시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

1. smFISH 프로브 준비 참고: 단일 플루오로포어로 smFISH 프로브를 라벨을 부착하려면 NHS 에스테르화학(21)에기초한 핵산 올리고뉴클레오티드라벨링표준 프로토콜을 따르십시오. smFISH 프로브를 디자인합니다. 관심 유전자에 대해 “타일링” 프로브 또는 “배열”프로브(도 1)를사용할지 여부를 결정합니다. 결정을 내리는 방법에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. “타일링”프로브(그림 1A)의경우 온라인 프로브 디자이너 도구(예: 재료 표 참조)를 사용합니다. Table of Materials “배열”프로브(도 1B)의경우, 블라스트 서열 검색을 수행하여 프로브 서열이 다른 mRNA 서열에 상보적이지 않도록 합니다. lacZ mRNA 전사 및 분해 운동학을 연구하려면, 24개의 프로브 2세트를 사용하며, 각 세트는 lacZ(3,072bp)19의첫 번째 및 마지막 1kb 영역을 덮는다. lacZ참고: 이러한 프로브 세트는, 본래, 각각 “5′ mRNA 프로브” 및 “3′ mRNA 프로브”로 지칭된다. 이러한 프로브의 시퀀스는 재료 표에나열됩니다. 5’끝에 C6 아미노 링커가 있는 DNA 올리고뉴클레오티드로 프로브 서열을 주문합니다. 개별 프로브를 물에 1m로 용해합니다. “5′ mRNA 프로브”와 “3′ mRNA 프로브” 세트에 대 한 프로브의 equimolar 금액을 결합. 예를 들어, lacZ에대해 설정된 5′ mRNA 프로브의 경우 각 프로브의 20 μL(세트내 총 24종의 프로브)을 결합합니다. 결합된 프로브의 에탄올침전(22)을 수행하여 균주 반응을 억제할 수 있는 1차 및 이차 아민(예: Tris, 글리신 및 암모늄 염)의 오염을 제거합니다. 결국, DNA 펠릿을 100μL의 물(프로브 세트에서 ~4.5mMM의 DNA 산출)에 용해한다.참고: 이 단계는 프로브가 제조업체에 의해 표준 염무제 정제를 받은 경우에도 권장됩니다. 표준 필터 기반 정화는 에탄올 강수량 대신 및 그 외에 작동할 수 있다. 5’와 3’mRNA 프로브 세트를 차별화하여 표시할 수 있도록 단기능 NHS 에스테르 모이티를 가진 두 개의 스펙트럼 뚜렷한 형광을 선택하십시오. 예를 들어, 3’mRNA 프로브에 대 한 5′ mRNA 프로브및 Cy3B NHS 에스테르에 대 한 Cy5 NHS 에스테르를 준비. 최종 20 mg / mL (~25 mMM)에 무수 DMSO에 형광의 각 유형을 용해. 각 라벨링 반응 직전에 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)을 준비한다. 장시간 공기에 노출되면 pH가 낮아지고 라벨링 효율이 줄어듭니다. 균주 반응의 경우, 다음을 결합: 15 μL 의 Cy5 불소소 재주 (1.5 단계에서), 5 mRNA 프로브 세트의 4 μL (단계 1.4에서), 중탄산 나트륨의 75 μL (1.6 단계에서), 물 7 μL. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 3-6시간 동안 흔들어 줍니다.참고: 인큐베이션이 길어질수록 라벨링 효율이 높아지는 것은 아닙니다. 또한, 성분의 농도가 유지되면 반응이 위또는 아래로 확장될 수 있다. 3’mRNA 프로브 세트 및 해당 형광소(즉, Cy3B NHS-ester)에 대한 위의 단계를 반복한다. 에탄올침전(22)을 수행하여 반응하지 않은 염료 분자를 제거합니다. 펠릿을 TE 버퍼의 ~50 μL에서 녹입니다(1mM EDTA로 10m Ts-HCl pH 8.0). UV-Vis 분광기를 사용하여 DNA와 형광의 농도를 추정합니다. 흡광도는 260nm 및 559 nm(Cy3B) 또는 649nm(Cy5)에서 측정합니다. 시료가 너무 집중되어 정확한 측정을 산출하면 시료의 1 μL을 10 μL로 희석합니다. 흡광도를 농도로 변환합니다.εDNA = 0.2 μM-1 (20nt 단일 가닥 DNA용), εCy5 = 0.25 μM-1,및 εCy3B = 0.13 μM-1참고: [DNA]는 용액 내의 총 프로브의 농도입니다. 개별 프로브의 농도는 약 24배 낮습니다. 총 프로브의 농도는 이 시점부터 “프로브 농도”로 사용됩니다. [DNA] 및 [염료] 사이의 비율이 1인 경우, 다음 HPLC 단계는23을건너뛸 수 있으며, 샘플은 TE 버퍼에서 최종 4-5 μM으로 희석되어야 한다. (추천) 레이블이 지정되지 않은 프로브에서 표지된 프로브를 정화하고 HPLC를 사용하여 무료 염료를 제거합니다.참고: 이 추가 정화 단계는 시료 손실로 이어질 수 있지만 다운스트림 응용 프로그램에 유용합니다. 표지가 없는 DNA 프로브를 제거하면 mRNA 표적으로부터형광 신호를 증가시키고 반응하지 않은 염료를 제거하면 배경 형광이 감소합니다. 표준 분석 C18 컬럼, 0.1 M 트리에틸라모늄 아세테이트(TEAA) 완충A, 완충B로 아세토나이트로 HPLC를 준비한다. 샘플에 1M TEAA를 추가하여(1.9단계에서) 0.1M TEAA를 만듭니다. 0-5분 B, B의 0-30% 선형 그라데이션으로 5-35분, 그라데이션 프로그램을 다음과 같이 설정합니다. 35-37 분 B의 30-100 % 선형 그라데이션, 37-40 분 0 % B. 0.1 mL /min에서 유량을 유지하고 260 및 649 nm (Cy5 라벨 샘플의 경우) 또는 260 및 559 nm (Cy3B-샘플 라벨)에서 크로마토그램을 기록하십시오. DNA와 불소채널 모두에서 흡수성이 증가할 때 용출된 샘플을 수집합니다. 진공 농축기를 사용하여 용출된 시료를 농축하고 50-100 μL TE 버퍼로 펠릿을 다시 중단한다. UV-Vis 분광기를 사용하여 DNA와 형광의 농도를 확인하십시오(1.10단계 참조). 희석, 필요한 경우, 4-5 μM 주위에 최종 농도를 만들기 위해. -20 °C에서 프로브를 저장 2. 솔루션 준비 많은 양의 DEPC 처리 된 물과 버퍼(표 1)를준비합니다. 이러한 솔루션은 실온에서 1년 이상 지속될 수 있습니다. 4 배 고정 용액을 준비하고 세척 용액(표 1)을준비합니다. 사전 혼성화 솔루션 및 프로브 하이브리드화솔루션(표 1)을준비합니다. 5.1 단계 또는 6.1 단계에서 인큐베이션 중에 프로브 혼성화 용액을 준비한 다음 37°C 싱크탑 셰이커에 용액을 20-40분 동안 유지하여 빛에 대한 노출을 최소화합니다.참고: 포르마미드, SSC 및 프로브의 농도는 실제 신호를 최대화하면서 배경 형광을 최소화하기 위해 lacZ 프로브 세트에 최적화되었습니다. 다른 응용 프로그램에 대한 이러한 농도를 수정하는 방법에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 3. 커버립 및 유리 슬라이드 준비 커버립과 유리 슬라이드를 청소합니다. 개별 커버립과 슬라이드를 집게를 사용하여 코플린 항아리에 놓습니다. 커버립과 슬라이드가 서로 닿지 않고 분리되어 있는지 확인합니다. 항아리를 100% 에탄올로 채우고 뚜껑을 닫습니다. 항아리를 수조 초음파 청소기에 놓고 15-20 분 동안 초음파 처리하십시오.참고: 수조 초음파 처리기의 경우 히터 기능을 끄는 것이 좋습니다. 에탄올을 붓고 초순수로 3-4배 씻어내라. 정수기에서 직접 흐르는 물을 사용하십시오. 항아리에서 물을 붓고 70 % 에탄올로 채웁니다. 뚜껑을 닫고 15-20 분 동안 초음파 처리를 수행하고 초순수물로 씻어 내보시다. 항아리를 초순수물로 채우고 15-20분 동안 초음파 처리합니다.참고: 커버립과 유리 슬라이드는 초순수물로 채워진 코플린 항아리에 밤새 보관할 수 있습니다. 깨끗한 집게를 사용하여 코플린 항아리에서 슬라이드 나 커버 슬립을 가져 와서 N2 가스를 사용하여 블로우 드라이하십시오. 나머지 슬라이드 및 커버립에 대해 이 작업을 반복합니다. 말린 슬라이드를 7.5 단계에서 사용할 때까지 깨끗한 보관 상자에 놓습니다. 말린 커버립을 빈 1,000μL 파이펫 팁 박스에 놓아 나머지 절차에서 “챔버”로 사용됩니다. 소수성 마커를 사용하여 파이펫 팁 박스의 원형 구멍에 따라 커버립에 원을 그립니다. 이 원(직경 0.5cm)은 “우물”로 작용합니다. 마커가 완전히 건조될 때까지 최소 5-10분 이상 기다립니다.참고: 팁 박스 뚜껑을 닫는 다. 각 웰에 0.1%의 폴리 L-리신을 20μL 드롭으로 적용합니다. 실온에서 10-50분 동안 배양하십시오.참고: 이 볼륨을 양크기에 따라 조정합니다. 솔루션이 우물 영역을 완전히 커버하도록 합니다. 더 긴 잠복식을 위해 증발을 피하십시오. 잠복 후 폴리 L-리신이 표면을 만지지 않고 흡인후 폴리 L-리신을 긁어 냅니다. 그런 다음 DEPC 물의 방울(~20 μL)을 폴리 L-리신 처리 된 우물에 적용합니다. “챔버”의 뚜껑을 닫아 5.1 단계까지 증발을 방지하십시오. 4. 타임코스 실험 및 샘플 고정 250mL 플라스크에서 ~20mL 액체 배양에서 대장균 세포를 성장시다. 플라스크를 수조 셰이커(30°C)에 보관하고 계속 흔들어 줍니다. 샘플을 채취하는 경우에만 셰이커를 중지합니다.참고: 본 논문에 제시된 결과는 M9 최소 배지에서 재배된 MG1655 세포로부터 0.2% 글리세롤, 0.1% 카산산, 1 mg/L 티아민에서 기하급수적 성장 단계(OD600~0.2)에서 얻어진다. 빈 1.5mL 튜브에 4x 고정 용액의 250 μL을 추가합니다. 여러 튜브를 반복하고 준비할 수 있습니다. 시간 포인트 번호로 튜브에 라벨을 지정하고 실온에서 보관하십시오. 시간 과정 실험을 시작하기 전에 세포 배양 (OD600~0.2)의 750 μL을 가져 가라. “시간 제로”로 표시된 튜브에 문화를 추가합니다(4.2단계에서). 튜브를 부드럽게 반전하여 셀을 고정 용액과 혼합합니다.참고: 세포에 혼합, 소용돌이 또는 “거칠게” 위아래로 피펫하지 마십시오. 이 샘플은 억압된 상태를 나타내며 단일 mRNA의 형광 강도를 계산하는 대조군으로 사용될 것이다(단계 9.4 참조). 0.02-1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈라크토피라노사이드(IPTG)를 액체 배양에 첨가하여 lacZ 발현을 유도한다. 이 시점에서 타이머를 시작하고(t = 0분) 다음부터 특정 시간 간격(예: 1분마다)으로 샘플을 채올 경우 샘플링합니다. 샘플링을 위해 4.3 단계를 반복합니다. 5 mM orthonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) 또는 500 mM 포도당24 시간 동안 특정 시간에 추가 (예를 들어 t = 1.5 분) lacZ 발현을 억압. 억압 후, mRNA 분해를 추적하기 위해 배양(Step 4.3)을 계속 샘플링한다.참고: 억압은 ~400 μg/mL 리팜피신, 전사 개시억제제(25)로도수행할 수 있다. 고정을 위해, 15 분 동안 실온에서 샘플링 된 세포를 포함하는 튜브를 인큐베이션한 다음 30 분 동안 얼음속의 배양을합니다. 고정제를 제거하려면 실온에서 4 분 동안 4,500 x g의 튜브원심분리하십시오. 파이펫으로 상체를 제거합니다.참고: 안전 프로토콜에 따라 별도의 폐기물 용기에 포름알데히드를 폐기해야 합니다. 1mL DEPC-PBS를 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다. 원심분리 및 재서스펜션을 2배 더 반복합니다.참고: 고정 된 세포는 깨지기 쉽고 부드러운 치료가 필요합니다. 조심스럽게 펠릿을 다시 중단하고 거품을 피하십시오. 최종 세척 단계 후 ~ 30 μL DEPC-PBS에서 세포를 다시 중단합니다. 5. 세포막의 투과성 각 시간 점 샘플을 커버슬립의 다른 우물에 적용합니다(웰당 ~30 μL). 셀이 표면에 부착될 때까지 실온에서 10-30분 기다립니다. 우물 사이에 액체 방울의 병합을 피하십시오. 언바운드 셀을 헹구려면 액체를 흡인하고 각각 의 양에 ~20 μL DEPC PBS를 적용합니다. 몇 분 이내에 DEPC PBS를 흡인. 세포막을 4분 동안 각 웰에 70%의 70%의 15μL을 적용하여 세포막을 충자화한다. 4 분 후에 에탄올을 흡입하고 우물이 완전히 건조했는지 확인하십시오.참고: 에탄올 치료를 4분 동안 제한하는 것이 중요합니다. 더 긴 치료는 과다 투과화귀귀착됩니다. 각 웰에 워시 용액의 30 μL을 적용합니다. 6. 프로브 혼성화 각 우물에서 세척 용액을 흡인. 각 웰에 사전 혼성화 솔루션의 30 μL을 적용합니다. 37°C 오븐에서 챔버를 30분 동안 배양합니다.참고: 습도를 제공하기 위해 챔버 바닥에 ~50mL의 물을 추가합니다. 각 웰에서 사전 혼성화 솔루션을 흡인합니다. 프로브 혼성화 용액의 ~30 μL을 각 웰에 적용합니다. 알루미늄 호일로 챔버를 덮고 37°C 오븐에서 2시간 동안 배양합니다.참고: 프로브 혼성화 용액이 이 단계 전에 37°C 싱크탑 셰이커에 있는지 확인합니다. 우물 사이에 액체가 병합되는 것을 피하십시오. 필요한 경우 각 웰에 더 적은 양의 솔루션을 적용합니다. 7. 혼성화 후 세척 및 이미징 준비 멀티채널 파이펫을 사용하여 세척 용액의 ~30 μL을 한 번에 각각 양호하게 적용합니다. 흡입하고 세척의 3-5 배 시간을 반복합니다. 챔버를 37°C 오븐에서 15-30분 동안 배양합니다. 7.1 단계를 두 번 더 반복합니다. DEPC-PBS로 각각 5배 나 씻어내라. 7.1 단계에서 사용되는 방법을 따르지만 인큐베이션 프로세스를 건너뜁니다. 커버슬립에서 액체를 흡인합니다. 각 우물에 DEPC-PBS의 4 μL을 적용합니다. 집게를 사용하여 커버슬립을 들어 올리고 뒤집고 유리 슬라이드 위에 부드럽게 놓습니다(3.2 단계에서). 거품을 피하십시오. 실리콘 치과 검으로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 잇몸이 굳어지를 때까지 기다립니다. 여기서 일시 중지하고 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 저장할 수 있습니다.참고: 다른 smFISH 프로토콜은 산소 청소 시약(예를 들어, 포도당 산화/카탈라제)을 추가하거나 상업용 안티페이드 장착매체(14,,26)를 사용하여 형광류의 광안정성을 높이는 것을 제안한다. 8. 이미징 관심 영역을 찾으려면 위상 대비 이미징의 라이브 모드를 사용합니다. 무대 조이스틱을 조작하여 우물 내에서 시야를 변경합니다. 세포 밀도가 최적 영역을 선택하십시오(즉, 대부분 분리된 세포가 많이 있습니다). 위상 대비 셀 이미지가 초점을 맞출 수 있도록 z 초점을 조정합니다. Cy5(4-s 노출), Cy3(2-s 노출), 위상 대비(0.2-s 노출) 순으로 스냅샷을 찍습니다.참고: Cy3B 염료 분자는 Cy3 채널에서 이미지되고 이미지는 Cy3 이미지라고 합니다. 8.1-8.2 단계를 반복하여 우물 내에서 ~10개의 다른 영역의 이미지를 수집합니다. 목표를 다른 우물로 이동하고 8.1-8.3 단계를 반복합니다. 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다. (선택 사항) 이미지 다색 구슬은 이미지 등록을 위해 Cy5와 Cy3 채널 사이의 공간 변화를 결정하기 위해 Cy5 및 Cy3 채널의 커버슬립 표면에 흡착되어 있습니다. 깨끗한 커버슬립 표면에 다색 형광구비드(직경 0.2μm)를 바르고 10-30분 정도 기다립니다. PBS의 ~50 μL로 세척한 후 PBS의 ~5 μL을 바르고 커버슬립을 유리 슬라이드로 샌드위치로 처리합니다. 현미경에 밀봉하고 장착하십시오. Cy5 및 Cy3 채널 모두에서 이미지 구슬. 9. 이미지 분석 참고: 이 단계에서 사용되는 Matlab 코드는 다음 GitHub 웹 사이트인 https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020 사용할 수 있습니다. GitHub 폴더에는 셀 세분화 및 스팟 식별을 위한 매개 변수 값을 포함하여 이미지 분석에 필요한 모든 것이 포함되어 있습니다. 이 단계의 절차는 마스터 스크립트에서 “FISHworkflow.m”이라고 더 설명됩니다. 미생물추적기(27) 또는 우프티(28)와28같은 세포 세분화 도구를 열고 위상 대비 이미지를 로드합니다. “독립 프레임”을 선택하고 “모든 프레임”이라는 버튼을 눌러 셀이 식별되고 윤곽선이 계산되는 세분화 프로세스를시작합니다(그림 3B,C).참고: 이러한 소프트웨어 패키지를 사용하기 위한 자세한 프로토콜은 온라인에서 사용할 수 있습니다(예: oufti.org). 미생물추적기 또는 우프티의 스팟파인더 기능에 Cy5 형광 이미지를 로드하고,”실행”버튼을 눌러 2D 가우시안피팅(그림 3B,C)에따라 스팟 식별 및 정량화를 시작합니다. Cy3 형광 이미지에 대해 이 단계를 반복하여 Cy3 채널의 반점을 분석합니다. 이 단계는 각 셀의 강도 및 좌표를 포함하여 반점 목록을 생성합니다. (선택 사항) FISHworkflow.m 파일에 설명된 대로 임계값을 사용하여 희미한 반점(거짓 긍정)을 필터링합니다.참고: 음수 제어(예: MG1655 ΔlacZ)에서형광 반점을 검사하고 거짓 긍정을 필터링하는 임계값을 결정합니다. 단일 mRNA의 현물 강도를 얻으려면, (IPTG를 추가하기 전에) 시간 제로에서 측정된 현물 강도 목록을 사용하고, 두 개의 혼합물 성분과 가우시안 혼합물 모델과 스팟 강도의 분포를 맞춥니다. 단일 mRNA의 반점 강도로서 첫 번째 가우시안 인구(도 3D,E의검은 선)의 피크 위치를 차지하십시오. Cy5 스팟 및 Cy3 스팟에 대해 별도로 수행하여 단일 5′ 및 3’lacZ mRNA의 반점 강도를 얻습니다.참고: 단일 mRNA의 반점 강도가 다른 실험에서 약간 다를 수 있기 때문에 모든 시간 과정 실험에서 이를 반복합니다. 한 지점의 형광 강도를 단일 mRNA의 강도(9.4단계로부터)로 나누어 한 지점 내의 mRNA 수를 얻습니다. 셀 내의 합 정규화 된 스팟 강도는 셀에서 mRNA의 총 수를 계산한다(도3F). 5′ 및 3’mRNA에 대해 이러한 계산을 별도로 수행합니다. 각 시점에서 세포당 평균 mRNA 숫자를 계산 및 플롯(예를 들어, 도 4B),평균 mRNA 수준(도4B)의시간적 변화로부터 전사 및 mRNA 분해의 생체 내 운동학을 분석한다. 전사 신장속도를 얻으려면, 5′ 및 3’mRNA 신호에서 초기 상승에 대한 라인의 최소 제곱 피팅을 수행하고 기저수준(도 4B)에대한 요격을 식별한다. 이러한 요격의 차이는 RNAP가 5′ 프로브 영역에서 3’프로브 영역으로 이동하는 평균 시간을 나타냅니다. 이 때 두 프로브 세트(2kb)와 거리를 나누어 전사 신장의 평균 속도를 얻습니다. mRNA 분해 속도를 얻으려면 지수 부패 함수, y =A·ep(-t/θ)를 5′ 및 3′ mRNA 신호(예를 들어, 도 4B)의최종 부패 부위에 맞춥니다. 피팅 매개 변수, θ는 평균 mRNA 수명입니다. (선택 사항) 각 세포에서 mRNA 숫자의 분포를 기반으로 유전자 발현(예를 들어, 도 4C에표시된 유도에 대한 세포 수준 반응)의 세포 간 변이를 분석합니다(9.5단계에서 계산됨). (선택 사항) 셀의 주요 축 및 작은 축을 따라 스팟 위치에 대한 정보를 사용하여(9.2단계에서 얻은) mRNA(도4D,E)의국소화를 분석한다. (선택 사항) Cy5 및 Cy3 채널에서 검출된 반점의 국소화를 비교하여 5′ 및 3mRNA(그림5)의공동 국소화를 분석합니다. 마이크로베트래커에서 스팟파인더F 기능에 다색 구슬(8.6단계)의 이미지를 로드하고 Cy5 및 Cy3 채널에서 비드 센트로이드 좌표를 얻습니다. 중심 좌표 목록을 사용하여 Affine 변환 행렬을 계산하여 Cy5 및 Cy3 채널이 서로 에 대해 어떻게 이동하고 회전하는지알려줍니다.29. Cy5 및 Cy3 FISH 이미지에 affine 변환 매트릭스를 적용하여 Cy5 좌표에서 Cy3 이미지를 변환합니다. 스팟이 다른 채널의 다른 스팟과 공동 지역화된 경우 분류합니다. 예를 들어, Cy5 채널의 스팟은 중심가 사이의 거리가 150nm 미만인 경우 Cy3 채널의 다른 지점과 공동 국한되는 것으로간주됩니다(그림 5). 각 시점에서 Cy3 스팟과 “공동 지역화”로 분류되는 Cy5 스팟 수를 분석합니다. 또한, 공동 국화 된 반점의 강도를 분석(도 5).