从小鼠佩耶的补丁中对Germinal中心B细胞JH4因特龙的体细胞突变分析

所有突变小鼠均以C57BL/6为背景进行维护。年龄匹配（2-5个月大）的雄性小鼠和雌性小鼠用于所有实验。对小鼠进行饲养和实验是根据纽约城市学院机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。 1. 对佩耶的补丁进行解剖 用100%CO2 在3L/min安乐死小鼠5分钟，然后子宫颈脱位，以确认死亡。用70%乙醇消毒解剖工具（剪刀、钳子、细钳子）和戴手套的手。 将鼠标放在解剖垫上，腹部暴露。慷慨地喷洒70%乙醇小鼠的身体之前，作出任何切口消毒解剖区域。 用钳子（或消毒的戴手套的手）同时将切口的两侧拉向头部和尾部，切入腹部的皮肤，从腹部取出皮肤。 固定鼠标的前肢和后肢。 用剪刀切开腹腔，露出内脏。 定位胃和胃之间的小肠（结肠附近的”J”形结构）。通过切开胃下面和上方的小肠。 去除连接小肠褶皱的任何结缔组织和脂肪。注意：脂肪将有一个独特的白色，不像小肠的粉红色。 检查小肠的外部表面，寻找Peyer的斑块（PPs），这些斑块很小（+1毫米），椭圆形结构在一层半透明上皮细胞下呈白色。 用剪刀小心地切除所有可见的PP。注：一个 C57BL/6 野生型 （WT） 鼠标可以产生 4-8 PPs，而AID-/-鼠标将产生 6-10 PPs。 将 PPs 收集到 1.5 mL 微中福格管中，其中含有 1 mL 的 FACS 缓冲器在冰上。注意：PP应该下沉，而脂肪会浮到表面，可以去除。 2. FACS 的细胞隔离 将 40μm 过滤器放在 6 井盘中，配有 1 mL 的冷 （4 °C） FACS 缓冲器。 将 1.5 mL 管中的 PP 倒入过滤器。 使用 1 mL 的冷 FACS 缓冲器清洗 PP，确保它们始终处于液体和冰层中。 使用 1 mL 注射器的柱塞平端作为害虫，粉碎过滤器上的 PPs，直到过滤器上仅保留结缔组织。 用 1 mL 的冷 FACS 缓冲器清洗过滤器和柱塞，将细胞释放到 6 井盘中。 在冷 FACS 缓冲区中收集约 4 mL 的细胞，并通过 40μm 过滤器盖 FACS 管过滤它们。 用 1 mL 的冷 FACS 缓冲器清洗滤网盖。 在摆动桶离心机中，在 4 °C 下以 600 x g 的速度将细胞颗粒化 5 分钟。 去除超自然人。 在 0.4 mL 的冷 FACS 缓冲区中恢复细胞。 删除 10 μL 进行细胞计数以验证产量（预计 +5 x 106 细胞/鼠标，参见 图 3A） 将剩余的细胞通过 40μm 过滤器盖过滤到 FACS 管中，然后继续染色 FACS。 3. 为 FACS 染色 GCC 在 400 μL 细胞悬架中加入 1 μL Fc 块（未标记的反鼠标 CD16/CD32），并将细胞放在冰上 15 分钟。 添加2mL的冷FACS缓冲器来清洗细胞。 颗粒细胞在 600 x g 在 4 °C 5 分钟，并丢弃超自然。 在 80 μL 的冷 FACS 缓冲区中恢复细胞。 为每个染色控制从 WT PP 中去除 10 μL 的细胞（总共 4 个，包括 3 个单个污渍控制和 1 个未染色控制）。为下一步保留 WT PP 的 40 μL。或者，使用补偿珠进行染色控制。 在 500 μL 的冷 FACS 缓冲器中染色每个实验样本（例如 WT 和 AID–），在冰上用 2.5μL 的花生胶蛋白 （PNA） – 生物素 15 分钟。 添加2mL的冷FACS缓冲器来清洗细胞。 颗粒细胞在 600 x g 在 4 °C 5 分钟，并丢弃超自然。 用500微升的鸡尾酒在黑暗中，在冰上染色每个实验样本15分钟 （表1）。 确保细胞在染色鸡尾酒中完全恢复。 为补偿矩阵准备单个污渍控制。 使用 表 2中指定的稀释剂在 500μL 的冷 FACS 缓冲区中染色细胞。 在黑暗中，在冰上孵化染色控制器15分钟。 在步骤 3.7 和 3.8 中将 2 mL 冷 FACS 缓冲器添加到所有管中，颗粒细胞，并丢弃超自然体以洗掉未绑定的抗体或 DAPI。 将细胞在 500 μL 的冷 FACS 缓冲区中恢复并放置在冰上。 使用细胞分拣机，从每个染色实验样本中收集 B220+PNAHI。图3B显示了从WT和AID-/-PPs获得的B220+PNA HI的典型百分比。图3C显示FACS门控策略。 4. 从GCBC提取的DNA Pellet 在 4 °C 时将细胞分拣为 600 x g 5 分钟，然后丢弃超自然体。 将细胞重新注入1mL的冷FACS缓冲器中，并将细胞转移到1.5mL微中微管中。 在 4 °C 下以 600 x g 的速度将细胞颗粒化 5 分钟，然后丢弃超自然体。 在 500 μL 的 DNA 提取缓冲器和 5 μL 的 20 毫克/mL 蛋白酶 K 中补充细胞。 在56°C的夜间孵化。 用500μL异丙酚和1μL的20毫克/mL糖原沉淀DNA。通过倒置 5-6 倍彻底混合管。 在室温下孵化10分钟。 离心机在微中心中15分钟，在25°C在21，000 x g。 丢弃超自然物并保留含有沉淀DNA和糖原的颗粒。 用70%乙醇的1mL清洗DNA颗粒。 在 25 °C 的 21，000 x g下，将 DNA 在微中枢中颗粒 10 分钟。 取出70%的乙醇，将DNA颗粒空气干燥5-10分钟。注意：避免过度干燥，因为DNA可能不会完全补充水分。 在 30 μL TE 缓冲器中补充 DNA，并在 56 °C 的夜间孵化。 5. JH4 直子序列放大和分析 通过测量波长为 260 nm （A260） 的吸收量来量化 DNA。注：从 C57BL/6 小鼠的分拣 B220+PNAHI GCBC 中回收的 DNA 典型浓度为 20-40 ng/μL。 执行JH4直子的嵌套PCR（表3，表4）。将第一个 PCR 中使用的基因组脱氧核糖核酸总量标准化为最不集中的样本。（例如，如果最不集中的样本为 5 ng/μL，则使用 58.75 ng 的 DNA 作为 PCR #1中水的最大体积（11.75 μL）中的所有样本。 在 200 V 的 1.5% agarose 凝胶上解决 PCR 产品 20 分钟。预计放大幅度为580个基点。 从凝胶中提取放大器，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件提取DNA（见补充图1）。 用 30μL 的水将 DNA 稀释，并通过测量 A260 来量化 DNA 的量。注：纯化 PCR 产品的典型浓度为 3-10 ng/μL。 将纯化的 PCR 产品放入具有钝端的质粒中。标准化每次套合反应中使用的 PCR 产品总量（表5）。 在室温下孵化 5 分钟或在 16 °C 过夜的连带反应。 使用 2μL 的配对反应转换电能力细菌细胞。 电极速在1.65千伏。 在 225 rpm 的摇晃孵化器中，在 600 μL 的 SOC 介质中以 37 °C 的速度进行 1 小时的救援。 板 100 μL 的转化细菌到 LB 补充安培林 （100μg/mL） agar 板和孵化过夜在 37 °C. 使用 T7 前引物提交用于桑格测序的细菌菌落板。或者，生长每个细菌群落的隔夜培养物，并进行质粒净化。 如有必要，重复PCR、结对和/或转化，以优化细菌菌落的产量注：应从每个盘子中至少挑选 30 个殖民地。 标准化.txt文件中的序列数据 删除质粒序列。 确保每个序列根据 JH4 intron 参考序列 （NG_005838） 定向 5′ 到 3′ 。根据需要生成任何序列的反向补充。 使用 Clustal 欧米茄软件 （图 4A）将每个 PCR 获得的序列与 JH4 直子参考序列 （NG_005838） 对齐。 将参考序列中的差异识别为突变 通过检查桑格测序的电球图，验证所有突变都是真点突变。如有必要，重复排序。（图 4B，C） 。 为每个基因型（图 5）在 JH4 直子中表布和量化独特的突变。 仅对具有相同突变的序列进行计数一次注：无法确定相同的序列是在 PCR 期间生成的还是在不同的 B 单元中生成的相同 SHM 事件。 将WT生殖系JH4直子序列（即那些没有突变的）的每一个实例计算为一个独特的序列。