Apresentado aqui é um ensaio para quantificar a hipermutação somática dentro do lócus genético da cadeia pesada da imunoglobulina usando células germinais do centro B das manchas do rato Peyer.
Dentro dos centros germinales de órgãos linfoides, as células B maduras alteram sua imunoglobulina expressa (Ig) introduzindo mutações não estencaradas nos exons de codificação variável do gene loci da cadeia pesada e leve. Este processo de hipermutação somática (SHM) requer a deaminase citidina induzida pela ativação da enzima (AID), que converte desoxicitidinas (C), em desoxyuridinas (U). Processar as incompatibilidades U:G geradas pelo AID em mutações pelas vias de excisão base e descompasso introduz novas sequências de codificação de Ig que podem produzir uma IG de maior afinidade. Mutações em genes de reparação de AUXÍLIO ou DNA podem bloquear ou alterar significativamente os tipos de mutações observadas no Ig loci. Descrevemos um protocolo para quantificar mutações intronsas JH4 que usa fluorescência ativada de classificação celular (FACS), PCR e sequenciamento Sanger. Embora este ensaio não meça diretamente a maturação da afinidade Ig, é indicativo de mutações em sequências de codificação variável Ig. Além disso, esses métodos utilizam técnicas comuns de biologia molecular que analisam mutações em sequências de Ig de múltiplos clones de células B. Assim, este ensaio é uma ferramenta inestimável no estudo da diversificação de SHM e Ig.
As células B, membros do sistema imunológico adaptativo, reconhecem e eliminam antígenos produzindo anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas (Ig). Cada Ig é composto por dois polípeptídeos de cadeia de cadeia leve (IgL) que são mantidos juntos por ligações de dissulfeto para formar a estrutura de forma “Y” característica do Ig1. O N-termini de IgH e IgL compreendem a região variável (V) de cada polipeptídeo e juntos formam o local de ligação de antígeno do Ig, enquanto a região constante de IgH transmite a função efetiva do Ig. O desenvolvimento de células B na medula óssea reorganiza os exons de codificação V de IgH e IgL em um processo conhecido como recombinação V(D)J2,3,4. A transcrição dos exons V recombinados, juntamente com os respectivos exons de região constante, forma o mRNA que é traduzido para o Ig.
Células B maduras expressando uma Ig ligada à membrana, também conhecida como receptor de células B (BCR), circulam para órgãos linfoides secundários, como o baço, o linfonodo ou as manchas de Peyer, onde pesquisam o ambiente para antígenos e interagem com outras células do sistema imunológico1. Dentro dos centros germinais (GC) de órgãos linfoides secundários, as células B que reconhecem o antígeno através do BCR tornam-se ativadas. Auxiliadas por células dendríticas foliculares e células T foliculares, as células B ativadas podem então proliferar e diferenciar-se em células plasmáticas e de memória, que são importantes efeitos de uma resposta imune robusta5,6,7,8,9. Além disso, essas células B ativadas podem sofrer processos secundários de diversificação genética Ig – recombinação de interruptor de classe (RSR) e hipermutação somática (SHM). Durante a RSE, as células B trocam a região padrão μ constante do polipeptídeo IgH por outra região constante (γ, α, ε) através de uma reação de recombinação de exclusão de DNA(Figura 1). Isso permite a expressão de um exon constante diferente e tradução de um novo Ig. A célula B mudará de expressar IgM para outro isótipo (IgG, IgA, IgE). RSE altera a função do efeito do Ig sem alterar sua especificidade de antígeno10,11,12. No entanto, durante o SHM, as células B mutam as regiões de codificação V de IgH e IgL para permitir a produção e seleção de Igs de maior afinidade, o que pode eliminar de forma mais eficaz um antígeno13,14,15 (Figura 1). É importante ressaltar que tanto a RSE quanto a SHM dependem da função de uma enzima: deaminase de citidina induzida por ativação (AID)16,17,18. Humanos e camundongos deficientes em AID não podem completar CSR ou SHM e apresentar com títulos de soro IgM elevados ou Hiper-IgM17,19.
Em RSE, o AID desamina desoxicitidinas (C) nas regiões de comutação repetitiva que precedem cada exons de codificação constante, convertendo-os em desoxyuridinas (U)20,21, que cria pareamento de base incomparável entre desoxyuridinas e desoxyguanosines (U:G). que são necessários para a recombinação de DNA, tanto pelo reparo de excisão base (BER) ou pela via de reparação de incompatibilidade (MMR)22,23,24,25,26,27,28,29. Em SHM, o AID desaminaliza C dentro dos exons de codificação V. A replicação através da incompatibilidade U:G gera mutações de transição C:G a T:A, enquanto a remoção da base uracil pela proteína BER, uracil DNA glicosylase (UNG), antes da replicação do DNA produz mutações de transição e transversão16. Mutações nulas em UNG aumentam significativamente c:g para T:A mutações de transição21,22. Semelhante à RSE, a SHM requer as funções complementares de MMR e BER. Durante o SHM, a RMM gera mutações em pares de bases A:T. Mutações inativantes na homologia muts 2 (MSH2) ou polimerase de DNA η(Polη)reduz significativamente mutações em bases A:T e mutações compostas em MSH2 e Polη praticamente aboli mutações nas bases A:T21,30,31. Consistente com o papel crítico para BER e MMR na conversão de U gerado pelo AID em mutações de transição ou transversão, os camundongos deficientes tanto para MSH2 quanto para UNG(MSH2-/-UNG-/-) exibemapenasmutações de transição C:G para T:A resultantes da replicação em todo o U:G incompatibilidade21.
A análise do SHM em regiões de codificação V permanece complicada porque o desenvolvimento de células B pode recombinar qualquer um dos exons de codificação V(D)J no IgH e IgL loci1,2,4. A análise precisa dessas regiões V combinadas e somaticamente mutadas requer a identificação e isolamento de clones de células B ou do Ig mRNA11,13. O JH4 intron, que é 3′ do último exon de codificação J no lócus IgH, abriga mutações somáticas devido à disseminação de mutações 3′ do promotor V32,33,34 e, portanto, é frequentemente usado como marcador substituto para SHM nas regiões V31,35 (Figura 1). Para elucidar experimentalmente como genes específicos ou mutações genéticas alteram padrões ou taxas de SHM, o intron JH4 pode ser sequenciado a partir das células B do centro B (GCBCs) do centro germinal de Peyer (GCBCs), que sofrem altas taxas de SHM36,37,38. Os GCBCs podem ser facilmente identificados e isolados com anticorpos fluorescentes conjugados contra marcadores de superfície celular (B220+PNAHI)17,39.
Um protocolo detalhado é apresentado para caracterizar mutações intronsas JH4 em PP GCBCs de camundongos usando uma combinação de FACS (fluorescência ativada de células), PCR e sequenciamento Sanger(Figura 2).
Caracterizar SHM dentro das sequências de codificação IgH e IgL V de uma população de células B heterogêneas apresenta um desafio, dado que cada célula B reorganiza exclusivamente segmentos de codificação V durante a recombinação V(D)J34. Neste artigo, descrevemos um método para identificar mutações no JH4 intron de GCBCs. O JH4 intron, que está localizado a 3′ do último segmento de codificação J no lócus IgH, é usado como substituto para as regiões de SHM de V(Figura 1)31,33,34,35. Para catalogar essas mutações intronsas JH4 e avaliar como genes específicos afetam a produção ou padrão de mutações, os PP GCBCs são analisados especificamente. Essas células acumulam mutações intronas JH4 como resultado da estimulação crônica pela microbiota intestinal53. Além disso, os B220+PNAHI GCBCs dos PPs de camundongos não imunizados possuem um espectro de mutação que se compara aos GCBCs esplênicos de animais imunizados54,55. No entanto, mutações no intron JH4 não podem ser correlacionadas com a maturação da afinidade ig porque essas mutações não são codificadas.
Para determinar se o SHM altera a afinidade de Ig, os camundongos devem ser imunizados intraperitonealmente com um antígeno, como np (4-hidroxi-3-nitrofenylacetyl) conjugado a CGG (gamma globulina de frango) ou KLH (hemocianina limpet do buraco da fechadura)56. Posteriormente, o mRNA pode ser purificado a partir de B220xPNAHI GCBCs para examinar SHM dentro de VH186.2, o exon de codificação V que mais frequentemente reconhece NP e é mutado após a imunização NP-CGG ou NP-KLH31,57,58,59,60. A mutação do triptofano-33 para uma leucina em VH186.2 tem sido caracterizada para aumentar a afinidade de Ig até 10vezes 59,60 e é, portanto, um indicador de que a seleção shm e clonal gerou ig de alta afinidade. Medir os títulos de soro de soro específico NP7 e NP20 da ELISA e calcular a razão NP7/NP20 específica do Ig durante o curso da imunização também documenta a maturação da afinidade Ig resultante da SHM das regiõesV 17,21,36. Ambos os ensaios podem ser usados para correlacionar o SHM dentro das sequências de codificação VH186.2 com alterações na maturação da afinidade de Ig específica do NP.
Se os animais imunizados ou não imunizados são utilizados para analisar o SHM de VH186.2 ou o JH4 intron, os GCBCs devem ser identificados com precisão. Apresentamos uma abordagem baseada em FACS para isolar B220+PNAHI GCBCs. Alternativamente, fas e não-sulfated α2-6-sialyl-LacNAc antígeno, que é reconhecido pelo anticorpo GL761,62,63,64, também pode ser usado para isolar GCBCs, que são identificados como B220+Fas+GL7+65 ou CD19+Fas+GL7+37. A expressão GL7 espelha de perto pna em GCBCs ativados dos linfonodos64,65,66. Além do uso de marcadores de anticorpos específicos para GCBCs, coquetéis de coloração devem maximizar a excitação de um fluoróforo e a detecção de um biomarcador, minimizando a sobreposição espectral da emissão de fluorescência. Antígenos expressos em níveis baixos devem ser detectados com um anticorpo conjugado a um fluoróforo com uma fluorescência de emissão robusta67. O protocolo de coloração recomendado foi otimizado para análise em um classificador celular equipado com quatro lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) e 12 filtros; no entanto, as configurações do filtro e a disponibilidade do laser variam entre os citómetros. Para alterar o protocolo de acordo com a disponibilidade de reagentes e equipamentos, o leitor é encaminhado para recursos adicionais, espectadores de espectro online e literatura publicada67,68,69,70,71,72,73. O protocolo de coloração multicolorido descrito aqui requer compensação da sobreposição espectral para garantir que as populações celulares classificadas sejam GCBCs em vez de detecção imprecisa de emissão de fluorescência. O B220 serve como um controle de coloração útil para os FACS descritos (Tabela 1B)porque os PPs terão populações distintas B220 negativas e positivas(Figura 3C),o que permite a compensação adequada da sobreposição espectral. A estratégia de gating apresentada na Figura 3C deve ser utilizada como diretriz. As parcelas de citometria de fluxo podem variar dependendo das condições de coloração e das configurações do cítmetro. No entanto, 4-10% das células vivas devem ser B220+PNAHI 35, 52.
Todas as mutações dentro do JH4 intron de PP GCBCs devem ser validadas para garantir que as mutações observadas sejam verdadeiramente reflexivas do SHM e não um artefato de PCR ou sequenciamento. AID-/- As células B podem servir como um controle negativo útil ao examinar o fenótipo SHM em outros modelos de camundongos mutantes porque essas células não podem completar o SHM17,19. A taxa de mutação intron JH4 no de AID-/- GCBCs (1,66×10-5 mutações/bp)20,21,36,37,38,50,74 é comparável à taxa de erro da polimerase de alta fidelidade (5.3×10-7 sub/base/duplicação)51,52 que é usada para amplificar o DNA no PCR aninhado. Se o AID-/- os camundongos não estiverem disponíveis, compare o padrão de mutação observado e a frequência com a literatura publicada. As regiões Ig V acumulam 10-3-10-4 mutações por divisão de par de base, que é aproximadamente 106 vezesmaior do que a taxa de mutação de outros gene loci73,75. Os resultados podem variar com a idade do animal76. Alternativamente, as células B220+PNALO, que marcam não-GCBCs, podem ser usadas como um controle negativo na ausência de AID-/- camundongos52. Se a frequência de mutação em WT GCBCs for menor do que o esperado, a sequência intronic da germina WT JH4 pode ser desproporcionalmente representada. Neste caso, certifique-se de que os GCBCs foram manchados e classificados adequadamente e os PCRs estão livres da contaminação intron germina-germina JH4 da WT. Além disso, os dados de sequenciamento bruto em eletroferogramas devem ser analisados minuciosamente para garantir que mutações nos dados de texto sequenciais não sejam artefatos de erros de sequenciamento. Por exemplo, resultados de sequenciamento sanger pobres podem reduzir a confiabilidade dos dados de sequência(Figura 4). Este controle de qualidade dos dados da sequência Sanger aumentará a precisão e a reprodutibilidade da análise de mutação intron JH4.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Tasuku Honjo pelo AID-/- ratos. Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Disparidades em Saúde e Saúde das Minorias (5G12MD007603), Instituto Nacional do Câncer (2U54CA132378) e Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (1SC1GM132035-01).
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |