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Entwicklungsbiologie

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Published: September 02, 2020
doi:
10.3791/61515
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

Summary

Se presenta un protocolo que permite la visualización de Drosophila melanogaster intacta en cualquier etapa de desarrollo mediante tomografía microinformada.

Abstract

Las herramientas de imágenes biomédicas permiten la investigación de mecanismos moleculares a través de escalas espaciales, desde genes hasta organismos. Drosophila melanogaster, un organismo modelo bien caracterizado, se ha beneficiado del uso de la luz y la microscopía electrónica para comprender la función génica a nivel de células y tejidos. La aplicación de plataformas de imágenes que permiten una comprensión de la función de los genes a nivel de todo el organismo intacto mejoraría aún más nuestro conocimiento de los mecanismos genéticos. Aquí se presenta un método completo de imágenes animales que describe los pasos necesarios para visualizar Drosophila en cualquier etapa del desarrollo utilizando tomografía microcomputadora (μ-CT). Las ventajas de μ-CT incluyen instrumentación disponible comercialmente y un tiempo práctico mínimo para producir información 3D precisa a una resolución de nivel micrones sin la necesidad de métodos de disección o limpieza de tejidos. Junto con el software que acelera el análisis de imágenes y la representación 3D, se puede realizar un análisis morfométrico detallado de cualquier sistema de tejidos u órganos para comprender mejor los mecanismos de desarrollo, fisiología y anatomía para estudios de pruebas descriptivas e hipótesis. Al utilizar un flujo de trabajo de imágenes que incorpora el uso de microscopía electrónica, microscopía de luz y μ-CT, se puede realizar una evaluación exhaustiva de la función del gen, lo que aumenta la utilidad de este poderoso organismo modelo.

Introduction

Los métodos de imágenes que permiten la investigación detallada de las estructuras interiores de un objeto sin destruir su arquitectura 3D general han demostrado ser ampliamente beneficiosos para una serie de disciplinas diferentes, incluidas la física, la ingeniería, la ciencia de los materiales, la arqueología, la paleontología, la geologíay la biología1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Entre estos métodos de imágenes no destructivas, las plataformas basadas en rayos X son especialmente útiles debido a la capacidad de los rayos X de alta energía para penetrar en muchos tipos de muestras y materiales diferentes con una dispersión mínima en comparación con las ondas de luz visible. La tomografía computarizada (TC), la tomografía microcomputada (μ-CT), la tomografía nanocomputada (Nano-CT) y la microtomografía sincrotrón han surgido, por lo tanto, como las tecnologías primarias para la obtención de imágenes basadas en rayos X de muestras que van desde metros hasta micras, con capacidades de resolución milimétricas asubmiónimas 10,11,12,13,14.

Si bien estas plataformas difieren en su diseño, geometría de rayos X y componentes para equilibrar el tamaño y la resolución de la muestra, todas se basan en el mismo principio básico para la captura de imágenes: una fuente de rayos X que viajan a través del objeto y son capturados por un detector. La atenuación diferencial del haz de rayos X a medida que pasa a través de diferentes densidades dentro del objeto genera contraste de imagen. Los datos 3D se obtienen girando la muestra o el detector, recogiendo una serie de imágenes de proyección 2D que luego se reconstruyen utilizando algoritmos en tomogramas que contienen información 3D cuya resolución es isotrópica en x,y,z15. Para muchos escáneres de μ-CT de sobremesa que utilizan una geometría de rayos X de haz cónico para proyectar rayos X en el objeto que se está fotografiado, el algoritmo de Feldkamp se utiliza para reconstruir con precisión el objeto con errores mínimos16.

La resolución de una plataforma dada está determinada principalmente por parámetros del sistema, como el tamaño del haz de rayos X (tamaño del punto), la geometría del escáner (distancia del objeto a la fuente de rayos X), el tamaño de los píxeles en el detector y el algoritmo de reconstrucción empleado. Factores adicionales, como las vibraciones del escáner, las fluctuaciones del haz de rayos X, el movimiento de la muestra y el tipo de material o la mancha química utilizada para visualizar el objeto también pueden influir significativamente en la resolución espacial bajo condiciones de imágenes del mundo real15.

Para aplicaciones biomédicas, la TC y la μ-CT han desempeñado un papel clave en el avance de nuestra comprensión de la anatomía, la fisiología, el desarrollo y los mecanismos de la enfermedad, sirviendo como una herramienta tanto para el diagnóstico de pacientes humanos como como una plataforma de imágenes preclínicas para organismos modelo17,18. Por ejemplo, el Mouse International Phenotyping Consortium, cuyo objetivo es identificar la función de cada gen en el genoma del ratón, utiliza μ-CT como parte de su tubería de fenotipado19. Sus resultados han sido críticos para comprender los genes involucrados en el desarrollo y los procesos de la enfermedad, al tiempo que sirven como un atlas para la anatomía y el desarrollo delratón 20. Otros organismos modelo, como el pez cebra y las ratas, también han adoptado plenamente el uso de μ-CT para realizar fenotipos animales completos de una serie de mutantes genéticos17,21,22,23.

La ventaja de combinar imágenes de animales enteros con organismos modelo es que se puede explorar completamente una comprensión mecanicista de la función génica para un proceso biológico dado. Esto es posible debido a los genomas bien caracterizados y muchas herramientas genéticas disponibles en los organismos modelo que permiten la manipulación precisa de la función génica en distintos puntos de tiempo de desarrollo, tejidos específicos, células individuales e incluso orgánulos subcelulares. Estos incluyen sistemas de expresión binaria como el sistema UAS / GAL4 (y sus muchos derivados), CRISPR / Cas9 y RNAi24,25,26. Cuando estas herramientas genéticas se utilizan junto con una poderosa tubería de imágenes que consiste en microscopía electrónica, microscopía de luz (fluorescente y no fluorescente) e imágenes de animales completos como μ-CT, se puede lograr una evaluación exhaustiva de moléculas, células, tejidos, órganos y todo el organismo, lo que permite una comprensión mucho más profunda de la función génica.

Este protocolo se centra en el uso de μ-CT en el organismo modelo no mamífero Drosophila melanogaster, cuya miríada de herramientas genéticas han ayudado a dilucidar numerosos mecanismos moleculares26,27. Fue adoptado a partir de protocolos anteriores en insectos no modelo1,28,29,30,31,32,y se basa en estudios previos de μ-CT en Drosophila para establecer un protocolo estandarizado para su uso en este animal33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Se describen los pasos para la preparación exitosa de muestras, imágenes y análisis de conjuntos de datos de mosca μ-CT utilizando escáneres disponibles comercialmente. Con este protocolo, todas las etapas de desarrollo de la mosca se pueden visualizar a alta resolución para estudios descriptivos y de prueba de hipótesis, incluyendo taxonomía, anatomía, desarrollo, fisiología y enfermedad27. Este protocolo también será útil para obtener imágenes de prácticamente cualquier insecto e incluso materiales no vivos que requieran tinción química para el contraste de imágenes para mejorar la visualización mediante μ-CT.

Protocol

1. Selección de muestras y preparación de la cutícula Elija el punto de tiempo de desarrollo apropiado (embrión, larva, pupa o adulto) para las imágenes. Para las etapas embrionarias, las hembras de jaula en placas de agar de jugo de uva se untan con pasta de levadura y recolectan huevos cada 30-60 min. Deje que estos embriones se desarrollen a 25 °C hasta que se alcance la etapa adecuada. Para las etapas larvales, recolecte el primer y segundo instars de los experimentos de recolección de embriones cronometrados. Elija directamente los3º instars errantes del lado del vial de alimentos en condiciones de no hacinamiento. Para el tiempo de pupa, recoja las pre-pupas blancas (espiráculos invertidos) y tome nota del momento en que la cutícula comienza a dorarse. Los animales progresarán a través de 15 etapas del desarrollo de las pupas en puntos de tiempo definidos después del pardeamiento de la cutícula y se pueden recolectar en consecuencia42. Recolecte adultos como vírgenes después de la eclosión y deje envejecer en un vial de alimentos durante un período de tiempo requerido (por ejemplo, 5 días para el desarrollo intestinal completo). Transfiera 5-50 animales a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de Tritón X-100 al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato 1x (0,5% PBST). Mientras golpea el tubo periódicamente en la mesa de trabajo, incube durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para ayudar a eliminar el recubrimiento hidrófobo y permitir que los animales se sumerjan por completo. Para las etapas embrionarias, larvales y pupales, deténga un mayor desarrollo colocando el tubo en un bloque de calor ajustado a 100 ° C durante 20 s seguido de un enfriamiento a RT durante 5 min.NOTA: Los animales también pueden ser congelados en nitrógeno líquido37. 2. Fijación y tinción Retire el 0.5% de PBST y agregue 1 ml de la solución de Bouin. Tubo de grifo para garantizar que los animales estén completamente sumergidos.PRECAUCIÓN: Bouin’s Solution contiene formaldehído. Puede causar toxicidad aguda en la piel y los ojos si se derrama y puede ser fatal si se ingiere. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio cuando manipule.NOTA: También se pueden emplear técnicas de fijación adicionales, como el uso de etanol. Los méritos de otros fijadores se describen en detalle en ref.1,30. Para muestras de embriones y adultos, incube en la mesa de trabajo durante 16-20 h en RT. Para muestras de larvas y pupas, fije los animales durante 2 h en RT. Deseche la solución de Bouin y lávela con 1x PBS durante 5 minutos tres veces. Transfiera a un plato de disección de múltiples pozos que contenga 1x PBS y use un pequeño pasador minutien conectado a un soporte para hacer un agujero en la cutícula anterior y posterior, teniendo cuidado de no interrumpir ningún tejido blando subyacente. Transfiera las muestras de larvas y pupas a un tubo de microfuge y agregue 1 ml de solución fresca de Bouin. Incubar en sobremesa durante 24 h en RT. Retire la solución de Bouin y lave la muestra durante 30 min con 1 ml de tampón de lavado de μ-CT (0,1 M Na2HPO4,1,8% de sacarosa) o 1x PBS tres veces. Agregue 1 ml de la solución de tinción adecuada e incube en la mesa de trabajo durante 2-7 días.NOTA: La elección de la tinción dependerá de muchos factores, pero generalmente es un equilibrio entre la penetración, el tiempo de incubación y la resolución. En general, el ácido fosfotúngstico (PTA) proporciona un contraste y una resolución superiores de los tejidos blandos, pero requiere una interrupción mecánica de la cutícula y tiempos de incubación más largos. Los méritos de los diferentes tipos de manchas se describen en detalle en la ref.1. Para la tinción de yodo, use 1 ml de 0.1 N I2KI (Solución de Lugol). Incubar durante 2 días. No es necesaria ninguna otra interrupción de la cutícula adulta. Para la tinción de ácido fosfotrástico (PTA), use 1 ml de una solución al 0,5% (p/v) diluida en agua. Interrumpa la cutícula adulta, ya sea quitando las piezas bucales o haciendo agujeros en el tórax o la cutícula abdominal con un pequeño alfiler minutien unido a un soporte. Incubar durante 5-7 días, o más si la tinción tisular parece no homogénea. Lavar con 1 ml de agua ultrapura o 1x PBS durante 30 min. Repita el paso de lavado. Almacene los animales en RT en agua ultrapura o 1x PBS por hasta un mes. Si los animales van a ser escaneados mientras están hidratados, vaya directamente a la sección 4. Si se necesita una conservación más larga de la muestra, continúe con la sección 3 del protocolo. 3. Secado en punto crítico (opcional) Realizar una serie de deshidratación de etanol (EtOH) en la muestra: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Añadir 1 ml de la solución de EtOH e incubar en la mesa de trabajo durante 1 h por cada concentración en el orden indicado. Después del remojo final de EtOH al 100%, reemplácelo con EtOH 100% fresco y deje que la muestra se incube en la mesa de trabajo durante la noche. Realice el secado en puntos críticos de las muestras siguiendo las instrucciones del fabricante.NOTA: Las instalaciones de microscopía electrónica generalmente tienen una máquina de secado de punto crítico (ver Tabla de Materiales)que realizará el secado de la muestra después de la deshidratación de EtOH. 4. Montaje de la muestra Para muestras secas de punto crítico, muestras de pegamento caliente a un pasador de insecto u otro soporte diseñado para caber dentro del mandril de la etapa giratoria o colocarlo en un tubo capilar de plástico o vidrio (~ 1.0-1.25 mm de diámetro interior). Para muestras hidratadas, llene la punta de una pipeta P10 con agua y asegure el extremo estrecho mediante sellado térmico o película de parafina para evitar fugas.PRECAUCIÓN: Asegúrese de envolver bien las conexiones para que el agua no se filtre en el escáner y cause daños. Transfiera una sola muestra a la punta de la pipeta con pórceps. Usando un objeto largo y delgado, como una aguja opaca de 20 G u otra punta de pipeta, empuje cuidadosamente la muestra hacia abajo de la punta hasta que entre en contacto con la pared de la punta de la pipeta para mantenerla en su lugar. Cubra la abertura de la punta de la pipeta con una película de parafina para evitar la evaporación del agua durante los escaneos largos. Monte la pipeta P10 utilizando un soporte diseñado para caber dentro del mandril de la etapa giratoria (Figura 1A-C). 5. Escaneo Realice las calibraciones necesarias de la máquina antes de tomar imágenes durante el día.NOTA: Estos variarán según el fabricante y se recomienda consultar con un especialista en aplicaciones para determinar los pasos adecuados. Consulte la Tabla de materiales para obtener información específica sobre la configuración y el software utilizado en este protocolo. En general, las calibraciones, como la alineación del eje de la etapa para eliminar cualquier “bamboleo” asociado con el mandril que está fuera del eje en relación con la etapa giratoria y la realización de correcciones de campo plano para garantizar intensidades uniformes de píxeles de fondo en la cámara, proporcionan condiciones de imagen óptimas para la mejor resolución y conjuntos de datos que son comparables en múltiples escaneos. Abra la puerta del escáner para acceder al mandril de la etapa giratoria haciendo clic en el icono ‘Abrir puerta’ en la esquina superior izquierda del software. Fije la muestra apretando el collar alrededor de la base del portavasos.NOTA: Utilice una presión suave al conectar la muestra al mandril giratorio para mantener la alineación del escáner. Establezca parámetros de escaneo en el software que controla el escáner para obtener una resolución y un contraste óptimos.NOTA: Estos deberán determinarse empíricamente, ya que la fuente de rayos X, la cámara / detector y la geometría de cada escáner variarán según el fabricante. También se puede encontrar información adicional para seleccionar los mejores parámetros aquí43, así como del especialista en aplicaciones del fabricante. Abra el control de alimentación de la fuente de rayos X (Opciones | Fuente de rayos X). Utilice las barras deslizantes para establecer el voltaje de rayos X a 30-40 kV y la corriente a 100-110 μA para producir un haz de rayos X con 3-4W de potencia y un tamaño de punto pequeño para una resolución mejorada. Utilice el cuadro de diálogo Modos de adquisición (Opciones | Modos de adquisición)para establecer el tiempo de exposición de la cámara a 500-800 ms. Utilice la barra deslizante situada junto al icono de la lupa en la parte inferior del software para establecer el tamaño de píxel de imagen deseado (~ 700 nm a 4 μm), dependiendo de la configuración y la posición de la cámara. Esto determina el número de imágenes de proyección que se adquieren durante el escaneo, con más proyecciones que conducen a una resolución mejorada pero tiempos de escaneo más largos (consulte Resultados representativos). Haga clic y arrastre la barra deslizante ubicada junto a la flecha giratoria en la parte inferior del software para mover la muestra a lo largo de su trayectoria de rotación de 360°. Asegúrese de que la muestra permanezca dentro del campo de visión. Haga clic en el icono’Iniciar adquisición'(icono de flecha circular azul) en la parte superior del software. Aparece un cuadro de diálogo que permite establecer parámetros de escaneo adicionales y nombrar el archivo y la carpeta de salida donde se guardará el escaneo. Establezca el movimiento aleatorio en 10 y promedie 4-6 cuadros. El paso de rotación se calcula automáticamente en función de la configuración de la cámara utilizada. Comience el análisis haciendo clic en ‘Aceptar’ en el cuadro de diálogo Adquisición. Aparece un segundo cuadro de diálogo de la barra de progreso que muestra el tiempo de escaneo. El escáner ahora adquirirá una serie de imágenes de proyección(Figura 1D)de la muestra a lo largo de la ruta de rotación y no necesita ser monitoreado. 6. Reconstrucción Para generar los tomogramas, realice la reconstrucción de imágenes utilizando las imágenes de proyección.NOTA: Si bien casi todas las reconstrucciones de imágenes de escáneres de geometría de haz cónico se basan en el algoritmo Feldkamp16,los parámetros individuales variarán según la implementación del software y deben determinarse empíricamente. Las siguientes configuraciones, específicas para un software disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales)se pueden utilizar como guía. Parámetros como la compensación de desalineación, la reducción de artefactos de anillo y la corrección de endurecimiento del haz (0% para la mayoría de las muestras de moscas) se realizan de manera iterativa para elegir los mejores valores para la reconstrucción final. Para los usuarios avanzados que deseen un mayor control sobre el proceso de reconstrucción, consulte la interfaz de MATLAB aquí44. Realizar una alineación inicial de la imagen utilizando un algoritmo de corrección de desplazamiento basado en escaneos de referencia45 (Acciones | Alineación X/Y con un escaneo de referencia). Ajuste cada parámetro de reconstrucción (Iniciar | Ajuste fino). Esto activa un cuadro de diálogo ‘Ajuste fino de parámetros’. Ajuste la alineación haciendo clic en’Siguiente’a’Post-Alineación’. Establezca el número de iteraciones en cinco y el paso del parámetro en 1.0. Haga clic en el botón Inicio para generar una serie de vistas previas. Seleccione la imagen que está correctamente alineada.NOTA: Una imagen correctamente alineada no será borrosa ni mostrará artefactos de “cizallamiento” donde una estructura continua (como la cutícula) aparece dividida. Ajuste la reducción del artefacto del anillo haciendo clic junto a él. Establezca el número de iteraciones en cinco y el paso del parámetro en 1.0. Haga clic en el botón Inicio para generar una serie de vistas previas. Seleccione la imagen que contiene el menor número de anillos. Una vez que los parámetros anteriores se hayan optimizado para dar la mejor imagen, asegúrese de que los valores seleccionados estén representados correctamente en la pestaña Configuración (Configuración). Ajuste cualquier valor final de brillo y contraste utilizando el histograma, los parámetros del archivo, como la profundidad de bits y el tipo, y utilice una Región de Interés (ROI) que abarque solo las estructuras de interés (por ejemplo, solo mosca completa o cabeza) para reducir el tiempo computacional(Salida). Comience la reconstrucción (Iniciar | Inicio). Si se requieren varias reconstrucciones, agregue la imagen actual al administrador de lotes (Iniciar | Agregar al lote) y repita los pasos 6.2-6.5 para las imágenes restantes. 7. Análisis de imágenes Visualice tomogramas en dos y tres dimensiones y realice análisis morfométricos adicionales con software gratuito o comercial.NOTA: Los detalles del software utilizado en este protocolo están disponibles en la Tabla de Materiales. Otros paquetes de software que son capaces de evaluar conjuntos de datos μ-CT incluyen opciones gratuitas como FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48,además de software comercial (por ejemplo, AMIRA). Otras aplicaciones que emplean algoritmos basados en aprendizaje automático para semiautomatizar el proceso de segmentación pueden ayudar a acelerar los flujos de trabajo y reducir el sesgo humano (por ejemplo, Biomedisa49). Importe el archivo de tomograma en el software (Archivo | Importar archivos de imagen). Los metadatos asociados con el archivo deben cargarse automáticamente en la ventana, pero también se pueden configurar manualmente para que coincidan con las propiedades de la imagen. Para segmentar una estructura de interés, haga clic en la pestaña Segmento en el lado izquierdo de la pantalla. Crear una nueva región de interés (ROI) (Basic | Nuevo),así que le dé un nombre y seleccione un color apropiado. Definir el rango de umbral que abarca la estructura de interés (Rango | Definir rango) utilizando la barra deslizante. Seleccione un modo de herramienta de pintor de ROI 2D o 3D apropiado(ROI Painter | Opción de pincel). Pintar un área definida por el umbral; mantenga presionada la tecla Ctrl mientras mantiene presionada la tecla izquierda del mouse. Para eliminar un área, mantenga presionada la tecla Mayús mientras mantiene presionada la tecla izquierda del mouse.NOTA: Para cambiar el tamaño del pincel circular o cuadrado, simplemente desplácese por la rueda del mouse mientras mantiene presionadas las teclas Ctrl o Mayús. Continúe pintando la estructura de interés a lo largo de todo su volumen Z. Convierta el ROI en una malla(Export | A una | de malla Normal). Resalte la superposición de malla haciendo clic en ella en el panel Propiedades y configuración de datos en la esquina superior derecha. Suavizar la malla utilizando un número adecuado de iteraciones (Smooth Mesh | Iteraciones).NOTA: Utilice el mismo valor de iteración de suavizado de malla para todas las imágenes que se van a comparar. Asegúrese de que las mediciones del ROI de la malla(Área de superficie, volumen y diámetro de Feret)se muestren en el panel Información en el lado derecho de la pantalla para el análisis morfométrico básico. Se pueden realizar análisis adicionales utilizando el módulo de análisis de objetos. Renderice el objeto de malla y toda la imagen del tomograma y visualícela en 3D. Utilice el Movie Maker integrado para generar un vídeo del objeto ( Clic con elbotón derecho del ratón | Mostrar Movie Maker) utilizando fotogramas individuales del visor (Agregar clave).NOTA: También se pueden aplicar varias mejoras visuales a la película utilizando la pestaña de efectos visuales en el panel de la derecha para resaltar ciertas características, etc. Exporta el vídeo para verlo con el botón Exportar animación de Movie Maker.

Representative Results

La Figura 2 muestra imágenes de un embrión, 3ª larva instar, pupas en la etapa adulta de pharate (P7) y una mosca hembra adulta teñida con yodo y fotografiada hidratada en agua utilizando un escáner de sobremesa comercial. La excelente conservación e incluso la tinción de tejidos delicados son evidentes, lo que permite que todos los órganos principales se identifiquen fácilmente y se utilicen para el análisis morfométrico y la visualización 3D. Por lo general, los escaneos que adquieren menos imágenes de proyección de la muestra proporcionan una resolución más baja que los escaneos que adquieren más imágenes de proyección, con la compensación de tiempo dedicado al escaneo. Aunque los tiempos de escaneo variarán según el instrumento y otros parámetros de escaneo, los escaneos que adquieren unos pocos cientos de proyecciones (~ 3 μm de tamaño de píxel de imagen) toman aproximadamente 30 minutos por espécimen, mientras que los escaneos que consisten en miles de imágenes de proyección (tamaño de píxel de imagen de 700 nm-1.25 μm) pueden tomar de 8 a 16 h. En la Figura 3se muestra una comparación de la misma carcasa de la cabeza de la mosca adulta tomada en modo de escaneo “lento” (miles de proyecciones) y “rápido” (cientos de proyecciones). Es importante destacar que los análisis morfométricos no difieren entre escaneos “lentos” y “rápidos”(Figura 3C)40. Nuestra tubería de imágenes, por lo tanto, utiliza escaneos rápidos para generar un tamaño de muestra suficientemente grande para el análisis morfométrico, y escaneos lentos para visualizar cualquier defecto morfológico o anatómico a mayor resolución. Usando el software (Paso 7), cualquier sistema de tejido u órgano de interés puede ser segmentado y utilizado para el análisis morfométrico y visualizado en 3D utilizando el creador de películas (Película 1). La Figura 4 muestra un ejemplo del abdomen de la mosca teñido con PTA y fotografiado hidratado (agua) o después del secado en punto crítico (CPD) en un microscopio de rayos X (Tabla de Materiales). El detalle que ofrece una combinación de la PTA y las capacidades de esta plataforma es fácilmente evidente en estas imágenes, de modo que las células epitelios individuales del intestino medio y los haces de espermatozoides dentro de los testículos se resuelven fácilmente. Mientras que la imagen CPD muestra una resolución ligeramente mayor en comparación con la muestra hidratada, se logra una mejor preservación de la ultraestructura de los tejidos delicados (como las células grasas cerca de la cutícula) con muestras hidratadas(Película 2). Figura 1: Descripción general del diseño del escáner y el montaje de muestras para μ-CT. (A) Un escáner comercial de sobremesa μ-CT. (B) Vista dentro del escáner. La fuente de rayos X (derecha) emite rayos X que pasan a través de la muestra ubicada en una etapa giratoria (flecha amarilla). La atenuación de estos rayos X genera contraste de imagen a medida que pasan a través de la muestra y hacia el detector, que consiste en una pantalla de centelleo que convierte los rayos X en fotones y una cámara CCD estándar (izquierda). (C) Montaje de una mosca de la fruta adulta para imágenes hidratadas en agua. Los puntos de conexión entre la punta de la pipeta y el soporte de latón están envueltos en película de parafina para evitar fugas y posibles daños al escáner. También se destaca el chuck del escenario. Tenga en cuenta que la punta de la pipeta se colocó ligeramente fuera del eje, lo que condujo a un tiempo de escaneo más largo y una resolución reducida en la reconstrucción final. (D) Una sola imagen de proyección 2D de una mosca hembra adulta; cientos o miles de estas proyecciones se adquieren durante un escaneo a lo largo del eje de rotación y se utilizan para la reconstrucción para generar tomogramas que contienen resolución isotrópica e información 3D precisa. Barras de escala (C) = 2 mm. P, posterior; V, Ventral. Esta cifra ha sido modificada a partir de Schoborg et al.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Todas las etapas del ciclo de vida de Drosophila melanogaster, fotografiadas por μ-CT. Muestras teñidas con yodo y fotografiadas hidratadas en agua. Se muestra un solo segmento 2D. (A) Un embrión que ha completado las primeras etapas de la gastrulación (asterisco). (B) Una tercera larva instar. (C) Un adulto farato P7 durante la metamorfosis. (D) Una hembra adulta. Se destacan varios órganos: BWM, músculos de la pared del cuerpo; Br, cerebro; Cd, cardia; Cr, cultivo; DLT: músculos longitudinales dorsales; DVM: músculos ventrales dorsales; E-AD: disco ojo-antenal; Em, embrión; FB, cuerpos gordos; FBCs, células grasas del cuerpo; H, corazón; Hg, intestino posterior; La, lámina; L, pierna; Mg, intestino medio; OL: lóbulo óptico cerebral; Ov, ovipositor; PC, cutícula pupal; SG: glándulas salivales; VNC: cordón nervioso ventral; W, ala; WD, disco alar. Barras de escala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, izquierda. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Tamaño de píxel de la cámara (μm): (A-D) 11.6. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Los parámetros de escaneo y la resolución de la imagen no alteran los análisis morfométricos. Una cabeza adulta escaneada utilizando tanto la configuración “rápida”delescáner (cientos de proyecciones) como la configuración del escáner(B, B)”lenta” (miles de proyecciones). El cerebro está delineado en amarillo. (C) Mediciones del volumen cerebral a partir de exploraciones lentas y rápidas. Estructuras destacadas: AL; lóbulo antenal; CB: cerebro central; FB, cuerpo en forma de abanico; FCs, células grasas; La, lámina; Lo, lobula; LoP, placa lobula; Yo, médula; Re, retina. n = 5, prueba t de Welch. ns = no significativo. Barras de escala = 100 μm. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 348 (B) 350. Tamaño de píxel de la cámara (μm): (A-B) 11.6. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Esta cifra ha sido modificada a partir de Schoborg et al.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Abdomen de Drosophila melanogaster fotografiado por microscopía de rayos X. Los abdomen se tiñeron con 0,5% de PTA y se les hidrató la imagen (agua) o después del secado en puntos críticos (CPD). (A) Punto crítico Abdomen seco, mostrado desde la perspectiva YZ y (A’) XZ perspectiva. (B) Abdomen hidratado, mostrado desde la perspectiva YZ y (B’) perspectiva XZ. Se destacan varios órganos: FC, células grasas; Hg, intestino posterior; Mg, Midgut; SP: Bomba de esperma; Te, Testículos. Barras de escala (A) = 250 μm. D, dorsal; A, Anterior; L, izquierda. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A-B) 0,65. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Película 1: Una tercera larva instar, renderizada en 3D usando el Movie Maker en Dragonfly. Los órganos destacados incluyen el cerebro (amarillo), los discos imaginales oculares-antenales (rojo), el cuerpo graso (azul) y los músculos de la pared del cuerpo (verde). Haga clic aquí para descargar esta película. Película 2: Comparación de muestras fotografiada en agua o después del secado en punto crítico. Se muestran abdomen teñidos con 0,5% de PTA. Ambos abdomen se escanearon con idénticos ajustes de tamaño de píxel de imagen (0,65 μm). Una serie de cortes 2D se muestran en un formato ‘Z-stack’ (YZ) que comienza en la superficie dorsal y termina en la superficie ventral del abdomen. Órganos destacados: FC, células grasas; Mg, Midgut; SP: Bomba de esperma; Te, Testículos. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A-B) 0,65. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discussion

Visualizar Drosophila melanogaster intacto en todas las etapas del desarrollo ha seguido siendo un desafío, principalmente debido a la incompatibilidad de la microscopía de luz con la cutícula gruesa y pigmentada que se encuentra en este animal. Mientras que otros métodos de imagen animal completo, como la Resonancia Magnética (RM), la Tomografía de Coherencia Óptica (OCT), y la ultramicroscopía junto con el desbroce de tejidos se han utilizado con éxito en moscas50,51, 52,53,54,μ-CT presenta una serie de ventajas que lo hacen ideal para la obtención de imágenes animales completas de este organismo13,15,30 . Los rayos X penetran fácilmente en la cutícula pigmentada y su pequeña longitud de onda permite obtener imágenes submúmétricas. El etiquetado requiere una inversión mínima en productos químicos ampliamente disponibles y no tiene habilidades especializadas en el banco13. los escáneres μ-CT también están disponibles comercialmente, y los costos son comparables a las plataformas de microscopía de luz, al tiempo que son más atractivos para una gama más amplia de disciplinas (Geología, Paleontología, Ingeniería, etc.) que también pueden beneficiarse de su disponibilidad en una institución. Las fuentes de rayos X sincrotrón también se pueden utilizar para imágenes de alta resolución μ-CT de insectos fijos y vivos31,55,56,pero son menos accesibles que los escáneres de sobremesa comerciales.

Este protocolo proporciona una forma eficiente de obtener imágenes μ-CT de adultos voladores, pupas, larvas y embriones celularizados. Tenga en cuenta que para muchos de los pasos descritos anteriormente, también se pueden aplicar métodos alternativos para preparar muestras para la obtención de imágenes. Otros estudios han proporcionado una comparación detallada de los diferentes pasos de fijación, etiquetado y secado para su uso en insectos y se alienta a los interesados en adoptar esta técnica a evaluar los méritos de cada enfoque1,4,13,29,30,57. Si bien este protocolo es relativamente sencillo, se presentan algunas sugerencias útiles.

Primero, se debe tener cuidado al interrumpir la cutícula de especímenes intactos de modo que los tejidos blandos subyacentes no se interrumpan significativamente. Es importante dejar que las etapas larvales y tempranas de la pupa se sometan a fijación durante 2 horas en la solución de Bouin antes de pinchar. Esto endurecerá el tejido y limitará la cantidad de hemolinfa que saldrá de los orificios de la cutícula, lo que puede alterar la arquitectura del órgano. Los segmentos corporales individuales (cabeza, tórax y abdomen) del adulto se pueden separar si la estructura (s) de interés se encuentra allí. Se recomienda usar un bisturí para cortar limpiamente estos segmentos en lugar de separarlos con forrceps, lo que podría interrumpir la arquitectura 3D del intestino o el sistema nervioso central, por ejemplo. En cuanto al tiempo, los adultos generalmente necesitan solo 16 horas. para una fijación completa, mientras que las etapas larvales y pupales necesitan 24 h. Además, si la tinción de yodo o PTA parece desigual, la muestra se puede volver a colocar en solución para incubar más tiempo hasta que se logre una tinción uniforme. Finalmente, las muestras hidratadas no deben colocarse a 4 ° C, ya que esto parece inducir la formación de burbujas de aire dentro de la cavidad corporal después del calentamiento a temperatura ambiente.

En segundo lugar, el montaje de la muestra variará según el instrumento, el tipo de etapa y si la muestra necesita permanecer hidratada o si se ha secado en un punto crítico. Si está hidratado, asegúrese de que la muestra no tenga fugas y posiblemente destruya el escáner. Al montar la muestra dentro de una punta de pipeta, asegúrese de empujar suavemente con un objeto opaco hasta que las muestras encuentren una ligera resistencia y no puedan moverse. Empujar demasiado fuerte puede conducir a la deformación de la cutícula y defectos estructurales subyacentes. Además, asegúrese de que la muestra esté alineada en el soporte lo más cerca posible del eje de rotación. Cualquier bamboleo aumentará los tiempos de escaneo debido al mayor campo de visión y reducirá la resolución del tomograma final después de la reconstrucción.

En tercer lugar, la configuración del escáner para adquirir imágenes de proyección también variará según el instrumento. Para maximizar las capacidades de resolución del escáner, el tamaño del punto del haz de rayos X debe ser lo más pequeño posible (5-10 μm). Esto se puede lograr equilibrando el voltaje de rayos X y la configuración de corriente de tal manera que la potencia total sea de 3-4 W. Con estos ajustes y el tiempo de exposición adecuado en la cámara, se puede lograr una atenuación adecuada del haz de rayos X por parte de la muestra y un contraste de imagen óptimo. El uso de filtros de aluminio o cobre entre el objeto y la fuente de rayos X se puede utilizar para ajustar la configuración óptima de energía de rayos X para obtener el mejor contraste de imagen o atenuar el haz lo suficiente para que se utilicen fuentes de mayor potencia. En cuanto a la resolución de la imagen, esto dependerá de muchas variables diferentes, incluido el tipo de mancha, el número de imágenes de proyección, el tamaño del píxel de la imagen, la posición de la cámara, el movimiento de la muestra, las vibraciones del escáner y los parámetros de reconstrucción. Un fantasma de patrón de barras (QRM GmbH) que contiene marcadores de tamaño conocidos puede ayudar a evaluar la resolución espacial para un escáner y una configuración de cámara determinados.

También vale la pena evaluar los méritos de obtener imágenes de muestras secas o hidratadas de puntos críticos. Sombke et al. realizaron una evaluación comparativa de los dos métodos y encontraron que el secado en puntos críticos era superior para aplicaciones de μ-CT que involucraban artrópodos30. Sin embargo, los beneficios de las muestras hidratadas son que los animales están sujetos a una menor exposición química y mecánica que podría conducir a artefactos cuantitativos y morfológicos. Esto también tiende a preservar los tejidos delicados mejor que la CPD. Sin embargo, las muestras hidratadas tienen una vida útil mucho más corta y deben tomarse imágenes a más tardar un mes después de la fijación, ya que la degradación del tejido y la reducción de la calidad de la imagen se vuelven obvias en ese momento. Además, la resolución de las muestras hidratadas será ligeramente inferior a una muestra seca de punto crítico, porque los rayos X también deben penetrar a través de la punta de una pipeta de plástico y el líquido circundante (agua o tampón). Las muestras secas de punto crítico se pueden conservar durante períodos de tiempo mucho más largos, especialmente cuando se mantienen en Drierite. También se pueden colocar directamente en la trayectoria del haz de rayos X simplemente pegando las alas o patas a un pasador de insecto y colocándolo en el mandril del escenario, simplificando el proceso de montaje. Sin embargo, la deshidratación extensa de etanol de estas muestras puede conducir a la contracción del tejido y la pérdida de la delicada arquitectura del tejido, por lo que es importante realizar un rango de concentraciones crecientes de EtOH para minimizar estos efectos. No obstante, debe tenerse en cuenta que todas las formas de tratamiento químico, incluida la fijación de paraformaldehído e incluso la tinción de yodo pueden causar contracción de los tejidos58,59. Si bien ninguno de los métodos proporcionará mediciones del “tamaño real del órgano” en una mosca viva, las mediciones morfométricas siguen siendo válidas cuando se comparan animales mutantes y de tipo salvaje, siempre y cuando los pasos de fijación, tinción y secado se lleven a cabo de manera idéntica para ambos conjuntos de muestras, preferiblemente en paralelo.

En conclusión, μ-CT proporciona una herramienta útil de imágenes animales completas para Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Muchos otros estudios han demostrado el poder de esta tecnología para comprender diversos aspectos de la taxonomía de insectos, la ecología, la fisiología, el desarrollo y la anatomía que pueden ayudar a informar futuros estudiosen moscas1,28,30,31,32,55,56,57 . Combinado con las herramientas genéticas y de microscopía de luz ya ampliamente utilizadas en este organismo, μ-CT puede posicionarse dentro de una tubería experimental que permite una comprensión más profunda entre el genotipo y el fenotipo.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nada de esto hubiera sido posible sin el apoyo de Nasser Rusan. Me gustaría agradecer a H. Doug Morris, Danielle Donahue y Brenda Klaunberg del Centro de Imágenes de Ratones de los NIH y a Ben Ache de Micro Photonics por su capacitación y discusión útil. También agradezco a Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss por escanear muestras de abdomen en el Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith y Rachel Ng también ayudaron con el escaneo. Mike Marsh de Object Research Systems proporcionó soporte técnico a Dragonfly. También estoy agradecido por el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (1K22HL137902-01) y los Fondos de Puesta en Marcha de la Universidad de Wyoming. También agradezco a los revisores anónimos por sus útiles sugerencias y comentarios.

Materials

100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).
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