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Medizin

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Published: July 01, 2020
doi:
10.3791/61516
, , ,
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi”, 2IRCCS Santa Lucia Foundation, 3Department of Biology and Biotechnology, “C. Darwin” Sapienza University,CNR – IBPM, 4CNR – Institute of Biomedical Technologies (ITB)

Summary

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Abstract

La distrofia muscular autosómica dominante de Emery-Dreifuss (EDMD) es causada por mutaciones en el gen LMNA, que codifica las laminas nucleares de tipo A, proteínas de filamento intermedio que sostienen la envoltura nuclear y los componentes del nucleoplasma. Recientemente informamos que el desgaste muscular en EDMD puede atribuirse a disfunciones epigenéticas intrínsecas que afectan a la capacidad regenerativa de las células madre musculares (satélite). El aislamiento y el cultivo de miofibers individuales es uno de los enfoques ex-vivo más fisiológicos para monitorear el comportamiento de las células satélite dentro de su nicho, ya que permanecen entre la lámina basal que rodea la fibra y el sarcolemma. Por lo tanto, representa un paradigma experimental invaluable para estudiar células satélite a partir de una variedad de modelos muriados. Aquí, describimos un método readap adaptable para aislar miofibras individuales intactas y viables de los músculos de la extremidad posterior(Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius y Soleus). Siguiendo este protocolo, pudimos estudiar células satélite de Ratones Lamin 8-11 -/- , un modelo murino EDMD severo, a sólo 19 días después del nacimiento.

Detallamos el procedimiento de aislamiento, así como las condiciones de cultivo para obtener una buena cantidad de miofibers y su progenie derivada de células de satélite asociadas. Cuando se cultivan en factores de crecimiento medios ricos, las células satélite derivadas de ratones de tipo salvaje activan, proliferan y eventualmente se diferencian o sufren de auto-renovación. En ratones mutantes homocigotos Lamin 8-11 -/- estas capacidades están gravemente deterioradas.

Esta técnica, si se sigue estrictamente, permite estudiar todos los procesos vinculados a la célula satélite asociada a la miofibra, incluso en las primeras etapas de desarrollo postnatal y en los músculos frágiles.

Introduction

El músculo esquelético es un tejido diferenciado con una de las capacidades más extendidas para regenerarse después del ejercicio o trauma1. Esta característica se debe principalmente a la presencia de células madre, llamadas células satélite debido a su posición periférica entre la lámina basal y el plasmalemma de la miofibra2. Durante el desarrollo postnatal, las células satélite proliferan y se diferencian progresivamente, contribuyendo así al crecimiento muscular esquelético. Una vez en la edad adulta, las células satélite entran en un estado de reposo reversible, y tras un trauma fisiológico o patológico, se activan, proliferan y diferencian con el fin de reparar los músculos dañados3. Los defectos en la capacidad de las células satélite para transitar adecuadamente a través de estas diferentes fases regenerativas y someterse a la auto-renovación se han relacionado firmemente con el desgaste muscular, ya sea durante el envejecimiento fisiológico4,,5,6 o en enfermedades degenerativas musculares, tales como distrofias musculares7,8,9,10.

Existen dos enfoques de cultivo principales para estudiar las células de satélite ex-vivo: cultivos miogénicos primarios a partir de células mononucleadas, disociadas mecánica y químicamente de todo el músculo11,12; o cultivo de miofibras aisladas13,14,15,16,17,18,19,20. En el primer caso, el proceso de aislamiento de células satélite implica la trituración de músculos enteros extraídos del ratón, una digestión química, filtración y clasificación celular activada fluorescente (FACS)21. Este procedimiento, aunque eficaz en el aislamiento de células satélite de una variedad de modelos, implica varias variables que exponen las células satélite al estrés y perturba su nicho fisiológico22,,23. Por el contrario, el aislamiento de miofiber implica una digestión más suave del tejido muscular con enzimas degradantes de matriz y una trituración mecánica que causa un trauma reducido a las células madre20. Este segundo enfoque permite una recuperación mucho más eficiente de células satélite viables, que permanecen físicamente unidas a su miofibra entre la lámina basal y el sarcolemma, permitiendo así el análisis dentro de su nicho fisiológico19,,20.

Muchos protocolos diferentes se han propuesto durante los últimos años para aislar de manera adecuada y eficiente a los miofibras individuales de los músculos esqueléticos. Ya en 1986 Bischoff propuso un protocolo para aislar las fibras del Flexor Digitorum Brevis13 y posteriores, en 1995, Rosenblatt et al. modificaron el protocolo para obtener una separación más eficiente de las miofibras14. Desde entonces, muchos otros autores propusieron procedimientos ajustados en otros músculos, como Extensor Digitorum Longus (EDL) y Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, que son más largos, aunque más frágiles, músculos14. Las miofibras aisladas pueden cultivarse tanto en adhesión, para permitir la expansión de mioblastos derivados de células de satélite, o en condiciones flotantes, hasta 96 horas, para seguir la progenie derivada de células de satélite únicas19 (Figura 1). Las concentraciones variables de suero dentro del medio de cultivo se utilizan para activar la activación, proliferación y/o diferenciación de células satélite, para estudiar su capacidad de tránsito adecuado a través de estas diferentes fases1.

Recientemente describimos el mecanismo epigenético detrás del agotamiento de la piscina de células madre satélite en el modelo de ratón de EDMD, el Lamin 8-11 -/- ratón7. Dado que estos ratones suelen morir entre las 4 y las 8 semanas de edad24,debido a la pérdida muscular grave, se intentó capturar los defectos moleculares subyacentes a la aparición temprana de la enfermedad centrando nuestro análisis en el desarrollo muscular postnatal. Los miofibers individuales flotantes fueron aislados y cultivados a partir de ratones de tipo salvaje y Lamin 8-11 -/- mutantesde 7 ratones de 19 días de edad. En esta etapa, los defectos musculares ya son evidentes, pero los ratones todavía son viables. Sin embargo, dado que todos los protocolos antes mencionados para la extracción de miofibers individuales fueron optimizados para los músculos esqueléticos de ratones adultos, necesitábamos adaptarlos a nuestros propósitos: ratones muy pequeños en términos de edad y tamaño, y miofibers muy frágiles. Por lo tanto, aquí describimos nuestra adaptación del protocolo propuesto por el laboratorio Rudnicki19 para obtener un número significativo de miofibers viables únicos de ratones durante el desarrollo postnatal y de músculos distróficos severos, como los derivados de Lamin 8-11 -/- ratones24. El objetivo final de este enfoque es proporcionar un procedimiento estandarizado para el estudio de las células madre musculares asociadas a miofibras en cualquier otro modelo de ratón cuando las primeras etapas del desarrollo postnatal son de interés, o en el caso de modelos de ratón portadores de cualquier enfermedad específica que hace que las miofiberas sean más susceptibles al estrés mecánico.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se realizaron bajo la aprobación ética del Ministerio de Salud italiano y del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (autorización n. 83/2019-PR). Los animales fueron mantenidos en un centro autorizado en el Hospital San Raffaele, Milán, Italia (autorización n. N. 127/2012-A). 1. Disección muscular y cultura de miofiber Preparación del equipo. Antes de empezar, prepare todas las soluciones necesarias como se describe en el Cuadro 1. Estas soluciones deben estar recién preparadas. Limpie todas las superficies y herramientas que se utilizarán durante el procedimiento con un 70% de etanol. Antes de comenzar con el sacrificio de ratones, realice un recubrimiento de platos Petri de 100 mm y 35 mm utilizando suero de caballo (HS). Recubrir todos los platos para evitar que las miofiberes se adhieran al plástico. Considere la posibilidad de usar un plato de 100 mm y cuatro platos de 35 mm por ratón. Después de eliminar el exceso de HS, guarde los platos recubiertos en una incubadora a 37oC durante 30 min. A continuación, llénelo con solución de lavado o medio de cultivo (dos platos de 35 mm por ratón).NOTA: Alternativamente, una solución de 10% de HS en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco se puede utilizar para recubrir platos. Utilice siempre platos recubiertos. Es posible utilizar platos de cultura de diferente tamaño, pero se recomiendan platos Petri de pequeña dimensión. Para el aislamiento de fibras, prepare pipetas Pasteur estériles como se muestra en la Figura 2. Para cada ratón preparar una pipeta de agujero grande para el manejo muscular y la desagregación mecánica (Figura 2A) y una pipeta de agujero pequeño para la selección de fibras (Figura 2B). Corte cada pipeta de vidrio, posiblemente usando una pluma de diamante, a la longitud deseada y suave los bordes de la pipeta en una llama. Recubrir cada pipeta mojándola brevemente con HS antes de su uso. Sacrificio de ratón y disección muscular Precalentar la solución de digestión a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de iniciar el procedimiento de disección. Los tubos de fondo redondo FACS de polipropileno son los recipientes más adecuados para este propósito. Inmediatamente antes del comienzo de la recuperación muscular, sacrificar el ratón de acuerdo con la recomendación nacional de la CEU adecuada. Humedezca su parte inferior del cuerpo con 70% de etanol antes de cortar la piel para facilitar la eliminación del cabello. Coloque el ratón en una posición propensa sobre un soporte de poliestireno cubierto con papel de aluminio y corte la piel a partir de la mitad de la espalda longitudinalmente y en la dirección de las piernas. Retire cuidadosamente la piel sin tocar los músculos y tendones. Es posible arrancar toda la piel. Corte las dos patas del ratón y proceda rápidamente con la disección.NOTA: Si es más cómodo, es posible continuar la disección en todo el ratón, pero trabajar en la pierna permite más movilidad y precisión en los cortes posteriores. Fije la pierna en el soporte a nivel del pie usando un alfiler y comience a aislar los músculos esqueléticos de interés en este orden: TA, EDL, Gastrocnemius y Soleus. Levante el tendón inferior de TA con una pinza afilada a la altura del tobillo y córtelo, luego corte con tijera fina alrededor del músculo TA al otro tendón a nivel de la rótula (Figura 3A). Transferir a la solución de digestión. Levante el tendón inferior de EDL y sepárelo de otros músculos tirando suavemente hacia arriba hasta el otro tendón. Cortar y colocarlo en la solución de digestión.NOTA: Dado que EDL puede ser extremadamente pequeño para ser cortado por separado de TA, se pueden diseccionar juntos(Figura 3B). Entonces, si todo el músculo es demasiado grande, córtalo en 2-3 piezas comenzando desde el tendón y siguiendo las fibras en una dirección longitudinal(Figura 3C). Gire la pierna que muestra los músculos de la espalda y fije el pie usando el pasador. Levanta el tendón de Achille, Gastrocnemius se separará automáticamente de otros músculos. El tendón superior está en la parte posterior de la rótula. Cortarlo y añadir el músculo a la digestión. Levante el tendón externo de la pierna (con respecto al cuerpo) y obtenga el Soleus. Sepárelo suavemente de los otros músculos desplazándose hacia abajo con la pinza. Haga lo mismo para la otra pierna (pasos de 1.2.7. a 1.2.11.). Digestión muscular Incubar la solución de digestión que contiene todos los músculos de un baño de agua a 37oC durante unos 45-50 min. Durante el tiempo de digestión, revise regularmente el músculo para evitar la digestión excesiva. Cada 10 min invertir los tubos de digestión 10x con un movimiento energético (evitar el vórtice). Detenga la digestión cuando los músculos comiencen a aflojarse y las miofiberas sean visibles. Al final del tiempo de digestión agitar las muestras. Para detener la digestión, transfiera cuidadosamente la suspensión de digestión a un plato Petri precalentó de 100 mm con 10 ml de solución de lavado.NOTA: Evite la sobre digestión muscular, ya que esto inevitablemente resultará en el aislamiento de miofibers hipercontrató. Por lo general, con este protocolo, los músculos de los ratones mutantes homocigotos tardan 45 minutos en ser digeridos, mientras que los músculos de los ratones de tipo salvaje toman 50-55 min. Tiempo de digestión necesita ser validado experimentalmente. Aislamiento de miofibers individuales Primero aísle las fibras ya disociadas bajo un microscopio diseccionado recogiéndolas individualmente con una pipeta P200 recubierta o un pequeño agujero Pasteur y transfiéralas del Petri de 100 mm a una nueva placa Petri de 35 mm con 5 ml de solución de lavado precalentada. Para liberar más miofibers, pipetee el músculo hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de vidrio de agujero grande con medio cálido, hasta que las fibras se liberan mecánicamente. No sea demasiado persistente, ya que esto resultará en fibras dañinas. Continúe liberando miofibras del músculo hasta que el plato contenga una cantidad deseable. Si el plato Petri se mantiene a temperatura ambiente durante más de 8 minutos, deténgase y realice un mínimo de 5 min de incubación a 37oC, 5% CO2 para volver a equilibrar el medio. Antes de transferir las miofibras individuales al medio de cultivo, déjelas a 37oC, 5% CO2 en plato de lavado durante al menos 1 h. Esto ayuda a los miofibers a adaptarse a la condición in vitro.NOTA: Las miofibers para adultos son menos susceptibles al estrés y se pueden lavar 2-3 veces. Sin embargo, en esta condición (a los 19 días de edad postnatal) es mejor realizar un solo paso de lavado para prevenir daños por miofibra. Por lo tanto, siempre preste atención a mantener las miofiberes seleccionadas suficientemente limpias al no llevar escombros o fibras hipercontradas. Cultura de miofiber única Transfiera miofibers individuales a un nuevo plato precalentó con el medio de cultivo adecuado (medio sérico alto para permitir la activación de células satélite, ver Figura 1). Cambiar el medio a las miofibras aisladas, transfiriéndolos a un nuevo plato recubierto con nuevo medio de cultivo, sólo después de 48-72 h de cultivo para evitar cualquier estrés que conducirá a la hipercontración y interrupción de las miofibers. 2. Aplicaciones aguas abajo: Myofibers crosslinking e inmunofluorescencia NOTA: Las células satélite asociadas a miofibers se pueden visualizar por inmunofluorescencia (IF) en el momento de interés. Dado que la mayoría de los protocolos publicados están optimizados para realizar IF en miofibras adultas, aquí se presenta un protocolo detallado para obtener resultados confiables también en miofibers aislados de los músculos postnatales. Crosslinking de Myofiber Antes de empezar, prepare todas las soluciones necesarias como se describe en el Cuadro 2. Precapa con HS hasta 1,5 ml de tubos de microcentrífuga como el número de muestras. Asegúrese de eliminar todo el HS antes de continuar. Dado que las fibras reticuladas son más resistentes que las vivas y más difíciles de pipetear, asegúrese de reenredar alrededor de 200-300 fibras por separado por tubo. Bajo un microscopio de disección, recoger todas las fibras que se pueden considerar saludables, transferirlas al tubo de microcentrífuga y dejar el tubo vertical durante 5 minutos dentro de la incubadora para permitir que las fibras se asienten. Retire el sobrenadante muy lentamente del tubo. Fibras de reticulación mediante la adición de 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) en RT al tubo. Hazlo suavemente para evitar la angustia de las fibras. Para evitar que las fibras se entretejen durante el entrecruzamiento, mantenga el tubo en agitación muy suave durante 10 minutos. Mantenga el tubo en una posición vertical durante 5 minutos en RT para permitir que las fibras se asienten, luego deseche el sobrenadante asegurando eliminar la mayoría del volumen de PFA. Añadir 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) y mantener los tubos verticales durante 5 minutos en RT para dejar que las fibras se sedimenten. Retire el sobrenadante y repita el procedimiento de lavado (paso 2.1.8.) dos veces más. Mantenga las muestras reticuladas a 4 oC.NOTA: Es posible mantener las miofibras reticuladas a 4 oC durante una semana. Si las fibras permanecen más de una semana en esta condición, esto inevitablemente resultará en el entrelazamiento de miofibers. Inmunofluorescencia Mantenga los tubos que contienen las fibras en RT durante al menos 5 minutos para permitir la sedimentación de la fibra. Retire el sobrenadante, dejando sólo un pequeño volumen para asegurarse de no quitar ninguna fibra. Añadir 1 ml de 0,5% Tritón X-100 en PBS e incubar durante 5 min con agitación suave. Coloque los tubos en posición vertical durante 5 minutos y, a continuación, retire el sobrenadante. Añadir 1,5 ml de PBS e incubar con agitación suave durante 5 min. Mantenga los tubos en posición vertical durante 5 minutos y, a continuación, retire el sobrenadante. Añadir 1 ml de solución de bloqueo e incubar durante 1 h en RT con agitación suave. Mantenga los tubos 5 minutos en posición vertical y, a continuación, retire el sobrenadante. Diluir los anticuerpos primarios en la solución de bloqueo, añadirlos a los tubos e incubar durante la noche a 4 oC en agitación suave (para las concentraciones sugeridas ver Tabla de materiales).NOTA: Alternativamente, el anticuerpo primario se puede incubar durante 3 h en RT. Sin embargo, la incubación durante la noche dio una tinción óptima. El volumen de incubación de los anticuerpos primarios y secundarios debe ser de 300 l cuando las fibras sedimentadas alcancen la muesca de 100 l del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cuando las fibras son menos abundantes, se recomienda un volumen de 100-200 l. Deje los tubos en posición vertical durante 5 minutos y luego retire el sobrenadante. Realizar 3 lavados en 1 ml de 0.25% Tween-20 en PBS, incubando durante 5 minutos en agitación suave y luego dejando los tubos de pie durante 5 minutos cada vez.NOTA: A partir de ahora, realice todos los pasos en la oscuridad, para evitar el blanqueo de fluorocromos. Diluir los anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo, añadirlos a los tubos e incubar durante 1 h en RT con agitación suave (para concentraciones ver Tabla de materiales). Lavar dos veces en 1 ml de 0.1% Tween-20 en PBS, incubando durante 5 minutos con agitación suave y luego dejando los tubos en posición de pie durante 5 min. Retire el sobrenadante, añada 1 ml de solución DAPI e incubar durante 5 minutos con agitación suave. Deje que los tubos se soporten verticalmente en un bastidor durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante. Lavar con 1 ml de PBS, incubar durante 5 minutos con agitación suave y luego dejar los tubos en un estante durante 5 minutos. Retire el sobrenadante, dejando un volumen de aproximadamente 50 l. Montaje de miofibers con etiqueta fluorescente en diapositivas de microscopio Cortar una punta de pipeta P200 y cubrirla con solución de bloqueoNOTA:Para recubrir la punta, pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de recoger las fibras, esto evitará que las fibras se peguen a la pared de la punta. Recoger las fibras del tubo y extenderlas en un portaobjetos de vidrio del microscopio. Bajo un microscopio de disección, utilizando sólo la luz natural reflejada por el espejo, utilice una nueva punta de pipeta P200 (no cortada) para esparcir las fibras y eliminar el exceso de solución líquida. Deje los portaobjetos se secar al aire en la oscuridad durante unos 10-15 minutos, hasta que quede una cantidad muy baja de solución. Añadir el medio de montaje en la diapositiva (la cantidad adecuada de medio de montaje debe calibrarse en la dimensión del cubreobjetos: para un cubreobjetos de 24 x 40 mm, 20 l es suficiente) y luego colocar lentamente un vidrio de cubierta en el área que contiene las fibras. Tenga cuidado de no crear burbujas entre las gafas. Presione el cubreobjetos para que las fibras se acosten en un solo plano horizontal. Fije el cubreobjetos con esmalte de uñas. Conservar las muestras a 4oC durante un máximo de 4 semanas. Adquiera las imágenes deseadas de miofibers con etiqueta fluorescente con un microscopio confocal.

Representative Results

Normalmente digerimos cuatro músculos diferentes (TA, EDL, Soleus y Gastrocnemius)para recuperar una buena cantidad de fibras largas y viables que podrían sobrevivir 96 h en factores de crecimiento medio rico (Figura 4A, B). Sólo las fibras más intactas deben ser transferidas en medio de cultivo, ya que sobrevivirán; todos los demás, que son fáciles de discriminar y seleccionar, necesitan ser descartados. Cuando las miofibers se mantienen en un medio de células de satélite ricos en factores de crecimiento derivados de ratones de tipo salvaje comienzan a activarse y proliferar, ver Figura 1. A las 48 h de cultivo, en condiciones saludables(Lamin 8-11 +/+), las células satélite regulan MyoD y se someten a su primera división. Las células satélite Pax7+/MyoD+ activadas proliferan y por 72 h en cultivo, generan agregados celulares enlazados a la miofibra, que son aún más visibles a 96 h(Figura 5). Durante estas divisiones, algunas de ellas pueden reprimir la expresión de MyoD, experimentando la auto-renovación para repoblar el grupo de células madre, mientras que las que mantienen MyoD se comprometen a la diferenciación mediante la regulación de la expresión de Pax7. Después de 96 h, los clústeres de células satélite contienen células confirmadas MyoG+ claramente visibles, que pueden diferenciarse en nuevas miofibras(Figura 1 y Figura 6). En particular, con este experimento, describimos una dinámica retardada de la diferenciación de células de satélite en ratones mutantes homocigotos Lamin 8-11 (-/-) en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje (+/+), ver Figura 6. El resultado final de cada experimento único nos permite pensar que el protocolo desarrollado para el aislamiento y la cultura de miofibers individuales a partir de este modelo de distrofia muscular severa asegura miofibers de buena calidad para todas las aplicaciones posteriores. Figura 1: Representación gráfica de las fases regenerativas de las células satélite modeladas en miofibras flotantes. Tras 48 h de cultivo en factores de crecimiento medios ricos, las células Pax7+ se activan y se someten a la primera división, dando lugar a un doblete de células Pax7+/MyoD+. Las células positivas de MyoD proliferan y se expanden, dando lugar, en 72 h de cultivo, a un grupo de varias células que son la progenie de una sola célula satélite. Tras 96 h de cultivo Pax7+/MyoD+ células se convierten en diferenciantes Pax7-/MyoG+ células. Durante la fase de expansión, un subconjunto de celdas Pax7+/MyoD+ regula la expresión MyoD en proceso de auto-renovación en reposo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Preparación de pipetas Pasteur de perforación. (A) Vista longitudinal y frontal de cómo debe aparecer la pipeta de agujero grande. (B) Vista longitudinal y frontal de cómo debe aparecer finalmente la pipeta de agujero pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Imágenes representativas de la disección muscular única. (A) Aislamiento del músculo TA. Evitar la eliminación de la capa delgada que cubre el músculo protege las miofibers en su interior. (B) Los músculos TA y EDL aislados juntos todavía unidos a su tendón superior a nivel de la rótula. (C) División de TA y EDL después del aislamiento cortándolos a lo largo del eje longitudinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Ejemplos de miofibers saludables y viables. Imágenes representativas de contraste de fase de miofibras viables en suspensión. (A) La flecha roja indica una miofibra con organización visible de sarcomere y una célula satélite de su lado; las flechas naranjas indican algunos trozos de miofibers rotos, y algunos escombros presentes en el primer plato antes de la selección final para el cultivo. Barra de escala de 100 m. (B) Vista más completa de otras miofibras bajo un aumento más pequeño. Barra de escala 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Diferencia en la dimensión de los racimos de células madre en ratones wt y mutantes. Tinción de inmunofluorescencia de miofibras extraídas de 19 días De 19 días Lamin 8-11 ratones (+/+ y -/-) después de 96 h de cultivo. Se muestran las células de satélite Pax7+. La dimensión del cúmulo celular en la mayoría de los casos fue significativamente mayor en Lamin 8-11 +/+ que en Lamin 8-11 -/- en términos de número de celdas. Barra de escala de 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Experimento representativo de inmunofluorescencia. Experimento de inmunofluorescencia realizado, después de 96 h de cultivo, en miofibras extraídas de 19 días En ratones Lamin 8-11 (+/+ y -/-). Se observaron las células Pax7+/MyoG- (rojo) y Pax7-/MyoG+ (verde). Imágenes obtenidas con un microscopio confocal. Barra de escala de 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Nombre de la solución en el texto Componente Porcentaje volumen/muestra final sugerido Notas solución de lavado DMEM alta glucosa 90% 4 mL Mantener estéril, mantener a 4oC hasta que el uso Suero de caballo (HS) 10% solución de digestión DMEM alta glucosa 9.80% 20 mL Polvo extremadamente dañino. Filtrar la solución con filtro de 0,22 m y luego mantener estéril. Mantener a 4oC hasta que el uso Collagenase I 0.20% medio cultural DMEM alta glucosa 78% 10 mL Mantener estéril, mantener a 4oC hasta que el uso Suero bovino fetal (FBS) 20% Extracto de embrión de pollo (CEE) 1% Penicilina-Estreptomicina (P/S) 1% Tabla 1: Recetas para soluciones utilizadas en la sección 1. Nombre de la solución en el texto Componente Porcentaje volumen/muestra final sugerido Notas 4% PFA Paraformaldehído (PFA) 4% 2-3 mL El polvo y luego la solución son extremadamente dañinos Pbs 96% 0.5% Tritón X-100 Tritón X-100 0.50% 2-3 mL Tritón X-100 es extremadamente viscoso, corte preferentemente la punta de la pipeta para aliquot Pbs 99.50% 0.25% Tween-20 Tween-20 0.25% 10 mL Tween-20 es extremadamente viscoso, corte preferentemente la punta de la pipeta para alícuota Pbs 99.75% 0.1% Tween-20 Tween-20 0.10% 10 mL Tween-20 es extremadamente viscoso, corte preferentemente la punta de la pipeta para alícuota Pbs 99.90% solución de bloqueo Suero bovino fetal (FBS) 10% 10 mL Preparar la solución fresca y almacenar a 4oC durante no más de 3 semanas (compruebe siempre la claridad antes de su uso) Pbs 90% Dapi Dapi 0.10% 2-3 mL Manténgase en la oscuridad Pbs 99.90% Tabla 2: Recetas para soluciones utilizadas en la sección 2.

Discussion

El aislamiento de miofibras individuales intactas es un método esencial en el campo de la miogénesis cuando el objetivo principal es caracterizar las capacidades regenerativas autónomas celulares de las células madre musculares dentro de su nicho, en condiciones sanas y patológicas. Sin embargo, cuando los estudios bioquímicos o genómicos son de interés, las células de satélite aisladas por FACS podrían ser la mejor opción.

El aislamiento de miofibers individuales permite seguir ex-vivo, pero de la manera más fisiológica, la dinámica de todos los pasos que sufren las células satélite individuales durante la regeneración muscular, que son: activación, división celular (asimétrica y simétrica), diferenciación y retorno a la reposo por auto-renovación. Una vez que las miofibers se cultivan en condiciones flotantes, las células de satélite únicas se activan y se expanden formando un grupo de células, todas derivadas de la misma célula satélite. El análisis de inmunofluorescencia para marcadores de proliferación, diferenciación, activación o derivación es entonces óptimo para cuantificar la proporción entre las etapas celulares.

El paso clave en nuestro protocolo para obtener miofibers viables e intactos se puede considerar la disección muscular rápida pero suave, por aislamiento de tendón a tendón, para evitar cualquier daño muscular. Nuestro consejo es utilizar sólo tijeras afiladas y pequeñas pinzas afiladas y limitar todo el procedimiento de disección muscular a diez minutos. Cuando es difícil aislar músculos muy pequeños (es decir, EDL y TA), es posible cortarlos juntos y luego dividirlos mediante el corte de tijeras finas a lo largo del plano longitudinal siguiendo las fibras. Esta estrategia eventualmente dará miofibers menos intactos, pero la viabilidad no se verá comprometida. Lo mismo debe realizarse en músculos grandes como Gastrocnemius para facilitar la digestión. La optimización del tiempo de digestión, que debe ser validada empíricamente, y la manipulación mínima de las fibras aisladas son también dos aspectos cruciales para el resultado positivo del análisis posterior.

La ventaja del protocolo reportado aquí es que se puede aplicar en ratones muy pequeños (en edad y dimensión), incluso cuando sus músculos son extremadamente frágiles. Incluso si no se mencionó anteriormente, es posible seguir este protocolo de disección a entonces cultivo de miofibers viables durante un período más largo utilizando platos recubiertos de membrana sótano18,19. Es importante tener en cuenta que esta situación es completamente diferente de la condición flotante, donde los estímulos de adhesión y los estímulos de proximidad están ausentes.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Andrea Bianchi, la Red Italiana de Laminopatías y a los miembros del laboratorio por el apoyo y todos los comentarios constructivos. Estamos agradecidos a Chiara Cordiglieri por la preciosa ayuda del microscopio confocal. Los autores agradecen a la Dra. Beatrice Biferali su ayuda para tomar fotos para figuras. El trabajo presentado aquí fue apoyado por My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, el Ministro de Salud italiano n. GR-2013-02355413 y Cariplo 2017-0649 a C.L. C.M. cuenta con el apoyo de My First AIRC y la subvención N.18993 y AFM-Telethon n. 22489.

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole Sigma D9542
Chicken embryo extract Seralab CE650-DL
Collagenase type I SIGMA C0130-500MG
Donkey anti-Rabbit 488 antibody Thermofisher R37118 to be used 1:200
Dulbecco's modified Eagle's medium Gibco 10569-010
Fetal bovine serum Corning 35-015-CV
Horse serum Gibco 26050-088
MyoG antibody Millipore 219998 to be used 1:100
Paraformaldehyde SIGMA P6148
Pax7 antibody Developmental studies
Hybridoma bank		 to be used 1:20
Penicillin and Streptomycin Euroclone ECB3001D
Phosphate saline buffer Euroclone ECB4004L
Prolong gold antifade mountant Thermofisher P36930
Triton X-100 SIGMA T8787
Tween-20 SIGMA P1379
Lab equipment Manufacturer
Bunsen burner
Confocal microscope Leica
Diamond pen bio-optica
Dissection pins
FACS polypropylene tubes Falcon
Falcon tubes (50 and 15 mL) Falcon
Glass coverslips Thermofisher
Glass Pasteur pipettes (22cm) VWR
Glass slides Thermofisher
Micro dissecting scissors
Micropipette (1 mL and 200 µL) Gilson
Micropipette tips Corning
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) Thermofisher
Plastic pipettes (5 and 10 mL) VWR
Rubber pipette bulbs VWR
Sharp tweezers
Stereo dissection microscope with transmission illumination Leica
Tissue culture hood or lamina flow cabinet
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2)
Water bath at 37°C VWR
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Referenzen

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Pegoli, G., Lucini, F., Mozzetta, C., Lanzuolo, C. Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development. J. Vis. Exp. (161), e61516, doi:10.3791/61516 (2020).
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