Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten
Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol voor de minimale volume vitrification van onrijpe katoocyten met laboratorium-gemaakte media op commerciële steunen. Het dekt elke stap van eicelisolatie van ex vivo gonaden tot vitrificatie en opwarming.
Abstract
In de instandhoudingsprogramma’s van wilde dieren is gamete banking cruciaal om genetische hulpbronnen van waardevolle individuen en zeldzame soorten te beschermen en het behoud van de biodiversiteit te bevorderen. In felids, de meeste soorten worden bedreigd met uitsterven, en binnenlandse rassen worden gebruikt als een model om de efficiëntie van protocollen voor kiemplasma bankieren te verhogen. Onder oocyte cryopreservatie technieken, vitrification is meer en meer populair in de menselijke en veterinaire ondersteunde voortplanting. Cryotop vitrification, dat in eerste instantie werd ontwikkeld voor menselijke eicellen en embryo’s, heeft aangetoond zeer geschikt te zijn voor kattenoraad. Deze methode biedt verschillende voordelen, zoals de haalbaarheid in het veld omstandigheden en de snelheid van de procedure, die nuttig kunnen zijn wanneer meerdere monsters moeten worden verwerkt. De efficiëntie is echter sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator en intra- en interlaboratoriumstandaardisatie zijn nodig, evenals personeelstraining. Dit protocol beschrijft minimale volume vitrificatie van onrijpe katachtige eicellen op een commerciële ondersteuning in een stap voor stap veld-vriendelijk protocol, van eicel collectie tot opwarming. Volgens het protocol, behoud van eicelintegriteit en levensvatbaarheid bij opwarming (tot 90%) kan worden verwacht, hoewel er nog ruimte is voor verbetering in de post-opwarming van de rijping en de embryonale ontwikkelingsresultaten.
Introduction
Cryopreservatie is uitgegroeid tot een belangrijke stap van geassisteerde reproductietechnieken (ART’s). Bij mensen, het maakt het behoud van de vruchtbaarheid of uitstel van het ouderschap om medische of persoonlijke redenen. Bij dieren is het noodzakelijk om afstand en tijd in geplande paringen te overwinnen, vooral bij boerderijdieren en huisdieren, of om genetisch materiaal van waardevolle onderwerpen in instandhoudingsprogramma’s te behouden, met name bij bedreigde diersoorten. Gamete cryopreservatie is de beste keuze wanneer de te fokken personen nog niet zijn gekozen of om ethische problemen in verband met het invriezen van embryo’s te voorkomen, vooral in de menselijke geneeskunde1. Spermatozoa zijn relatief eenvoudig te bewaren en geven bevredigende resultaten na ontdooien, maar eicellen, vanwege hun structurele kenmerken, misschien complexer op te slaan. Inderdaad, de lage oppervlakte /volume verhouding, evenals de aanwezigheid van de zona pellucida rond de ooplasma, beperkt de beweging van cryoprotectiva en water over de cel2. Bovendien worden ze bij huisdieren, waaronder feliden, gekenmerkt door een lipiderijk cytoplasma, waarvan wordt gedacht dat ze gevoeliger zijn voor cryopreservatie3.
De meeste feliden worden bedreigd, en de binnenlandse kat wordt gebruikt als een model om protocollen te ontwikkelen voor het behoud van kiemplasma dankzij de beschikbaarheid van gonaden van routine ovariectomie. Bij wilde dieren kunnen geslachtsklieren worden verkregen na electieve operaties of (vaker) postmortem,en onrijpe (kiemvellen) kunnen worden opgehaald. Hormonale stimulatie gericht op het verkrijgen van volwassen (metafase II) eicellen is niet zo gebruikelijk als in de menselijke ARTs vanwege de ethische kwesties en de soort- en individueel-specifieke reactie op behandelingen4.
Daarom is de ontwikkeling van cryopreservatie strategieën is gericht op onvolwassen gameten, die meestal kan worden opgehaald na de onverwachte of plotselinge dood van zeldzame individuen. Vanuit biologisch oogpunt zijn er enkele verschillen in de cryopreservatie van onrijpe of volwassen gameten, elk met zijn voordelen. Ten eerste is DNA beter beschermd in onrijpe eicellen, waarvan de kiemvezel chromosomen bevat die zijn omgeven door een nucleair membraan, terwijl de meiotische as van metafase II-eicellen kwetsbaarder zou kunnen zijn voor cryoinjuries5. Ten tweede kunnen koud-geïnduceerde cytoskeletschade de rotatie van de as, de extrusie van het polaire lichaam, de pronucleaire migratie en cytokinese beïnvloeden, wat verschillende effecten kan hebben volgens de ontwikkelingsfase van oocyten, die meioseprogressie of post-fersiegebeurtenissen beïnvloedt. Tot slot, en misschien wel het belangrijkste, terwijl volwassen eicellen klaar zijn om bevrucht te worden, vertrouwen onrijpe gameten op de steun van de omliggende cumuluscellen om door nucleaire en cytoplasmamische rijping te gaan6, en dit is de reden waarom hele cumulus-eicellencomplexen (COC’s) worden gehuild. Echter, het verlies van cumulus cellen en / of het verlies van functionele verbinding tussen de gamete en de omliggende somatische cellen zijn waarschijnlijk het meest nadelige effect van cryopreservatie van onrijpe COCs.
Onder cryopreservatie technieken, vitrification is er een die gemakkelijker kan worden toegepast in het veld voorwaarden. In vergelijking met langzame (of gecontroleerde snelheid) bevriezing, vitrification is sneller en vereist geen specifieke apparatuur, zoals een programmeerbare vriezer. Om te voldoen aan de drie fundamentele principes van vitrificatie (d.w.z. hoge viscositeit, verbonden met hoge cryoprotectantconcentratie, kleine volumes en ultrasnelle temperatuurdaling), zijn verschillende media en steunen speciaal ontwikkeld en gebruikt bij katten voor zowel onrijpe als volwassen eicellen. Beginnend met eenvoudige rietjes7,werden de apparaten toen ontwikkeld om het doel “Minimum volume” te bereiken. Cryoloop8, open pulled straws (OPS)9, plastic goten (gemodificeerd stro)10 en cryotubes11 zijn gebruikt, totdat een efficiënter apparaat (dat wil zeggen, Cryotop) werd gebruikt11, verbetering van de overleving en meiose hervatting. Cryotop (Supplemental Figuur 1) is een commercieel beschikbare ondersteuning die is uitgegroeid tot de keuze open systeem voor vitrification. Ontwikkeld voor de vitrificatie van menselijke eicellen en embryo’s, het bestaat uit een kleine film strip bevestigd aan een harde plastic houder, beschermd door een plastic buis dop tijdens opslag12. Dankzij de bruikbaarheid en de extreme vermindering van het vitrificatievolume (zo weinig als 0,1 μL), wat ook leidt tot extreem snelle koel- en opwarmingspercentages, is deze vitrificatiesteun steeds vaker toegepast in verschillende soorten, waaronder de huiskat, waarbij deze is gebruikt met een verscheidenheid aan media13,14,15,16,17.
Het doel van dit manuscript is om een collectie-vitrification-warming protocol te beschrijven, met kleine wijzigingen van de oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke eicellen, die laboratorium-en-klare media en commerciële ondersteuning voor een minimum volume vitrification gebruikt en kan gemakkelijk worden toegepast in het veld omstandigheden voor de cryopreservatie van onrijpe katachtige COC’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte cryopreservatie is een cruciale kiemplasma behoud techniek, vooral in taxa waar veel soorten worden bedreigd, zoals Felidae familie. In dit manuscript werd een eenvoudig en veldvriendelijk protocol voor de vitrificatie van onrijpe katoocyten gepresenteerd. Laboratoriummedia, ondersteuning van het minimale volume vitrification en opgeleid personeel zijn de belangrijkste factoren voor het succes van deze methode, die het mogelijk maakt om consequent en herhaaldelijk levensvatbare eicellen te verkrijgen, zoals blijkt…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 en door Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). We willen ook dr. MariaGiorgia Morselli bedanken voor haar bijdrage aan de experimenten die hierbij worden afgebeeld en aan de beeldaanwinst.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
Referenzen
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Entwicklungsbiologie. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
