未成熟费林卵母细胞的最小体积玻璃化

冷冻保存已成为辅助生殖技术（ART）的关键步骤。在人类中，它允许保留生育能力或因医疗或个人原因推迟为人父母。在动物中，有必要克服距离和时间在计划交配，特别是在农场动物和宠物，或保存遗传物质的宝贵主题在保护计划，特别是在野生濒危物种。游戏冷冻保存是最佳选择，当被培育的个体尚未被选中或为了避免与胚胎冷冻相关的伦理问题，特别是在人类医学^1。Spermatozoa 相对容易保存，解冻后给出令人满意的结果，但由于卵母细胞的结构特征，其储存可能更为复杂。事实上，低表面/体积比，以及围绕乌普拉斯玛的佐纳佩普西达的存在，限制了低温保护物和水在细胞^2的移动。此外，在家畜，包括幸福动物，他们的特点是脂质丰富的细胞质，这被认为是使他们更敏感的冷冻保存^3。

大多数猫都受到威胁，由于常规的奥瓦里切除术提供性腺，家猫被用作开发种质保存协议的模型。在野生动物中，性腺可以在选择性手术后或（更频繁地）验尸后获得，并且可以检索到不成熟的（胚芽囊泡）游戏物。激素刺激旨在获得成熟（元相II）卵母细胞是不太常见的人类ART，因为伦理问题和物种和个人特异性反应治疗^4。

因此，低温保存策略的发展侧重于不成熟的配子，这些配子通常可以在罕见个体意外或突然死亡后被检索。从生物学的角度来看，不成熟或成熟的配子的低温保存存在一些差异，每种游戏体都有其优点。首先，DNA在未成熟的卵母细胞中受到更多的保护，其胚芽囊囊含有被核膜包围的染色体，而元相II卵母细胞的卵母体主轴可能更容易受到低温损伤^5。其次，冷诱发的细胞骨架损伤可能会影响主轴旋转、极体挤压、亲核迁移和细胞因子，根据卵母细胞发育阶段，它们可能产生不同的影响，影响美因病进展或受精后事件。最后，也许最重要的是，虽然成熟的卵母细胞已准备好受精，但不成熟的卵母细胞依靠周围积细胞的支持来度过核和细胞质成熟^6，这就是为什么整个积细胞-卵母细胞复合物（COCs）是冷冻保存的原因。然而，累积细胞的丧失和/或游戏细胞与周围体细胞之间功能连接的丧失可能是未成熟COCs的低温保存的最有害影响。

在低温保存技术中，玻璃化是一种在野外条件下更容易应用的技术。与缓慢（或受控速率）冷冻相比，玻璃化速度更快，不需要特定的设备，如可编程冰柜。为了满足玻璃化的三个基本原则（即高粘度，与高低温保护浓度、体积小和超快速温度降低有关），在猫中特别开发和使用了几种介质和支架，用于成熟和成熟的卵母细胞。从简单的吸管^7开始，设备被开发，以达到”最小体积”的目标。Cryoloop^8，开拉吸管^{（OPS）9，}塑料排水沟（改性吸管^）10和冷冻管¹¹已经使用，直到一个更高效的装置（即冷冻站）被采用^11，改善生存和梅病恢复。Cryotop（ 补充图 1） 是一种市售支持， 已成为玻璃化的选修开放系统.它专为人类卵母细胞和胚胎的玻璃化而开发，由附着在硬塑料支架上的小型薄膜条组成，在储存¹²期间由塑料管盖保护。由于其可用性和极小的玻璃化体积（低至0.1μL），这也导致极快的冷却和变暖率，这种玻璃化支持已越来越多地应用于几个物种，包括家猫，其中它已被用于各种媒体13，14，15，16，17。^{13,14,15,16,17}

本手稿的目的是描述一个收集-玻璃化-加热协议，与最初为人类卵母细胞开发的，使用实验室制造的介质和商业支持，以最小体积的玻璃化，可以很容易地应用于现场条件，为不成熟的猫科动物的低温保存。