומבוציטיקה, מיאלואידים ולימפואידים של מערכת החיסון האנושית נמצאים בזברה פיש37,38. המאפיינים הייחודיים של בעל חיים זה והתכונות השמורות עם הכליה האנושית הפכו את המודל הזה לאורגניזם יתרון במחקר של תפקוד הכליות, פציעה והתחדשות.

למרות שהכליה של דג הזברה נחקרת היטב וכמה דגמים של AKI כבר זמינים בזחלים ובזברפיש בוגר28, בזמן הקמת פרוטוקול זה לא היו ראיות למודל AKI שאינו אנטיביוטי המושרה כימית בזברה דג מבוגר. חוץ מזה, המעבדה שלנו מתמקדת בבדיקת חיידקים פרוביוטיים ותרכובות שמקורן במיקרוביוטה כדי לחקור התחדשות ונזק לכליות, ובכך ריכזנו את מאמצינו ביצירת מודל AKI חדש המושרה על ידי ציספלטין בדגים בוגרים. מאמר הווידאו המוצג בכתב יד זה מדגים את ההליכים לדגם חדש של אינדוקציה AKI באמצעות הזרקת i.p. של 120 UG ציספלטין לכל גרם של בעלי חיים (120 מיקרוגרם / גרם)(איור 2A). מינון זה התבסס בתחילה על מחקרים של AKI המושרה על ידי ציספלטין במודלים מורין כי הלך סביב 10 מ”ג / קילוגרם (שווה ערך 10 מיקרוגרם / גרם)14,15,16,17, עם זאת, מינון זה לא היה מספיק כדי לגרום נזק לכליות הקשורות nephrotoxicity (נתונים לא הראו). לכן, הגדלנו את המינון לאלה המשמשים במחקר זה (איור 2B). העבודה שלנו חשפה השפעה תלוית מינון של ציספלטין בשיעור ההישרדות לאחר הזרקה עם אינדוקציה של נזק לרקמת הכליה 24 hpi כפי שמוצג על ידי אובדן מבנה צינורי, הסתננות דלקתית מוגברת, ושיעור גבוה של מוות תאי. כאן, אנו מתארים שתי טכניקות לניתוח ההתפתחות של AKI הנגרמת על ידי ציספלטין: ציטומטריית זרימה, כדי לנתח חדירת תאים, ו TUNEL, כדי למדוד מוות של תאים. ציטומטריית זרימה היא טכנולוגיה המודדת את המאפיינים הפיזיים (גודל וצפיפות) וכימיקלים (תרכובות פלואורסצנטיות) של התאים. בתוך הסייטומטר התא עובר דרך נוזל נדן שמארגן את התאים בשורה אחת, ומאפשר להם לעבור דרך קרן לייזר תא אחד בכל פעם(איור 3A). גלאי מול קרן האור ימדד את הפיזור הקדמי (FSC), אשר מתואם עם גודל התא, וגלאים בצד ימדדו את פיזור הצד (SSC) המתאם לצפיפות התאים. גלאים אחרים ימדדו את הפלואורסצנטיות מחלקיקים, חלבונים פלואורסצנטיים או תאים המסומנים בנוגדנים39,40. כמו נוגדנים מסחריים עבור דגי זברה הם נדירים כיום, השימוש כתבים בעלי חיים סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים מאפשר לשפר את הניתוח הזה ולזהות אוכלוסיות תאים מגוונות41,42,43. כלי נוסף ששימש בפרוטוקול זה היה מסוף deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL) assay. בדיקת TUNEL היא שיטה לגילוי אפופטוזיס בשלב מאוחר המסתמכת על היכולת של ה- TdT לזהות דנ”א מקוטע ולתייג אותו עם deoxynucleotides מתויג עם סמן פלואורסצנטי שמאוחר יותר ניתן לדמיין ולכמת על ידי מיקרוסקופיה44 (איור 3B). בהתחשב בכך שאחת התכונות הבולטות ביותר של AKI היא אינדוקציה של אפופטוזיס בתאי כליות שחפת3, טכניקה זו היא יתרון מאוד שכן ניתן לנתח אותה על ידי cytometry זרימה ו / או מיקרוסקופיה.

הגישות המוצגות במאמר זה מאפשרות תצפית על מצב AKI ומציעות מודל אקוטי חדש ללמוד הפרעות AKI שיכולות להיות שימושיות למחקר של מטרות טיפוליות חדשות ב- AKI הקשורות לציספלטין.

Protocol

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו בעבר לשימוש במודל הזברה על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים של אוניברסיטת סאו פאולו. 1. אינדוקציה AKI על ידי הזרקה תוך-פריטונית ציספלטין הכן פתרון עבודה ציספלטין על ידי דילול פתרון המניה ל 850 מיקרוגרם / מ”ל ב 0.9% NaCl. יש לשמור על טמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור.התראה: הבד ממליץ על מניפולציה של ציספלטין עם ציוד מגן אישי (PPE) כולל משקפי מגן, כפפות וחלוק מעבדה. אחסן את פתרון המלאי בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. הכן 150 מ”ג / L MS-222 (Tricaine) הרדמה במים מערכת45. להרדים דג זברה בוגר (5-9 חודשים) על ידי טבילה במשך כ 1-2 דקות.הערה: דגים מורדמים ביעילות צריכים להיות חסרי אחריות למגע. כדי לבדוק הרדמה יעילה, לחץ בעדינות על סנפיר caudal כדי להתבונן בתגובה.התראה: Tricaine הוא מגרה את העור והעיניים, להשתמש PPE כדי לתפעל. באמצעות כף פלסטיק להעביר את הדג למשטח סופג, כגון מגבות נייר, כדי להסיר מים עודפים סביב הגוף. לאחר מכן, עם כף הפלסטיק להעביר את הדגים לצלחת פטרי על פני סולם ולשקול את הדגים. שימו לב למשקל הדג כפי שהוא יהיה נחוץ עבור חישובי מינון.הערה: ספיגת מים עודפים מדגים מונעת הערכת יתר של משקל החיה, אין לייבש יתר על הסף שכן היא משוחדת לדגים. כדי להשיג את המנה הסופית של 120 מיקרוגרם / גרם של משקל, לחלק את המיקרוגרם של המנה הסופית (120 מיקרוגרם) לכל מיקרוגרם של פתרון העבודה ציספלטין (850 מיקרוגרם) ולהמיר מספר זה microliters (μL) על ידי הכפלה עבור 1000, כדי לקבל את הנפח של 120 מיקרוגרם של ציספלטין (141.2 μL). לאחר מכן הכפל מספר זה (141.2 μL) עבור משקל הדג (g) כדי לקבל את הנפח הסופי להיות מוזרק. עם כף פלסטיק, להעביר את הדג על ספוג רטוב עם חתך קטן להחזיק אותו, עם הצד הגחוני למעלה. הספוג צריך להיות רטוב עם הרדמה במים המערכת. מלא מזרק אינסולין 31 G 1.0 מ”ל עם נפח מחושב של פתרון עבודה ציספלטין. הכנס את המחט לחלק התוך-פריטוני של החיה ליד סנפיר האגן, בזווית רדודה כדי למנוע ניקוב הקרביים(איור 2A). ואז לאט להזריק את הפתרון. לאחר ההזרקה מניחים את הדג במיכל כדי להתאושש מהרדמה. צפה בדגים סימנים של התאוששות נורמלית(למשל, תנועות שחייה, תנועות ניתוח).הערה: החיה צריכה להתאושש ב 3-5 הדקות הבאות. במידת הצורך, לעורר את הדג על ידי הזזת אותו עם כף פלסטיק, פיפטה פלסטיק פסטר, או לשים אותו קרוב צינור עם בועות. עבור דג בקרה, לבצע את אותו הליך על ידי הזרקת פתרון של 0.9% NaCl. השתמש באותו חישוב בעקבות היחס של משקל הגוף: נפח להיות מוזרק יהיה 141 μL מוכפל על ידי המשקל של הדג (g). לפקח על הישרדות הדגים לפחות פעמיים ביום בימים שלאחר מכן (איור 2B). 2. בידוד כליות ועיבוד רקמות עבור Cytometry זרימה של תאים חיסוניים להליך זה, יש להשתמש בפלואורסצנט של תאי מערכת החיסון המסומנים בבעלי חיים מהונדסים (לדוגמה,Tg (mpo:GFP)). לאחר 24 hpi של 120 מיקרוגרם / גרם ציספלטין, המתת חסד בעלי חיים על ידי הלם היפותרמי (מצמרר מהיר).הערה: הלם היפותרמי הוכח כיעיל יותר כשיטת המתת חסד מאשר מנת יתר MS-222. הלם היפותרמי הוא פחות מלחיץ, מהיר, עקבי ובטוח יותר עבור כוח אדם מאשר השימוש MS-222, תיאר בעבר46,47. במיכל מעבר חיצוני להכין מי קרח ביחס 5:1 של קרח למי מערכת, לשים את המיכל הפנימי עם מסך מעל הקרח, לחכות עד שהמים מגיעים 2-4 מעלות צלזיוס.הערה: דגים לא צריכים להיות במגע ישיר עם הקרח, כי זה עלול לגרום כוויות תרמיות וכאב. להעביר בעלי חיים למי קרח, לחכות לפחות 10 דקות עד שיש אובדן אוריינטציה ואין תנועה אופרקולרית. עם כף פלסטיק, מניחים את הדגים על מגבות נייר לייבוש המים העודפים. מעבירים את הדג לצלחת ניתוח של 3% ולוקחים אותו תחת סטריאוסקופ עם אור עליון. עם מספריים, לערוף דגים עושה חתך מהיר ממש מאחורי העיניים, ולהסיר את הראש. עם מספריים עדינים לעשות חתך מהצד הפתוח לקלואקה ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים עדינים. השתמש סיכות חרקים לצבוט את הצדדים של קירות הגוף כדי לפתוח את הפגר ולחשוף את הכליה המחוברת לעמוד השדרה. נתק את הכליה עם מלקחיים עדינים והנח את האיבר בצלחת 6 באר עם פתרון קר של 1x PBS/2% FBS. שמור על קרח. להרים את הרקמה עם פיפטה פלסטיק פסטר ולהעביר את הרקמה דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר על צינור 50 מ”ל, בעדינות macerating אותו עם בוכנה מזרק. לשטוף פעמיים עם 1 מ”ל של 1x PBS / 2% FBS ולאסוף את התאים בצינור 50 מ”ל. תאי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להרים את כל supernatant עם מיקרופיפט 1 מ”ל ולזרוק אותו. הוסף 500 μL של קר 1x PBS כדי resuspend התאים ומניחים אותם 5 צינורות cytometry זרימה מ”ל. שמור על קרח. לספור תאים בתא Neubauer ביצוע דילול 1:10 בכחול Trypan(למשל,לקחת 10 μL של המדגם ומערבבים עם 90 μL של כחול Trypan). מוסיפים 10 μL של התערובת לתא Neubauer ולספור תאים תחת המיקרוסקופ.הערה: תוצאות אופטימליות צפויות עם 1-5 x 106 תאים / מ”ל ו >80% הכדאיות.התראה: כחול Trypan הוא סוכן מסרטן, להשתמש PPE כדי לטפל. קח את התאים להיקרא על ידי ציטומטר. לאחר מכן נתח את התוצאות הבוחרות את אוכלוסיית העניין. 3. עיבוד של רקמת כליה של דג זברה למבוגרים עבור TUNEL Assay עבור הליך זה, השתמש בבעלי חיים מסוג בר(למשל,AB, טיבינגן וכו ‘) או בחיה מהונדסת עם צבע פלואורסצנטי שונה מאשר ערכת TUNEL, שכן פלואורסצנטיות דומה יכולה להפריע לניתוח של TUNEL. לאחר 24 hpi של 120 מיקרוגרם / גרם ציספלטין, המתת חסד בעלי חיים על ידי הלם היפותרמי (מצמרר מהיר). ראה 2.3-2.4. לנתח את הדג כמתואר ב 2.5-2.6; הכליה חייבת להישאר מחוברת לעמוד השדרה במהלך הליך הקיבעון (מוסבר להלן). באמצעות סיכות חרקים, לצבוט את הצדדים של קירות הגוף כדי לפתוח את הפגר ולהצמיד אותו על משטח פקק כדי לשמור על הכליה חשופה.הערה: הליך זה מבטיח שהכליה תישאר במצב הנכון לניתוח מאוחר יותר. לאחר מכן מניחים את משטח הפקק עם הכליה הפונה כלפי מטה בצלחת 6 באר מעל פתרון טרי של 4% paraformaldehyde (PFA). שמור את זה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.התראה: PFA הוא מסרטן ומרגיז לעור ומשטחים ריריים. הכן פתרונות PFA תחת מכסה המנוע הכימי באמצעות PPE כולל ציוד הגנה על העיניים. למחרת, לנתח את הכליות כמו ב2.8. מניחים את הכליות בצלחת פטרי 60 מ”מ עם 1x PBS ולשטוף פעמיים ב 1x PBS. הכן 2% agarose כדי ליצור מטריצת תמיכה עבור הרקמה. השלך את כל 1x PBS הנותרים מצלחת פטרי ויוצקים 2% agarose לאט כדי לכסות את האיבר כולו. לאחר מכן מקם את הכליה באמצעות מלקחיים עדינים תחת סטריאומיקרוסקופ כדי למנוע את הכליה לקפל. בואו agarose לחזק בטמפרטורת החדר.הערה: הליך זה ישמור על האוריינטציה והצורה של האיבר באמצעות עיבוד היסטולוגי שכן הצורה דמוית העלה של האיבר גורמת לנטייה להתקפל אם הוא אינו נמצא בתוך מטריצה תומכת. לאחר התגבשות agarose, להשתמש אזמל לחתוך את agarose סביב הרקמה, יצירת קוביות קטנות, ולהסיר את עודף של agarose סביב הרקמה. מניחים את קוביות agarose בקלטת המתאימה לעיבוד היסטולוגי.הערה: השלבים הבאים יכולים להיעשות באופן ידני או במעבד רקמות אוטומטי. ראשית, לעבד את הרקמה בקלטת בעקבות השלבים הבאים במשך 45 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר: אמבטיה אחת של 50% אתנול, אמבטיה אחת של 70% אתנול, שתי אמבטיות רצופות של 95% אתנול, ושלוש אמבטיות רצופות של 100% אתנול. לאחר מכן, לעבד את הרקמה בשתי אמבטיות רצופות של Xylene ושלוש אמבטיות רצופות של פרפין; האחרון נמשך שעה כל אחד ב 60 מעלות צלזיוס.התראה: בצע שינויים מתחת למכסה המנוע הכימי, אדים מאתנול וקסילן הם מרגיזים ורעילים. להכנת גושי פרפין, ממיסים עדשי פרפין עד 60 מעלות צלזיוס. פתח את קלטת הפלסטיק עם הרקמה בפנים ולשמור אותו על צלחת חמה. מחממים תבניות מתכת לפרפין. עם פינצטה מניחים את הרקמה על תבנית מתכת, כך אורך הכליה מקביל לבסיס עובש. מוסיפים את הפרפין, להקצות מחדש את הרקמה במידת הצורך. מכסים את התבנית בבסיס הקלטת ומוסיפים פרפין עד שהרשת מכוסה. בואו להתמצק בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם ב -20 מעלות צלזיוס לתהליך התגבשות מהיר יותר. שחרור בלוק פרפין מתבנית המתכת סביב 20-30 דקות מאוחר יותר. עם microtome, סעיף הרקמה מוטבע פרפין לעובי 5 מיקרומטר. השתמש שקופיות זכוכית silanized או טעון באופן חיובי כדי לאסוף את הרקמה. 4. מבחני TUNEL הערה: הפרוטוקול הבא משתמש בערכת זיהוי מוות של תאי In Situ (טבלת חומרים). רקמת Dewax שקופיות הצבת אותם בשתי אמבטיות רצופות של xylene במשך 5 דקות. ואז rehydrate הרקמה באמצעות סדרה מדורגת של אתנול: 100%-95%-70%-50%, במשך 5 דקות כל אחד. מניחים מגלשות במי ברז קרים זורמים כדי לשטוף את האתנול. שמור את המגלשות במים מזוקקים. הכינו תא אינקובטור כהה. מוסיפים מגבות נייר רטובות בתחתית כדי לשמור על הלחות במהלך שלבי הדגירה.הערה: בהיעדר תא אינקובטור ניתן להשתמש בצלחת פטרי עם נייר לח בתחתית ושני קיסמים כדי למקם את המגלשה. הכן פתרון עבודה טרי Proteinase K: 10 מיקרוגרם / מ”ל ב 10 מ”מ Tris / HCl, pH 7.4-8.הערה: Proteinase K משמש כסוכן חדירות, כפי שהומלץ על ידי הבד. מניחים את השקופיות בתא האינקובטור הכהה ומוסיפים את תמיסת העבודה Proteinase K עד לכיסוי דגימות. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בעוד דגימות הם דגירה, להכין את תערובת תגובת TUNEL: להוסיף 50 μL של פתרון אנזים 450 μL תווית פתרון. הגן מפני אור.הערה: ניתן לכוונן את עוצמת הקול שיש להכין באותה פרופורציה של 1:10. אמצעי האחסון מחושב להיות 50 μL של התערובת עבור כל סעיף; הדבר יכול להשתנות בהתאם לגודל הדגימות. להרים את התא הכהה ולשטוף את השקופיות פעמיים עם 1x PBS. לאחר מכן, יבש את האזור סביב המדגם באמצעות נייר סופג ולהוסיף 50 μL של תערובת תגובת TUNEL על כל שקופית רקמה, להפיץ את הפתרון, כך המדגם כולו מכוסה. דגירה ב 37 °C (69 °F) עבור 2 שעות. הגן מפני אור. לאחר הדגירה, יש לשטוף את המגלשה שלוש פעמים עם 1x PBS ולייבש את האזור סביב המדגם באמצעות מגבות נייר. הוסף 50 μL של DAPI 1:1000 לדגימות, עבור counterstaining גרעיני, דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הגן מפני אור. יש לשטוף שוב שלוש פעמים עם 1x PBS ולייבש את האזור סביב המדגם. הר את המגלשה עם מדיום הידרופילי נגד עמעום, מניחים כיסוי, וחותמים עם לק. אחסן שקופיות אופקית, מוגנות מפני אור ב- 4 °C (60 °F).הערה: המאפיינים נגד עמעום של מדיום ההרכבה הם לשמר את הפלואורסצנטיות של הדגימות, אך ניתן להשתמש בכל מדיום הידרופילי זמין. שלב האיטום הסופי עם לק ציפורניים הוא חיוני כדי למנוע התייבשות. דמיין את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור סוג זה של פיגמנט פלואורסצנטי, השתמש באורך גל עירור בטווח של 520-560 ננומטר (ירוק) וזיהוי בטווח של 570-620 ננומטר (אדום).

Representative Results

הכליה של דג הזברה היא איבר פיגמנטי שטוח הממוקם על קיר הגב והיחידה הפונקציונלית הבסיסית שלו, הנפרון, שמורה ביונקים (איור 1). במיוחדיות של כליה אחת בלבד עם קיבולת גבוהה של התחדשות עושה את האורגניזם מודל זה בחירה מצוינת עבור פגיעה בכליות מודל. הפרוטוקולים המוצגים בעבודה זו נועדו לגרום ל-AKI על ידי הזרקת ציספלטין תוך-אישית (i.p. ) של ציספלטין בזברה-דג למבוגרים (איור 2) ולאחר מכן להיות מנותחים בשתי טכניקות המפורטות קודם לכן: ציטומטרייתזרימה (איור 3A)ו- TUNEL (איור 3B). תרשים זרימה של התהליך כולו מתואר באיור 4. המינונים של ציספלטין הוחלו בתחילה על אלה המתוארים במודלים העכבר15,16,17, שבו התקן המשמש הוא 10-13 מ”ג של ציספלטין לק”ג של בעלי חיים (מ”ג / קילוגרם). עם זאת, דג הזברה הראה להיות עמיד יותר ציספלטין מאשר העכבר (נתונים לא מוצגים), ואת המנה הסופית הוגדלה. כאשר הערכנו את שיעור ההישרדות של בעלי החיים, הניסויים הראו השפעה תלוית מינון של ציספלטין(איור 5A). בגלל זה, אנו ממליצים לעקוב אחר ההוראות בדיוק כפי שהוסבר בפרוטוקול זה ולפקח על שיעור ההישרדות של בעלי החיים כל הזמן כמדד לשחזור, לפני איסוף כל חומר. לאחר הזרקת 120 מיקרוגרם/גרם ציספלטין(איור 5A, קו אדום),נצפתה ירידה בהישרדות של כ-30% מבעלי החיים ב-24 השעות הראשונות וההישרדות ירדה בהדרגה עד שהגיעה לכ-20% מבעלי החיים ביום החמישי שלאחר ההזרקה, ואז התייצבה(איור 5A). רעילות ציספלטין לא הושפעה ממין בעלי החיים, שכן לזכרים ולנקבות יש עקומות הישרדות דומות (איור 5B). ניתוח של קינטיקה של AKI הנגרמת על ידי ציספלטין הראה דלקת מוגברת ומוות תאים בכליה 24 hpi. אחת הדרכים המהירות והכמותיות להערכת דלקת היא ציטומטריית זרימה אך בהתחשב בהיעדר נוגדנים נגד אנטיגנים של דגי זברה הזמינים מסחרית לטכניקה זו, יש צורך להשתמש בקו מהונדס עם סמן חיסוני. כיום, קווי זברה רבים המסומנים תאים חיסוניים נגישים (טבלה 1). קווים אלה יכולים לשמש או בשילוב, נתון מספיק רפרטואר לניתוח48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. זה מפשט מאוד את הטכניקה שכן אין צורך כל שלב הדגירה נוגדן, להיפך, לאחר בידוד של התאים על ידי הפרדה מכנית, הקריאה הישירה על cytometer אפשרי. כפי שהוזכר קודם לכן, הכליה של דג הזברה היא לא רק איבר סינון דם עם פונקציות הומיוסטטיות, אלא גם את האתר האנטומי של hematopoiesis במבוגרים, שווה ערך למח העצם ביונקים33,34,35. בדרך זו כאשר אנו מנתחים אותו על ידי cytometry זרימה ניתן להבדיל אוכלוסיות תאים דומים לדם האנושי61,62 (איור 6A), זה מאפשר לנו לזהות את אוכלוסיות התא בתחילה לפי גודל וצפיפות ולא לכלול פסולת. במקרה זה, השתמשנו בקו מהונדס בשם Tg(mpo:GFP)52 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) יחד עם האנזים myeloperoxidase, אשר קיים נויטרופילים. בידיעה זו, אסטרטגיית השער שלנו התבססה על ההפרדה הראשונית של אוכלוסיית הגרנולוציטים (איור 6B). בעקבות זאת, תאים כפולים לא נכללו, שכן הם יכולים לשנות באופן משמעותי את הניתוח ולהוביל למסקנות לא מדויקות. כפול הוא אירוע יחיד המורכב מ- 2 חלקיקים בלתי תלויים וניתן לשלול אותו על-ידי בחירת גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת תרשים צפיפות של אזור פיזור קדמי (FSC-A) (איור 6C). לאחר שלב זה, התאים שהביעו את סמן הפלואורסצנט זוהו ונבחרו (איור 6D). לבסוף, נתוני האוכלוסיה חולצו מהניתוח והותוו כאחוז מהתאים (איור 6E). אחד המאפיינים הבולטים ביותר של nephrotoxicity ציספלטין הוא מוות תאי צינורי10, כדי לדמיין בקלות את זה השתמשנו ב- TUNEL assay לגילוי אפופטוזיס. שיטה זו ממליצה להשתמש בתאים ורקמות מסוג בר חסרי סמנים פלואורסצנטיים, שכן פלואורסצנטיות מקבילה תפריע לניתוח, במקרה של דג הזברה מומלץ להשתמש בקווים מסוג בר, כגון AB, Tübingen, TAB או קו מהונדס עם חלבון פלואורסצנטי שאינו מפריע לצבע הפלואורסצנטי של TUNEL. טכניקת TUNEL מאפשרת ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה. מיקרוסקופיה יש את היתרון של שימור מבנה הרקמה, המאפשר לראות אילו תאים מתים. תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, הגרעינים הבהירים של תאים אפופטוטיים יכולים להיות מובחנים בקלות מהרקע. לבעלי חיים המוזרקים עם ציספלטין(איור 7B)יש יותר תאים מתים מאשר לפקד (איור 7A)ב-24 כ”ס. הכימות הסופי נעשה עם אפשרות מונה התאים של תוכנת FIJI והראה סטטיסטית יותר תאים מתים בכליות שטופלו בציספלטין מאשר בפקדים (איור 7C) הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה הראה כיצד להשתמש בציספלטין כיצרן של AKI בזברה-פיש למבוגרים, שהוא משיב במינון, מהיר ואמין. בהתבסס על הנתונים המתקבלים משיעורי ההישרדות ומדידת סימנים של nephrotoxicity של ציספלטין כולל דלקת (זוהה על ידי cytometry זרימה) ומוות תאים (זוהה על ידי TUNEL assay), אנו מציעים מודל זה לחקר nephrotoxicity ציספלטין, כמו גם לטיפולים עתידיים במחלות הקשורות AKI. איור 1: מבנה והשוואה של דגי זברה וכליות אנושיות. א. (1) מבט רוחבי על דג זברה בוגר עם הכליה המיוצגת בחום כהה הממוקם בקיר הגב של הדג, בין שלפוחית השחייה (sb) לבין עמוד השדרה. (2) מבט גחוני על הכליה המציגה נפרונים (צהובים) המחוברים לצינור האיסוף (כחול). האזורים השונים של הכליה מסומנים: ראש (H), תא מטען (Tr) וזנב (Ta). (3) סכמטי המייצג nephrons זברה דג ואת הקטעים שלהם שכותרתו וצבעוני כדי להתאים אזורים שמורים גנטיים עם nephron האנושי. ב. (1) מבט שגיטל על כליה אנושית. (2) סכמטי המתאר נפרון אנושי עם מקטעים המסומנים וצבעוניים. RC: קורפוס כליות; PCT: צינורית מפותלת פרוקסימלית; PST: צינורית ישרה פרוקסימלית; TL: איבר דק; LH: לולאה של הנל; טל: איבר עולה עבה; DE: דיסטלי מוקדם; DL: דיסטלי מאוחר; DCT: צינורית מפותלת דיסטלית; תקליטור: איסוף צינור אוורור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: עיצוב ניסיוני עבור AKI הנגרמת על-ידי ציספלטין. א. מבט רוחבי וגחוני של דג זברה בוגר המצביע על מיקום המחט במהלך הליך ההזרקה. המחט חודרת בזווית של 20-30 מעלות מהבטן ומוכנסת באיטיות במקביל לקיר הגחון תוך הימנעות מניקוב הקרביים. ב. ב. תכנון ניסיוני של AKI הנגרמת על ידי ציספלטין: (1) הזרקת ציספלטין 120 מיקרוגרם / גרם לכל בעל חיים ביום אפס. (2) לפני שתנסה שלב 3, ניטור הישרדות של דגים לאחר ההזרקה מומלץ מהיום הראשון עד היום העשירי. (3) ניתוחי כליות יום אחד לאחר הזרקת ציספלטין לטכניקות עיבוד נוספות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: מנגנונים של ציטומטריית זרימה וטכניקות TUNEL. א. סקירה כללית של ציטומטר זרימה: השעיה של תאים מתמקדת הידרודינמית על קו אחד על ידי נוזל נדן, גורם לתאים לעבור אחד אחד מול קרן לייזר. גלאים מלפנים ובצד מודדים את הפיזור הקדמי (FSC), פיזור צד (SSC) ופלואורסצנטיות של התאים. ב. ב. עקרון מבחני TUNEL. מסוף deoxynucleotidyl transferase (TdT) מתווך את התוספת של dUTP מסומן פלואורסצנט ל 3′-OH קצוות של DNA מקוטע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תרשים זרימה של טכניקות מיוצגות. א. תרשים זרימה המציג את השלבים שיש לבצע בעת בחירה לנתח את רקמת הכליה באמצעות ציטומטריית זרימה (כתום) או TUNEL (כחול), בעת גרימת AKI על ידי הזרקת ציספלטין (אפור). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: ניטור הישרדות של דגים מוזרקים ציספלטין. א. שיעור ההישרדות של מינונים שונים של זריקות ציספלטין (25 – 50 – 112.5 – 120 מיקרוגרם / גרם). מבחן דרגת יומן (מנטל-קוקס), ** p < 0.01. ב. ב. שיעור ההישרדות של זכרים לעומת נקבות מוזרק עם 120 מיקרוגרם / גרם ציספלטין. מבחן דרגת יומן (מנטל-קוקס), *** p < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: אסטרטגיית שער לקו זברה-דג מהונדס. א. חלקת צפיפות של תאי כליות בוגרים זברהפיש, אוכלוסיות מופרדות לפי גודל (FSC-A) וצפיפות (SSC-A). אוכלוסיות שונות נבחרות על-ידי אליפסות/עיגולים צבעוניים. ורוד: אריתרואיד; שחור: לימפואיד; צהוב: סימנים מקדימים; אדום: גרנולוציטים. ב. ב. חלקת צפיפות של אזור פיזור צדדי (SSC-A) ואזור פיזור קדימה (FSC-A) לבחירת אוכלוסיית גרנולוציטים בכליה. ג. ג. תרשים צפיפות של פיזור קדימה גבוה (FSC-H) ואזור פיזור קדימה (FSC-A) לבחירת אוכלוסיית סינגלים בתוך שער הגרנולוציטים. ד. חלקת צפיפות של אזור פיזור קדימה (FSC-A) ו FITC-A:MPO לבחירת mpo:GFP תאים חיוביים (נויטרופילים) בכליה. אוכלוסייה חיובית נחשבת סביב 103 על, של עוצמת פלואורסצנטיות. אי, אי. גרף של אחוז mpo:GFP תאים חיוביים (נויטרופילים) בשליטה לעומת חיות ציספלטין, 24 hpi . מבחן tלא משוכך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: מבחני TUNEL של דגים מוזרקים ציספלטין. א. Microphotographs של כליה למבוגרים קבועים 24 שעות לאחר 120 מיקרוגרם / גרם הזרקת ציספלטין. הבקרות מוזרקות עם 0.9% NaCl. תאים חיוביים של TUNEL (תאים אפופטוטיים) מוכתמים באדום (חצים לבנים). DAPI (כחול) משמש כתא נגד גרעיני. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. 20x הגדלה. ב. ב. גרף המציג כימות של מספר התאים המתים בכליה על ידי שדה 20x. ללא מבחן t, * p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. קו מהונדס סוג תא עם תווית הפניות Tg(spi1:EGFP)pA301 תאים מיאלואידיים וורד ואח’ 200348 Tg(zpu1:GFP) תאים מיאלואידיים הסו ואח’ 200449 Tg(mhc2dab:GFP)sd6 ומונוציטים וויטמר ואח’ 201150 Tg(lysC:DsRED2) נויטרופילים אולם ואח’ 200751 Tg(mpo:GFP) נויטרופילים מתיאס ואח’ 200652 Tg(mpeg1:mשרי) מקרופאגים אללט ואח’ 201153 Tg(mpeg1:דנדרה2) מקרופאגים הארווי ואח’ 201354 Tg(lck:GFP) תאי T לנגנאו ואח’ 200455 TgBAC(איקרוס:EGFP) תאי T באג’ולי ואח’ 200956 Tg(סמרטוט1:GFP) תאי T ג’סין ואח’ 199957 Tg(סמרטוט2:GFP) תאי T ג’סין ואח’ 200158 Tg (CD79:GFP) B-תאים ליו ואח’ 201759 Tg(CD45:DsRed) לויקוציטים ברטרנד ואח’ 200860 טבלה 1: קווים מהונדסים של דגי זברה לתאי החיסון. טבלה המחדשת את שמות קווי הכתבים של זברה-פיש עם סוג התאים החיסוניים המסומנים בהתאמה ומאמרי הייחוס שבהם הם נבנו. שילוב של קווי זברה אלה יכול להציע אפשרויות חדשות לבחירת תאים על ידי ציטומטריית זרימה.

Discussion

השכיחות של מחלת כליות המשיכה לגדול ברחבי העולם, והפכה לבעיה עולמית בבריאות הציבור המשפיעה על מיליוני אנשים63. מציאת דרך לטפל אנשים פגועים בכליות היא בעלת חשיבות עליונה, כמו גם להבין יותר על האטיולוגיה שלהם ואת ההתקדמות. מספר מחקרים השתמשו במודלים של בעלי חיים כדי להבין את נזקי הכליות. הכליה של דג הזברה(איור 1)נחקרה במשך שנים במחקר ביולוגי התפתחותי ופציעות בשל יכולות ההתחדשות העצמית שלה והדמיון הגנטי29,64. כאן, אנו מציגים דגם AKI חדש בדג זברה למבוגרים תוך שימוש בתכונות של ציספלטין כסוכן נפרוטוקס, המפרט את השלבים להשגת תגובה מהירה וחמורה עם נזק גלוי ברגע 24 hpi(איור 2). יתר על כן, כאן אנו מסבירים שתי טכניקות שיסייעו להערכת נזקי הרקמה לאחר הזרקת ציספלטין, ציטומטריית זרימה ו- TUNEL (איור 3).

מודלים נוכחיים AKI ב זברה למבוגרים כוללים i.p. הזרקה של gentamicin אשר גורם נזק נרחב בהרס nephron ו tubule, אירועי ניאונפרוגנסיס להתחיל מהיום 5, והתחדשות הושלמה על ידי 21 ימים לאחר הזרקה65. מצד שני, מודל של פגיעה בכליות חריפה הקשורות אלח דם (S-AKI) הוקמה על ידי זיהום עם Edwardsiella tarda, שכן גדל באופן משמעותי את הביטוי של סמני AKI, כגון פקטורי גדילה דמויי אינסולין מחייב חלבון-7 (IGFBP7), מעכבי רקמה של metalloproteinases 2 (TIMP-2), מולקולה פגיעה בכליות-1 (KIM-1), בזחלים וזברה למבוגרים66. דג הזברה ידוע בהיותו בעל תפוקה גבוהה לחיפוש סוכנים טיפוליים וזה כולל שימוש בפרוביוטיקה ובמטבוליטים שמקורם במיקרוביוטה כדי ללמוד תפקוד כליות והתחדשות67. עם זאת, הדגמים הזמינים יכולים להשפיע ישירות על התוצאה של טיפולים אלה. לכן, הקמנו שיטה אחרת כדי לגרום AKI ב זברה למבוגרים (איור 4), באמצעות ציספלטין כסוכן nephrotoxic ידוע כי לא היו השפעות ידועות ישירות על microbiota דגים, כמו גם מודל gentamicin להיות אנטיביוטיקה, או זיהום עם E. tarda, על היותו מודל אלח דם. עם זאת, באותו זמן שאנחנו מפתחים פרוטוקול ציספלטין שלנו, קבוצה אחרת חקרה גם את ההשפעות nephrotoxic של ציספלטין ב זברה למבוגרים, פישוט המינון ל 10-20-30 מיקרוגרם לכל חיה68. למרות שהם הראו גם אפקט תלוי מינון ציספלטין בהישרדות, אנו ממליצים להיזהר באמצעות כמות אחת של ציספלטין עבור כל הדגים, כמו דגי זברה מאותו גיל יכול להיות בגדלים ומשקל שונים מאוד וזה יכול לגרום וריאציות בתוצאות69,70. אנו חושבים שחשוב להתאים את המינון למשקל המתאים של החיה, כפי שנעשה בעכברים ובמחקר זה.

בניסויים שלנו עם דג זברה בוגר, ציספלטין הראה אפקט תגובה מינון. זה היה דמיין על ידי ניטור שיעור ההישרדות של בעלי החיים לאחר הזרקת ציספלטין (איור 5). השתמשנו בהישרדות כדרך להעריך את עוצמת המינון של ציספלטין ולא כמדד לנפרוטוקסיות, שכן שום סימן פיזי אחר אינו נראה בזמן הניטור. זה יכול להיות דומה עם מכרסמים, שבו חומרת הפגיעה בכליות ניתן לווסת על ידי המינון והתדירות של הזרקת ציספלטין15, השגת מינונים קטלניים עם ריכוזים גבוהים יותר של ציספלטין71. מת נראה גם בימים הבאים במודל הזחל של ציספלטין72. מאז המטרה שלנו הייתה לגרום לפציעה חריפה בעוד כמה ימים, בחרנו את המינון 120 מיקרוגרם / גרם של ציספלטין כפי שניתן לראות נזק לכליות 24 שעות לאחר ההזרקה, עם זאת, זה יכול להיות מותאם בהתאם למטרות המחקר.

בבני אדם, AKI מאובחנת קלינית על ידי ירידה בשיעור הסינון הגלומרולרי (GFR), קריאטינין סרום גבוה, וחנקן אוריאהבדם 3. ב זברה, הרפרטואר של מודלים AKI כולל כמה מודלים מותניםגנטיים 73,74 וכמה מודלים הקשורים לתרופות65,72, אבל כמו כמה פרמטרים תפקודיים AKI לא ניתן למדוד על זברהפיש בגלל קשיים טכניים(למשל, איסוף דם), רוב המחקר מאמץ טכניקות מורפולוגיות ויזואליות כדי לבחון את התכונות של AKI1,75 כגון המחקר שלנו.

במכרסמים, ציספלטין נכנס לתאי האפיתל בצינורות הפרוקסימליים והדיסטליים, בתוך התא עובר הפעלה מטבולית והופך לפעולה תגובתית מאוד על אברונים של תאים וגרימת שינויים במבנה התא. שינויים אלה יכולים לגרום אפופטוזיס אוטופגיה ואפילו נמק, במינונים גבוהים מאוד. בתגובה לנזק זה, ציטוקינים רבים משתחררים לויקוציטים מגויסים המוביל דלקת המשפיעים על הפונקציונליות של האיבר15. זה מדגיש את החשיבות של הערכת איזה סוג של תאים ניתן למצוא בכליה הפגועה, כתושבים או תאים חיסוניים הסתננו. כאן הראינו כיצד להעריך זאת על ידי cytometry זרימה, באמצעות קווי כתב חיסוני מהונדס זמין כיום (טבלה 1). ציספלטין העלה את אחוז הנויטרופילים(mpo:GFP תאים חיוביים) בכליה 24 שעות לאחר ההזרקה (איור 6). במקרה של דג הזברה, הכליה היא הנישה של HSCs כי להוליד סוגים שונים של תאי דם. עם זאת, גרנולוציטים ומקפאגים רבים מסתובבים בדרך כלל בדם. בדוגמה שלנו, השתמשנו mpo:GFP קו מהונדס המבטאים GFP תחת האמרגן של myeloperoxidase של נויטרופילים52. מחקרים מקוריים של mpo:GFP קו מהונדס הראה ביטוי של myeloperoxidase במצבים שונים של התבגרות נויטרופילים76 אבל אסטרטגיית השער שלנו התמקדה שבר גרנולוציטים הכולל תאים בוגרים המגיעים מהדם52, בדרך זו הניתוח שלנו כולל תאים הסתננו ולא תאים תושב. זה חשוב לשקול בעת בידוד אוכלוסיית התאים הרצויה.

כפי שהוסבר לעיל, אפופטוזיס הוא הסמן הקלאסי ביותר של AKI הקשורות ציספלטין. כאן, הדגמנו פרוטוקול פשוט ללוקליזציה של תאים מתים על ידי מבחני TUNEL. הזרקת ציספלטין הגדילה את מספר התאים האפוטוטיים 24 כ”ס (איור 7). זה יכול להיות לכמת בקלות על ידי ספירת ישירות את התאים המתים מן הרקמה. עם זאת, לזיהוי מוות ספציפי לתאים ניתן להשתמש בנוגדנים נגד התא הרצוי(למשל, תאים צינוריים), או להשתמש בקו כתב מהונדס יחד עם טכניקה זו. בהשוואה לדגם הנגרמת על ידי גנטמיצין של AKI, ציספלטין נראה מודל חמור יותר, שכן אפופטוזיס gentamicin היה גבוה יותר ביום השלישי לאחר הזרקה65.

למרות שיש מגוון רחב של תופעות לוואי, ציספלטין הוא עדיין בשימוש נרחב בטיפול בסרטן, בגלל האפקטיביות שלה נגד סוגים שונים של סרטן, כולל קרצינומות, גידולים בתא הנבט, לימפומות, סרקומות77. Nephrotoxicity מתרחשת בשליש מהחולים בטיפול עם ציספלטין10, ובכך החיפוש אחר אסטרטגיות שיכולות להקטין את האפקט הזה ולהגדיל את הרפופרוטציה הוא הכרחי. אנו מאמינים כי השיטות והטכניקות המוצגות בכתב יד זה יסייעו להבהיר מנגנונים של פגיעה בכליות ולמצוא מטרות טיפוליות שיכולות להיות חיוניות כדי לשפר את איכות החיים של אנשים הסובלים מסיבוכי כליות, בעיקר אלה הקשורים לשימוש בציספלטין.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), קונסלהו נאסיונאל דה דזנובולבימנטו סינטיפיקו אי טקנולוג’יקו (CNPq) וקורדנאצואו דה אפרפייסומנטו דה פסואל דה ניבאל סופריור (CAPES), קוד פיננסי 001. אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו במעבדה של מריה ריטה דוס סנטוס e Passos-Bueno’s ומתקן זברה-פיש של המחלקה לגנטיקה וביולוגיה אבולוציונית, במכון הביולוגי של אוניברסיטת סאו פאולו. אנו מודים בחביבות לכריסטיאן נאפה דה סוזה ברדה ותרזה ראקל דה אוליביירה רמאלהו על ההערות וההצעות על כתב היד. אנו מעריכים מאוד ומודים למרציו וילאר מרטינס, מצוות המולטימדיה של המכון למדעים ביו-רפואיים, על ההקלטה, המהדורה וההפקה של וידאו זה.

Materials

1x PBS Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water
31 G 1.0 cc insulin syringe BD Plastipak 990256 Needle: BD Precision Glide 300110
3.5 L Fish tank Tecniplast Part of the aquactic system
6 well plate Corning 351146
10 mM Tris/HCl Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)
50 ml Falcon tube Corning 352070
2-3% Agarose Invitrogen 16500-500 Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.
2% FBS Gibco 12657-09 Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS
4% Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C
50% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
70% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
90% Ethanol Made by diluting 100% ethanol in distilled water
100% Ethanol Synth 00A1115.01.BJ
100% Xylene Synth 00X1001.11.BJ
Cell strainer 40 µm Corning 431750
Cisplatin Blau Farmacêutica 16020227 C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.
Cork board sheet Obtained from local stationary store
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Stock solution 20 mg/ml dissolved in water
Fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Flow cytometry tubes Corning 352052
Glass slide Thermo-Fisher 4445
Histology cassette Ciencor 2921
Immuno stain chamber Ciencor EP-51-05022
Incubator NAPCO 5400 Set to 37 °C
Insect pins Papillon Model micro15x20
In Situ Cell Death Detection Kit Roche Diagnostics 12156792910
Metal mold Leica Biosystems 3803081
Micropipette 200-1000 µL Eppendorf Use 1 mL tips
MS-222 (Tricaine) Fluka Analytical A5040-25G
NaCl 0.9% Synth C1060.01.AG Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water
Nail polish Prefer transparent
Neubauer chamber Precicolor HGB
Pasteur plastic pipet United Scientific Supplies P31201
Paraplast Sigma-Aldrich P3558
Petri dish J.ProLab 0307-1/6 60 and 100 mm
Plastic spoon Obtained from local store
Proteinase K New England BioLabs P8102 Diluite from stock 20 mg/ml
Scissors Fine Science Tools 14060-09
Scalpel blade Solidor
Sponge Obtained from local store
Trypan Blue Cromoline 10621/07
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
Centrifuge Eppendorf 5810R
Cytometer BD Biosciences FACSCanto II
Fluorescence Stereoscope Zeiss Axio Zoom.V16
Fluorescence Microscope Zeiss AxioVert.A1
Microtome Leica Jung Supercut
Scale Ohaus Corporation AR2140
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish Renal Pathology: Emerging Models of Acute Kidney Injury. Current Pathobiology Reports. 3 (2), 171-181 (2015).
  2. Guo, C., Dong, G., Liang, X., Dong, Z. Epigenetic regulation in AKI and kidney repair: mechanisms and therapeutic implications. Nature Reviews Nephrology. 15 (4), 220-239 (2019).
  3. Makris, K., Spanou, L. Acute Kidney Injury: Definition, Pathophysiology and Clinical Phenotypes. Clinical Biochemist Reviews. 37 (2), 85-98 (2016).
  4. Sawhney, S., et al. Intermediate and Long-term Outcomes of Survivors of Acute Kidney Injury Episodes: A Large Population-Based Cohort Study. American Journal of Kidney Diseases. 69 (1), 18-28 (2017).
  5. Saxena, A., Meshram, S. V. Predictors of Mortality in Acute Kidney Injury Patients Admitted to Medicine Intensive Care Unit in a Rural Tertiary Care Hospital. Indian Journal of Critical Care Medicine. 22 (4), 231-237 (2018).
  6. Sawhney, S., Fraser, S. D. Epidemiology of AKI: Utilizing Large Databases to Determine the Burden of AKI. Advances in Chronic Kidney Disease. 24 (4), 194-204 (2017).
  7. Sales, G. T. M., Foresto, R. D. Drug-induced nephrotoxicity. Revista da Associação Médica Brasileira. 66, 82-90 (2020).
  8. Perazella, M. A. Drug use and nephrotoxicity in the intensive care unit. Kidney International. 81 (12), 1172-1178 (2012).
  9. Taber, S. S., Mueller, B. A. Drug-associated renal dysfunction. Critical Care Clinics. 22 (2), 357-374 (2006).
  10. Pabla, N., Dong, Z. Cisplatin nephrotoxicity: mechanisms and renoprotective strategies. Kidney International. 73 (9), 994-1007 (2008).
  11. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 307-320 (2005).
  12. Shirmanova, M. V., et al. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 8911 (2017).
  13. Xu, Y., et al. A Role for Tubular Necroptosis in Cisplatin-Induced AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (11), 2647-2658 (2015).
  14. Kociba, R. J., Sleight, S. D. Acute toxicologic and pathologic effects of cis-diamminedichloroplatinum (NSC-119875) in the male rat. Cancer Chemotherapy Reports. 55 (1), 1-8 (1971).
  15. Perše, M., Večerić-Haler, &. #. 3. 8. 1. ;. Cisplatin-Induced Rodent Model of Kidney Injury: Characteristics and Challenges. BioMed Research International. 2018, 1462802 (2018).
  16. Dobyan, D. C., Levi, J., Jacobs, C., Kosek, J., Weiner, M. W. Mechanism of cis-platinum nephrotoxicity: II. Morphologic observations. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 213 (3), 551-556 (1980).
  17. Singh, G. A possible cellular mechanism of cisplatin-induced nephrotoxicity. Toxicology. 58 (1), 71-80 (1989).
  18. Jodrell, D. I., et al. The renal effects of N10-propargyl-5,8-dideazafolic acid (CB3717) and a non-nephrotoxic analogue ICI D1694, in mice. British Journal of Cancer. 64 (5), 833-838 (1991).
  19. McKeage, M. J., et al. Lack of nephrotoxicity of oral ammine/amine platinum (IV) dicarboxylate complexes in rodents. British Journal of Cancer. 67 (5), 996-1000 (1993).
  20. Gautier, J. C., et al. Evaluation of novel biomarkers of nephrotoxicity in two strains of rat treated with Cisplatin. Toxicologic Pathology. 38 (6), 943-956 (2010).
  21. Vinken, P., et al. Tissue Kim-1 and urinary clusterin as early indicators of cisplatin-induced acute kidney injury in rats. Toxicologic Pathology. 40 (7), 1049-1062 (2012).
  22. Zorzetto, R., Guimarães, M. Um peixe modelo. Pesquisa FAPESP. 209, 16-21 (2013).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Chakrabarti, S., Streisinger, G., Singer, F., Walker, C. Frequency of gamma-Ray Induced Specific Locus and Recessive Lethal Mutations in Mature Germ Cells of the Zebrafish, BRACHYDANIO RERIO. Genetik. 103 (1), 109-123 (1983).
  25. Walker, C., Streisinger, G. Induction of Mutations by gamma-Rays in Pregonial Germ Cells of Zebrafish Embryos. Genetik. 103 (1), 125-136 (1983).
  26. Morales, E. E., Wingert, R. A. Zebrafish as a Model of Kidney Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 60, 55-75 (2017).
  27. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney International. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  28. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Translational Research. 163 (2), 109-122 (2014).
  29. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods in Cell Biology. 100, 233-260 (2010).
  30. Saxén, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1 (3), 385-392 (1987).
  31. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  32. Hill, A. J., Bello, S. M., Prasch, A. L., Peterson, R. E., Heideman, W. Water permeability and TCDD-induced edema in zebrafish early-life stages. Toxicological Sciences. 78 (1), 78-87 (2004).
  33. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
  34. Majumdar, A., Drummond, I. A. Podocyte differentiation in the absence of endothelial cells as revealed in the zebrafish avascular mutant, cloche. Developmental Genetics. 24 (3-4), 220-229 (1999).
  35. Song, H. D., et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (46), 16240-16245 (2004).
  36. Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
  37. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. The International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
  38. Palis, J., Yoder, M. C. Yolk-sac hematopoiesis: the first blood cells of mouse and man. Experimental Hematology. 29 (8), 927-936 (2001).
  39. O’Donnell, E. A., Ernst, D. N., Hingorani, R. Multiparameter flow cytometry: advances in high resolution analysis. Immune Network. 13 (2), 43-54 (2013).
  40. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  41. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118 (2), 289-297 (2011).
  42. Kulkeaw, K., et al. Purification of zebrafish erythrocytes as a means of identifying a novel regulator of haematopoiesis. British Journal of Haematology. 180 (3), 420-431 (2018).
  43. Ratnayake, D., Currie, P. D. Fluorescence-Activated Cell Sorting of Larval Zebrafish Muscle Stem/Progenitor Cells Following Skeletal Muscle Injury. Methods in Molecular Biology. 1889, 245-254 (2019).
  44. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  45. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  46. Wilson, J. M., Bunte, R. M., Carty, A. J. Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate (MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (6), 785-789 (2009).
  47. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  48. Ward, A. C., et al. The zebrafish spi1 promoter drives myeloid-specific expression in stable transgenic fish. Blood. 102 (9), 3238-3240 (2003).
  49. Hsu, K., et al. The pu.1 promoter drives myeloid gene expression in zebrafish. Blood. 104 (5), 1291-1297 (2004).
  50. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  51. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  52. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1281-1288 (2006).
  53. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  54. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate immune response to Streptococcus iniae infection in zebrafish larvae. Infection and Immunity. 81 (1), 110-121 (2013).
  55. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  56. Bajoghli, B., et al. Evolution of genetic networks underlying the emergence of thymopoiesis in vertebrates. Cell. 138 (1), 186-197 (2009).
  57. Jessen, J. R., Willett, C. E., Lin, S. Artificial chromosome transgenesis reveals long-distance negative regulation of rag1 in zebrafish. Nature Genetics. 23 (1), 15-16 (1999).
  58. Jessen, J. R., Jessen, T. N., Vogel, S. S., Lin, S. Concurrent expression of recombination activating genes 1 and 2 in zebrafish olfactory sensory neurons. Genesis. 29 (4), 156-162 (2001).
  59. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
  60. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135 (10), 1853-1862 (2008).
  61. de Jong, J. L., Zon, L. I. Histocompatibility and hematopoietic transplantation in the zebrafish. Advances in Hematology. 2012, 282318 (2012).
  62. Ossowski, P., et al. Differentiation of morphotic elements in human blood using optical coherence tomography and a microfluidic setup. Optics Express. 23 (21), 27724-27738 (2015).
  63. McCullough, K., et al. Measuring the population burden of chronic kidney disease: a systematic literature review of the estimated prevalence of impaired kidney function. Nephrology Dialysis Transplantation. 27 (5), 1812-1821 (2012).
  64. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  65. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of Cellular Dynamics during Zebrafish Adult Kidney Regeneration. Stem Cells International. 2015, 547636 (2015).
  66. Wen, X., et al. A zebrafish model of infection-associated acute kidney injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 291-299 (2018).
  67. Gong, J., Noel, S., Pluznick, J. L., Hamad, A. R. A., Rabb, H. Gut Microbiota-Kidney Cross-Talk in Acute Kidney Injury. Seminars in Nephrology. 39 (1), 107-116 (2019).
  68. Kim, M. J., Moon, D., Jung, S., Lee, J., Kim, J. Cisplatin nephrotoxicity is induced via poly(ADP-ribose) polymerase activation in adult zebrafish and mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 318 (5), 843-854 (2020).
  69. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental Dynamics. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  70. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: a staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  71. Wagner, T., Kreft, B., Bohlmann, G., Schwieder, G. Effects of fosfomycin, mesna, and sodium thiosulfate on the toxicity and antitumor activity of cisplatin. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 114 (5), 497-501 (1988).
  72. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (5), 923-929 (2005).
  73. Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (6), 1039-1047 (2012).
  74. Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney International. 83 (6), 1193-1200 (2013).
  75. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. Journal of Visualized Experiments. (96), e52540 (2015).
  76. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult zebrafish. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  77. Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).

Tags

Acute Kidney InjuryCisplatinZebrafishNephrotoxicityInflammationCell DeathFlow CytometryTUNEL AssayChemotherapyRenal ProtectionRegeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Morales Fénero, C., Padovani, B. N., do Amaral, M. A., de Barros, G. J. B., de Oliveira, I. K. X., Hiyane, M. I., Camâra, N. O. S. Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61575, doi:10.3791/61575 (2021).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image