Минимальная витрификация незрелых кошачьих ооцитов
Summary
Данная рукопись описывает протокол для минимального объема витрификации незрелых кошачьих яйцеклеток с лабораторными носителями на коммерческих опорах. Она охватывает каждый шаг от изоляции яйцеклеток от ex vivo гонад до витрификации и потепления.
Abstract
В программах сохранения диких животных, gamete банковской имеет решающее значение для защиты генетических ресурсов ценных людей и редких видов и содействовать сохранению биоразнообразия. В фелидах большинство видов находятся под угрозой исчезновения, а отечественные породы используются в качестве модели для повышения эффективности протоколов для зародышевой плазмы банковской деятельности. Среди методов криоконсерваации ооцитов витрификация становится все более и более популярной в репродукции человека и ветеринара. Криотоп витрификация, которая была сначала разработана для человеческих яйцеклеток и эмбрионов, показал, что хорошо подходит для кошачьих яйцеклеток. Этот метод предлагает ряд преимуществ, таких как осуществимость в полевых условиях и скорость процедуры, которая может быть полезна, когда несколько образцов должны быть обработаны. Однако эффективность в значительной степени зависит от навыков оператора, и необходима внутри- и межлабораторная стандартизация, а также подготовка персонала. Этот протокол описывает минимальный объем витрификации незрелых кошачьих ооцитов на коммерческую поддержку в шаг за шагом поле дружественных протокола, от сбора яйцеклеток к потеплению. В соответствии с протоколом, сохранение целостности яйцеклеток и жизнеспособности при потеплении (до 90%) можно ожидать, хотя все еще есть возможности для улучшения после потепления созревания и эмбриональных результатов развития.
Introduction
Криоконсервационная помощь стала ключевым этапом вспомогательных методов воспроизводства (АРТ). В людях, оно позволяет консервацию плодородности или отсрочку parenthood для медицинских или личных причин. У животных необходимо преодолеть расстояние и время в запланированных спариваниях, особенно у сельскохозяйственных животных и домашних животных, или сохранить генетический материал ценных предметов в программах сохранения, особенно в диких исчезающих видов. Gamete криоконсервациония является лучшим выбором, когда лица, которые будут выведены еще не были выбраны или для того, чтобы избежать этических вопросов, связанных с замораживанием эмбрионов, особенно в человеческой медицине1. Сперматозоа относительно легко сохранить и дать удовлетворительные результаты после оттаивания, но ооциты, из-за их структурных особенностей, может быть более сложным для хранения. Действительно, низкое соотношение поверхности/объема, а также присутствие zona pellucida, окружающей оплазму, ограничивает движение криопротекторов и воды по клетке2. Кроме того, у домашних животных, включая фелиды, они характеризуются богатой липидами цитоплазмой, которая, как полагают, делает их более чувствительными к криоконсервациону3.
Большинство фелидов находятся под угрозой, и домашняя кошка используется в качестве модели для разработки протоколов для сохранения зародышевой плазмы благодаря наличию гонадов от обычной овариэктомии. У диких животных, гонады могут быть получены после факультативных операций или (чаще) посмертные,и незрелые (зародышевые пузырьки) гаметы могут быть извлечены. Гормональная стимуляция, направленная на получение зрелых (метафазы II) яйцеклеток, не так распространена, как в АТ человека из-за этических вопросов и видово-специфических ответ на лечение4.
Таким образом, развитие криоконсервации стратегии была сосредоточена на незрелых гамет, которые обычно могут быть извлечены после неожиданной или внезапной смерти редких людей. С биологической точки зрения, Есть некоторые различия в криоконсерваации незрелых или зрелых гамет, каждый из которых имеет свои преимущества. Во-первых, ДНК более защищена в незрелых яйцеклеток, чьи зародышевые пузырьки содержит хромосомы, окруженные ядерной мембраной, в то время как мейотический шпиндель метафазы II ооцитов может быть более уязвимым к криоинужуиру5. Во-вторых, холодинированные повреждения цитоскелета могут повлиять на вращение шпинделя, экструзию полярного тела, проядерную миграцию и цитокинез, которые могут иметь различные последствия в зависимости от фазы развития ооцитов, влияющих на прогрессирование мейоза или события пост-оплодотворения. Наконец, и, возможно, самое главное, в то время как зрелые яйцеклетки готовы к оплодотворению, незрелые гаметы полагаются на поддержку окружающих клеток cumulus, чтобы пройти через ядерную и цитоплазматическую созревание6, и это причина, почему целые кумулус-ооциты комплексов (COCs) криоконсервативные. Однако потеря кумулятивных клеток и/или потеря функциональной связи между гаметом и окружающими соматическими клетками, вероятно, являются наиболее пагубным эффектом криоконсерваации незрелых КОК.
Среди методов криоконсервации, витрификация является одним, которые могут быть применены более легко в полевых условиях. По сравнению с медленным (или контролируемым уровнем) замораживания, витрификация быстрее и не требует специального оборудования, например программируемого морозильника. Для того, чтобы удовлетворить три основных принципа витрификации (т.е. высокая вязкость, связанная с высокой криопротекторной концентрацией, небольшими объемами и сверхбыстрым снижением температуры), несколько носителей и опор особенно разработаны и используются у кошек как для незрелых, так и для зрелых яйцеклеток. Начиная с простых соломинки7, устройства были разработаны для достижения “Минимальный объем” цели. Cryoloop8, открытые вытащил соломинки (OPS)9, пластиковые желоба (модифицированная солома)10 и cryotubes11 были использованы, пока более эффективное устройство (т.е., Cryotop) был использован11, улучшение выживания и мейоз возобновления. Cryotop (Дополнительный рисунок 1) является коммерчески доступной поддержкой, которая стала выборной открытой системой витрификации. Разработанный для витрификации человеческих яйцеклеток и эмбрионов, он состоит из небольшой пленки полоса прилагается к жесткому пластиковому держателю, защищены пластиковой крышкой трубки во время хранения12. Благодаря своей удобство использования и экстремальному сокращению объема витрификации (всего 0,1 л), что также приводит к чрезвычайно быстрому похолоданию и потеплению, эта поддержка витрификации все чаще применяется в нескольких видах, в том числе в домашних кошачьих, в которых она была использована с различными средствами массовой информации13,14,15,16,17.
Цель этой рукописи состоит в том, чтобы описать сбор-витрификации потепление протокола, с незначительными изменениями от одного первоначально разработан для человека ооцитов, который использует лабораторных средств массовой информации и коммерческих поддерживает для минимального объема витрификации и может быть легко применен в полевых условиях для криоконсервации незрелых кошачьих COCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Криоконсервационизация ооцитов является важнейшим методом сохранения зародышевой плазмы, особенно в таксоне, где многие виды находятся под угрозой исчезновения, такие как семейство Felidae. В этой рукописи был представлен простой и полевой протокол для витрификации незрелых кошачьих яй…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана EVSSAR (Европейское ветеринарное общество для воспроизводства малых животных) Грант 2016 и Университет degli Studi ди Милано, Piano di Sostegno алла Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра МариаДжорджиа Морселли за ее вклад в эксперименты, которые были изображены, и в приобретении изображений.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
Referenzen
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Entwicklungsbiologie. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
