JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии

Published: September 02, 2020
doi:
10.3791/61515
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

Summary

Представлен протокол, позволяющий визуализировать интактную Drosophila melanogaster на любой стадии развития с помощью микрокомпьютерной томографии.

Abstract

Инструменты биомедицинской визуализации позволяют исследуть молекулярные механизмы в пространственных масштабах, от генов до организмов. Drosophila melanogaster, хорошо охарактеризованный модельный организм, извлек выгоду из использования световой и электронной микроскопии для понимания функции генов на уровне клеток и тканей. Применение платформ визуализации, которые позволяют понять функцию генов на уровне всего интактного организма, еще больше расширит наши знания о генетических механизмах. Здесь представлен целый метод визуализации животных, который описывает шаги, необходимые для визуализации дрозофилы на любой стадии развития с использованием микрокомпьютной томографии (μ-КТ). Преимущества μ-CT включают коммерчески доступные приборы и минимальное практическое время для получения точной 3D-информации с разрешением на микронном уровне без необходимости вскрытия тканей или методов очистки. В сочетании с программным обеспечением, которое ускоряет анализ изображений и 3D-рендеринг, может быть выполнен подробный морфометрический анализ любой ткани или системы органов, чтобы лучше понять механизмы развития, физиологию и анатомию как для описательных, так и для проверки гипотез. Используя рабочий процесс визуализации, который включает в себя использование электронной микроскопии, световой микроскопии и μ-КТ, можно провести тщательную оценку функции гена, тем самым способствуя полезности этого мощного модельного организма.

Introduction

Методы визуализации, которые позволяют детально иссировать внутренние структуры объекта, не разрушая его общую 3D-архитектуру, оказались широко полезными для ряда различных дисциплин, включая физику, инженерию, материаловедение, археологию, палеонтологию, геологию и биологию1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Среди этих методов неразрушающей визуализации рентгеновские платформы особенно полезны из-за способности высокоэнергетических рентгеновских лучей проникать во многие различные типы образцов и материалов с минимальным рассеянием по сравнению с волнами видимого света. Таким образом, компьютерная томография (КТ), микрокомпьютная томография (μ-КТ), нанокомпьютная томография (нано-КТ) и синхротронная микротомография стали основными технологиями для рентгеновской визуализации образцов от метров до микрон с миллиметровым и субмикронным разрешением10,11,12,13,14.

Хотя эти платформы различаются по своей конструкции, геометрии рентгеновского излучения и компонентам, чтобы сбалансировать размер и разрешение выборки, все они полагаются на один и тот же основной принцип захвата изображения: источник рентгеновских лучей, которые проходят через объект и захватываются детектором. Дифференциальное затухание рентгеновского пучка при его прохождении через различные плотности внутри объекта создает контраст изображения. 3D-данные получаются путем вращения либо образца, либо детектора, собирая серию 2D-проекционных изображений, которые затем реконструируются с помощью алгоритмов в томограммы, содержащие 3D-информацию, разрешение которой изотропно в x,y,z15. Для многих настольных μ-КТ-сканеров, которые используют конусно-лучевую рентгеновскую геометрию для проецирования рентгеновских лучей на визуализируемый объект, алгоритм Фельдкампа используется для точной реконструкции объекта с минимальными ошибками16.

Разрешающая способность данной платформы определяется, прежде всего, системными параметрами, такими как размер рентгеновского пучка (размер пятна), геометрия сканера (расстояние от объекта до источника рентгеновского излучения), размер пикселей на детекторе и используемый алгоритм реконструкции. Дополнительные факторы, такие как вибрации сканера, флуктуации рентгеновского пучка, движение образца и тип материала или химическое пятно, используемое для визуализации объекта, также могут значительно влиять на пространственное разрешение при реальных условиях визуализации15.

Для биомедицинских применений КТ и μ-КТ сыграли ключевую роль в продвижении нашего понимания анатомии, физиологии, развития и механизмов заболевания, служа инструментом как для диагностики пациентов, так и в качестве доклинической платформы визуализации для модельных организмов17,18. Например, Mouse International Phenotyping Consortium, целью которого является идентификация функции каждого гена в геноме мыши, использует μ-CT как часть своего конвейера фенотипирования19. Их результаты имеют решающее значение для понимания генов, участвующих в процессах развития и заболевания, а также служат атласом для анатомии и развития мышей20. Другие модельные организмы, такие как рыбки данио и крысы, также полностью приняли использование μ-CT для выполнения фенотипирования целых животных ряда генных мутантов17,21,22,23.

Преимущество объединения визуализации целых животных с модельными организмами заключается в том, что механистическое понимание функции генов для данного биологического процесса может быть полностью изучено. Это возможно благодаря хорошо охарактеризованным геномам и многим генетическим инструментам, доступным в модельных организмах, которые позволяют точно манипулировать функцией генов в различных временных точках развития, специфических тканях, отдельных клетках и даже субклеточных органеллах. К ним относятся двоичные системы выражения, такие как система UAS/GAL4 (и ее многочисленные производные), CRISPR/Cas9 и RNAi24,25,26. Когда эти генетические инструменты используются в сочетании с мощным конвейером визуализации, состоящим из электронной микроскопии, световой микроскопии (флуоресцентной и нефлуоресцентной) и визуализации всего животного, такой как μ-CT, может быть достигнута тщательная оценка молекул, клеток, тканей, органов и всего организма, что позволяет гораздо глубже понять функцию генов.

Этот протокол фокусируется на использовании μ-CT в модельном организме Drosophila melanogaster, не являющихся млекопитающими, чьи бесчисленные генетические инструменты помогли прояснить многочисленные молекулярные механизмы26,27. Он был принят из предыдущих протоколов в немоделических насекомых1,28,29,30,31,32и основывается на предыдущих исследованиях μ-CT у дрозофилы, чтобы установить стандартизированный протокол для его использования у этого животного33,34,35,36,37,38,39. ,40,41. Описаны этапы успешной подготовки образцов, визуализации и анализа наборов данных fly μ-CT с использованием коммерчески доступных сканеров. С помощью этого протокола все стадии развития мухи могут быть визуализированы с высоким разрешением как для описательных, так и для проверки гипотез исследований, включая таксономию, анатомию, развитие, физиологию и заболевание27. Этот протокол также будет полезен для визуализации практически любых насекомых и даже неживых материалов, которые требуют химического окрашивания для контрастности изображения для улучшения визуализации с помощью μ-CT.

Protocol

1. Отбор проб и подготовка кутикулы Выберите подходящую точку развития (эмбрион, личинка, куколка или взрослая особь) для визуализации. Для эмбриональных стадий самок клетки на агаровых пластинах виноградного сока смазывают дрожжевой пастой и собирают яйца каждые 30-60 мин. Оставьте эти эмбрионы развиваться при 25 °C до тех пор, пока не будет достигнута надлежащая стадия. Для личиночных стадий соберите первую и вторую звезды из экспериментов по сбору эмбрионов. Непосредственно выбирайте блуждающие3-е звезды со стороны пищевого флакона в условиях отсутствия скученности. Для определения времени для куколок соберите белые пре-куколки (перевернутые дыхальца) и запишите время, когда кутикула начинает коричневеть. Животные будут проходить через 15 стадий развития куколки в определенные моменты времени после потемнения кутикулы и могут быть собраны соответственно42. Соберите взрослых особей как девственниц после эклозии и дайте состариться во флаконе с пищей в течение необходимого количества времени (например, 5 дней для полного развития кишечника). Переложите 5-50 животных в микроцентрифужную трубку размером 1,5 мл, содержащую 1 мл 0,5% тритона X-100 в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (0,5% PBST). Периодически постукивая по трубке на столешнице, высиживайте в течение 5 минут при комнатной температуре (RT), чтобы помочь в удалении гидрофобного покрытия и позволить животным полностью погрузиться в плавание. Для эмбриональной, личиночной и куколочной стадий остановить дальнейшее развитие, поместив трубку в тепловой блок, установленный на 100 °C в течение 20 с с последующим охлаждением при RT в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Животные также могут быть заморожены в жидком азоте37. 2. Фиксация и окрашивание Удалите 0,5% PBST и добавьте 1 мл раствора Буэна. Водопроводная трубка для обеспечения того, чтобы животные были полностью погружены в водоем.ВНИМАНИЕ: Раствор Буэна содержит формальдегид. Это может вызвать острую токсичность для кожи и глаз при пролитии и может быть смертельным при проглатывании. Носите перчатки, защитные очки и лабораторное пальто при обращении.ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы дополнительные методы фиксации, такие как использование этанола. Достоинства других фиксаторов подробно описаны в ссылках1,30. Для эмбрионов и взрослых образцов инкубируют на столешнице в течение 16-20 ч при РТ. Для образцов личинок и куколок зафиксируйте животных в течение 2 ч на RT. Выбросьте раствор Буина и промойте 1x PBS в течение 5 мин трижды. Переложите на многолуночную рассекательную чашку, содержащую 1x PBS, и используйте небольшой штифт, прикрепленный к держателю, чтобы проткнуть отверстие в передней и задней кутикуле, стараясь не нарушить какие-либо подлежащие мягкие ткани. Перенесите образцы личинок и куколок обратно в микрофьюжную трубку и добавьте 1 мл свежего раствора Буэна. Инкубировать на столешнице в течение 24 ч в RT. Удалите раствор Буина и промывайте образец в течение 30 минут 1 мл μ-CT Wash Buffer (0,1 M Na2HPO4,1,8% сахарозы) или 1x PBS трижды. Добавьте 1 мл соответствующего окрашивающего раствора и высиживайте на столешнице в течение 2-7 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор пятна будет зависеть от многих факторов, но, как правило, это баланс между проникновением, временем инкубации и разрешением. В целом, фосфовольцхновая кислота (PTA) обеспечивает превосходный контраст и разрешение мягких тканей, но требует механического разрушения кутикулы и более длительного времени инкубации. Достоинства различных типов пятен подробно описаны в ссылке1. Для окрашивания йодом используют 1 мл 0,1 Н I2KI (Раствор Люголя). Инкубировать в течение 2 дней. Дальнейшее разрушение кутикулы взрослого человека не требуется. Для окрашивания фосфовольфрамовой кислотой (ПТА) используйте 1 мл 0,5% (мас./об.) раствора, разбавленного в воде. Нарушите работу кутикулы взрослого человека, либо удалив ротовые части, либо проткнув отверстия в грудной клетке или брюшной кутикуле с помощью небольшой булавки, прикрепленной к держателю. Инкубировать в течение 5-7 дней или дольше, если окрашивание тканей оказывается неоднородным. Промывайте 1 мл сверхчистой воды или 1x PBS в течение 30 мин. Повторите шаг стирки. Храните животных в RT в сверхчистой воде или 1x PBS в течение одного месяца. Если животные должны быть отсканированы во время гидратации, перейдите непосредственно к разделу 4. Если требуется более длительное сохранение образца, перейдите к разделу 3 протокола. 3. Сушка в критической точке (опционально) Выполните серию обезвоживания этанола (EtOH) на образце: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Добавляют 1 мл раствора EtOH и инкубируют на столешнице в течение 1 ч для каждой концентрации в указанном порядке. После окончательного 100% замачить EtOH, замените его свежим 100% EtOH и дайте образцу инкубировать на столе в течение ночи. Выполните сушку образцов в критической точке в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Средства электронной микроскопии обычно имеют сушильную машину критической точки (см. Таблицу материалов),которая будет выполнять сушку образца после обезвоживания EtOH. 4. Монтаж образца Для критически точечных высушенных образцов горячий клей к штифту насекомого или другому держателю, предназначенному для размещения в патроне вращающейся ступени, или поместите его в пластиковую или стеклянную капиллярную трубку (внутренний диаметр ~ 1,0-1,25 мм). Для гидратированных образцов наполните наконечник пипетки P10 водой и закрепите узкий конец либо термоуплотнением, либо парафиновой пленкой, чтобы предотвратить утечку.ВНИМАНИЕ: Обязательно плотно оберните любые соединения, чтобы вода не просачивалась в сканер и не вызывала повреждений. Переложите один образец на наконечник пипетки с помощью щипцов. Используя длинный тонкий предмет, такой как притупленная игла 20 G или другой наконечник пипетки, осторожно протолкнуйте образец вниз по кончику, пока он просто не соткнется со стенкой наконечника пипетки, чтобы удерживать его на месте. Закройте отверстие наконечника пипетки парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение воды во время длительных сканирований. Установите пипетку P10 с помощью держателя, предназначенного для установки в патрон вращающейся ступени(рисунок 1A-C). 5. Сканирование Выполните все необходимые калибровки машины перед визуализацией в течение дня.ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут варьироваться в зависимости от производителя, и рекомендуется проконсультироваться со специалистом по применению, чтобы определить правильные шаги. Пожалуйста, ознакомьтесь с Таблицей материалов для получения конкретной информации о настройке и программном обеспечении, используемом в этом протоколе. Как правило, калибровки, такие как выравнивание оси ступени для удаления любых «колебаний», связанных с тем, что патрон находится вне оси относительно вращающейся ступени, и выполнение коррекции плоского поля для обеспечения равномерной интенсивности пикселей фона на камере, обеспечивают оптимальные условия изображения для наилучшего разрешения и наборов данных, которые сопоставимы при нескольких сканированиях. Откройте дверцу сканера, чтобы получить доступ к вращающейся сценической чайке, нажав на значок«Открыть дверь»в левом верхнем углу программного обеспечения. Прикрепите образец, затянув воротник вокруг основания держателя образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мягкое давление при прикреплении образца к вращающейся чаше, чтобы поддерживать выравнивание сканера. Установите параметры сканирования в программном обеспечении, управляющем сканером, для оптимального разрешения и контрастности.ПРИМЕЧАНИЕ: Они должны быть определены эмпирически, поскольку источник рентгеновского излучения, камера / детектор и геометрия каждого сканера будут варьироваться в зависимости от производителя. Дополнительную информацию для подбора оптимальных параметров также можно найти здесь43,а также у специалиста по применению производителя. Откройте элемент управления питанием источника X-Ray (Параметры | Источник рентгеновского излучения). Используйте ползунки для установки рентгеновского напряжения на 30-40 кВ и тока на 100-110 мкА для создания рентгеновского луча мощностью 3-4 Вт и небольшим размером пятна для улучшенного разрешения. Использование диалогового окна «Режимыполучения» (параметры | Режимы сбора),чтобы установить время экспозиции камеры на 500-800 мс. Используйте ползунок, расположенный рядом со значком увеличительного стекла в нижней части программного обеспечения, чтобы установить желаемый размер пикселя изображения (от ~ 700 нм до 4 мкм) в зависимости от настроек и положения камеры. Это определяет количество проекционных изображений, полученных во время сканирования, причем большее количество проекций приводит к улучшенному разрешению, но более длительному времени сканирования (см. Репрезентативные результаты). Щелкните и перетащите ползунок, расположенный рядом с вращающейся стрелкой в нижней части программного обеспечения, чтобы переместить образец по траектории поворота на 360°. Убедитесь, что образец остается в поле зрения. Нажмите на значок«Начать приобретение»(значок синей стрелки круга) в верхней части программного обеспечения. Появится диалоговое окно, в котором можно задать дополнительные параметры сканирования, а также назвать файл и выходную папку, в которой будет сохранено сканирование. Установите случайное движение на 10 и в среднем 4-6 кадров. Шаг поворота рассчитывается автоматически в зависимости от используемых настроек камеры. Начните сканирование, нажав кнопку’OK’в диалоговом окне Получение. Появится второе диалоговое окно индикатора выполнения, в которое отображается время сканирования. Теперь сканер будет получать серию проекционных изображений(рисунок 1D)образца вдоль пути вращения и не нуждается в мониторинге. 6. Реконструкция Для генерации томограмм выполните реконструкцию изображения с использованием проекционных изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя почти все реконструкции изображений со сканеров геометрии конусного луча основаны на алгоритме Фельдкампа16,отдельные параметры будут варьироваться в зависимости от программной реализации и должны определяться эмпирически. В качестве руководства можно использовать следующие настройки, относящиеся к коммерчески доступного программному обеспечению (см. Таблицу материалов). Такие параметры, как компенсация перекоса, уменьшение кольцевых артефактов и коррекция упрочнения луча (0% для большинства образцов мух), выполняются итеративным образом для выбора наилучших значений для окончательной реконструкции. Для опытных пользователей, которые хотели бы получить больший контроль над процессом реконструкции, см. интерфейс MATLAB здесь44. Выполните начальное выравнивание изображения с помощью алгоритма коррекции сдвига на основе эталонного сканирования45 (Действия | Выравнивание X/Y с эталонным сканированием). Тонкая настройка каждого параметра реконструкции (Start | Тонкая настройка). При этом активируется диалоговое окно «Тонкая настройка параметров». Настройте выравнивание, нажав кнопку’Далее’на’Post-Alignment’. Задайте для числа итераций пять, а для параметра — значение 1.0. Нажмите кнопку Пуск, чтобы создать серию предварительных просмотров. Выберите правильно выровненное изображение.ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно выровненное изображение не будет размытым или отображать «сдвигающие» артефакты, когда в противном случае непрерывная структура (например, кутикула) кажется разделенной. Тонкая настройка уменьшения артефакта кольца, щелкнув рядом с ним. Задайте для числа итераций пять, а для параметра — значение 1.0. Нажмите кнопку Пуск, чтобы создать серию предварительных просмотров. Выберите изображение, содержащее наименьшее количество колец. После того, как вышеуказанные параметры были оптимизированы для предоставления наилучшего изображения, убедитесь, что выбранные значения правильно представлены на вкладке Настройки (Настройки). Отрегулируйте любые конечные значения яркости и контрастности, используя гистограмму, параметры файла, такие как битовая глубина и тип, и используйте область интереса (ROI), охватывающую только интересующие структуры (например, только целую муху или голову), чтобы сократить вычислительное время(выход). Начало реконструкции (Start | Начало). Если требуется несколько реконструкций, добавьте текущий образ в диспетчер пакетов (Start | Добавить в пакет) и повторить шаги 6.2-6.5 для остальных изображений. 7. Анализ изображений Визуализируйте томограммы в двух и трех измерениях и выполняйте дальнейший морфометрический анализ с помощью бесплатного или коммерческого программного обеспечения.ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о программном обеспечении, используемом в этом протоколе, доступна в Таблице материалов. Другие программные пакеты, способные оценивать наборы данных μ-CT, включают бесплатные опции, такие как FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47и ITK-SNAP48,а также коммерческое программное обеспечение (например, AMIRA). Другие приложения, которые используют алгоритмы на основе машинного обучения для полуавтоматизации процесса сегментации, могут помочь ускорить рабочие процессы и уменьшить предвзятость человека (например, Biomedisa49). Импорт файла томограммы в программное обеспечение (Файл | Импорт файлов изображений). Метаданные, связанные с файлом, должны автоматически загружаться в окно, но также могут быть установлены вручную в соответствии со свойствами изображения. Чтобы сегментировать интересуяще структуру, нажмите на вкладку Сегмент в левой части экрана. Создание нового интересуемого региона (ROI) (Базовый | New),дайте ему имя и выберите подходящий цвет. Определите диапазон пороговых значений, охватывающий интересуемую структуру (Диапазон | Определение диапазона) с помощью ползунка. Выберите подходящий режим инструмента 2D или 3D ROI painter(ROI Painter | Вариант кисти). Нарисовать область, определенную порогом; нажмите и удерживайте клавишу Ctrl, удерживая левую клавишу мыши. Чтобы удалить область, нажмите и удерживайте клавишу Shift, удерживая левую клавишу мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить размер круглой или квадратной кисти, просто прокрутите колесо мыши, удерживая клавиши Ctrl или Shift. Продолжайте рисовать структуру интереса на протяжении всего его Z-объема. Преобразование ROI в сетку (Экспорт | На сетчатый | Нормальный). Выделите наложение сетки, щелкнув по нему на панели «Свойства и настройки данных» в правом верхнем углу. Сгладьте сетку, используя соответствующее количество итераций (Smooth Mesh | Итерации).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одно и то же значение итерации сглаживания сетки для всех изображений, которые необходимо сравнить. Убедитесь, что измерения ROI сетки(Площадь поверхности, Объем и Диаметр Ферета)отображаются на информационной панели в правой части экрана для базового морфометрического анализа. Дополнительный анализ может быть выполнен с помощью модуля объектного анализа. Рендеринг сетчатого объекта и всего изображения томограммы и визуализация в 3D. Используйте встроенную Киностудию для создания видео объекта (Щелкните правой кнопкой мыши | Показать Киностудию) с использованием отдельных кадров из средства просмотра (Добавить ключ).ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько визуальных улучшений также могут быть применены к фильму с помощью вкладки визуальных эффектов на правой панели, чтобы выделить определенные функции и т. Д. Экспортируйте видео для просмотра с помощью кнопки «Экспортировать анимацию» в Киностудии.

Representative Results

На рисунке 2 показаны изображения эмбриона,3-й звезды личинок, куколок на стадии фазата взрослой особи (P7) и взрослой самки мухи, окрашенной йодом и изображенной гидратированной в воде с помощью коммерческого настоеного сканера. Отличная сохранность и равномерное окрашивание тонких тканей очевидны, что позволяет легко идентифицировать все основные органы и использовать их для морфометрического анализа и 3D-визуализации. Как правило, сканирование, которое получает меньше проекционных изображений образца, обеспечивает более низкое разрешение, чем сканирование, которое получает больше проекционных изображений, причем компромиссом является время, затрачиваемое на сканирование. Хотя время сканирования будет варьироваться в зависимости от прибора и других параметров сканирования, сканирование, которое получает несколько сотен проекций (размер пикселя изображения ~ 3 мкм), занимает примерно 30 минут на образец, тогда как сканирование, состоящее из тысяч проекционных изображений (размер пикселя изображения 700 нм-1,25 мкм), может занять 8-16 ч. Сравнение одного и того же взрослого головного ухамки, взятого в режиме «медленного» (тысячи проекций) и «быстрого» (сотни проекций) сканирования, показано на рисунке 3. Важно отметить, что морфометрические анализы не различаются между «медленным» и «быстрым» сканированием(рисунок 3C)40. Поэтому наш конвейер визуализации использует быстрое сканирование для создания достаточно большого размера выборки для морфометрического анализа и медленное сканирование для визуализации любых морфологических или анатомических дефектов с более высоким разрешением. Используя программное обеспечение (Шаг 7), любая интересующий вас ткань или система органов может быть сегментирована и использована для морфометрического анализа и визуализирована в 3D с помощью создателя фильма(Фильм 1). На рисунке 4 показан пример брюшной полости мухи, окрашенной PTA и изображенной гидратированной (вода) или после сушки в критической точке (CPD) на рентгеновском микроскопе (Таблица материалов). Детализация, обеспечиваемая комбинацией PTA и возможностями этой платформы, легко проявляется на этих изображениях, так что отдельные эпителии клеток средней кишки и пучков сперматозоидов в яичках легко разрешаются. В то время как изображение CPD показывает незначительно повышенное разрешение по сравнению с гидратированным образцом, лучшее сохранение ультраструктуры деликатных тканей (таких как жировые клетки вблизи кутикулы) достигается с гидратированными образцами(фильм 2). Рисунок 1: Обзор конструкции сканера и монтажа образца для μ-CT. (A) Коммерческий настольный μ-КТ-сканер. (B) Вид внутри сканера. Источник рентгеновского излучения (справа) излучает рентгеновские лучи, которые проходят через образец, расположенный на вращающейся ступени (желтая стрелка). Затухание этих рентгеновских лучей создает контраст изображения, когда они проходят через образец и на детектор, который состоит из сцинтилляционного экрана, который преобразует рентгеновские лучи в фотоны и стандартной ПЗС-камеры (слева). (C) Установка взрослой плодовой мухи для гидратированной визуализации в воде. Точки соединения между наконечником пипетки и латунным держателем обернуты парафиновой пленкой для предотвращения утечки и потенциального повреждения сканера. Сценический патрон также выделен. Обратите внимание, что наконечник пипетки был расположен немного вне оси, что привело к увеличению времени сканирования и снижению разрешения при окончательной реконструкции. (D)Одно 2D-проекционное изображение взрослой самки мухи; сотни и тысячи этих проекций получаются во время сканирования вдоль оси вращения и используются для реконструкции для создания томограмм, содержащих изотропное разрешение и точную 3D-информацию. Шкала стержней (C) = 2 мм. P, задняя; V, Вентрал. Эта цифра была изменена по сравнению с Schoborg et al.40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Все стадии жизненного цикла Drosophila melanogaster, изображенные с помощью μ-CT. Образцы, окрашенные йодом и изображенные гидратированными в воде. Показан один 2D-срез. (A) Эмбрион, который завершил ранние стадии гаструляции (звездочка). (B) Третья личинка звезды. (C) P7 фарат взрослого взрослого человека во время метаморфоза. (D) Взрослая самка. Выделяются различные органы: BWM, мышцы стенки тела; Br, мозг; Cd, кардия; Cr, урожай; ДЛЬМ, дорсальные продольные мышцы; DVM, дорсальные вентральные мышцы; E-AD, глазной антенно-антенный диск; Эм, эмбрион; FB, жировые тела; FBC, жировые клетки организма; Н, сердце; Hg, задворка; Ла, ламина; L, нога; Мг, мидгут; ОЛ, зрительная доля мозга; Ов, яйцеклад; ПК, куколка кутикула; СГ, слюнные железы; ВНК, вентральный нервный канаповинный канатил; W, крыло; WD, диск крыла. Шкала стержней (A) = 100 мкм; (B)-(D) = 500 мкм. D, дорсальный; А, Передний; Л, Слева. Параметры сканирования: расстояние от источника до образца (мм): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Расстояние от источника до камеры (мм): (A, D) 350, (B, C) 285. Размер пикселя камеры (мкм): (A-D) 11,6. Размер пикселя изображения (мкм): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Параметры сканирования и разрешение изображения не изменяют морфометрический анализ. Голова взрослого человека сканируется с использованием как(A, A’)«быстрых» настроек сканера (сотни проекций), так и(B, B’) «медленных» настроек сканера (тысячи проекций). Мозг очерчен желтым цветом. (C) Измерения объема мозга из медленного и быстрого сканирования. Выделенные структуры: AL; антенная доля; CB, центральный мозг; FB, корпус в форме вентилятора; ФК, жировые клетки; Ла, ламина; Ло, лобула; LoP, пластина лобула; Я, продолговатый мозг; Re, сетчатка. n = 5, t-тест Уэлча. ns = незначимый. Шкала стержней = 100 мкм. Параметры сканирования: расстояние от источника до образца (мм): (A) 44,4, (B) 36,5. Расстояние от источника до камеры (мм): (A) 348 (B) 350. Размер пикселя камеры (мкм): (A-B) 11,6. Размер пикселя изображения (мкм): (A) 2.95, (B) 1.2. Эта цифра была изменена по сравнению с Schoborg et al.40. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Брюшная полость Drosophila melanogaster, изображенная с помощью рентгеновской микроскопии. Брюшко окрашивалось 0,5% PTA и визуалировалось гидратированным (вода) или после сушки в критической точке (CPD). (A) Критическая точка Высушенного брюшка, показанная с точки зрения YZ и (A’) XZ перспективы. (B) Гидратированный живот, показанный с точки зрения YZ и (B’) XZ перспективы. Выделяются различные органы: ФК, жировые клетки; Hg, задворка; Мг, Мидгут; SP, сперматозоидный насос; Те, Яички. Шкала стержней (A) = 250 мкм. D, дорсальная; А, Передний; Л, Слева. Параметры сканирования: Расстояние от источника до образца (мм): (A) 6,7, (B) 7. Расстояние от источника до камеры (мм): (A) 28 (B) 29,5. Цель: (A-B) 4X. Размер пикселя изображения (мкм): (A-B) 0,65. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Фильм 1: Третья звездная личинка, отрисовка в 3D с помощью Киностудии в Dragonfly. Выделенные органы включают мозг (желтый), глазно-антеннальные воображаемые диски (красный), толстое тело (синий) и мышцы стенки тела (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм. Фильм 2: Сравнение образцов, изображенных в воде или после высыхания в критической точке. Показаны брюшные полости, окрашенные 0,5% ПТА. Оба живота были отсканированы с одинаковыми настройками размера пикселя изображения (0,65 мкм). Серия 2D-срезов показана в формате «Z-stack» (YZ), начиная с дорсальной поверхности и заканчивая вентральной поверхностью брюшка. Выделенные органы: ФК, жировые клетки; Мг, Мидгут; SP, сперматозоидный насос; Те, Яички. Параметры сканирования: Расстояние от источника до образца (мм): (A) 6,7, (B) 7. Расстояние от источника до камеры (мм): (A) 28 (B) 29,5. Цель: (A-B) 4X. Размер пикселя изображения (мкм): (A-B) 0,65. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Discussion

Визуализация неповрежденной Drosophila melanogaster на всех этапах развития оставалась проблемой, в первую очередь из-за несовместимости световой микроскопии с толстой пигментированной кутикулой, обнаруженной у этого животного. В то время как другие методы визуализации целых животных, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ), оптическая когерентная томография (ОКТ) и ультрамикроскопия в сочетании с очисткой тканей, были успешно использованы умух50,51, 52,53, 54,μ-КТ представляет ряд преимуществ, которые делают его идеальным для визуализации всего животного этого организма13,15,30 . Рентгеновские лучи легко проникают в пигментированную кутикулу, а их малая длина волны позволяет проводить субмикронные изображения. Маркировка требует минимальных инвестиций в широко доступные химические вещества и отсутствия специализированных навыков стенда13. μ-КТ сканеры также коммерчески доступны, а затраты сопоставимы с платформами световой микроскопии, а также более привлекательны для более широкого круга дисциплин (геология, палеонтология, инженерия и т. Д.), Которые также могут извлечь выгоду из его доступности в учреждении. Синхротронные рентгеновские источники также могут использоваться для μ-КТ-визуализации высокого разрешения фиксированных и живых насекомых31,55,56,но менее доступны, чем коммерческие настольные сканеры.

Этот протокол обеспечивает эффективный способ получения μ-КТ изображений взрослых мух, куколок, личинок и клеточных эмбрионов. Обратите внимание, что для многих шагов, описанных выше, альтернативные методы также могут быть применены для подготовки образцов к визуализации. Другие исследования предоставили подробное сравнение различных этапов фиксации, маркировки и сушки для использования у насекомых, и тем, кто заинтересован в принятии этогометода,рекомендуется оценить достоинства каждого подхода1,4,13,29,30,57. Хотя этот протокол относительно прост, представлено несколько полезных предложений.

Во-первых, следует соблюдать осторожность при разрушении кутикулы неповрежденных образцов, чтобы подлежащие мягкие ткани существенно не нарушались. Важно дать личиночной и ранней стадиям куколки зафиксироваться в течение 2 часов в растворе Буэна перед тыканием. Это усилит ткань и ограничит количество гемолимфы, которая будет сочиться из отверстий кутикулы, что может изменить архитектуру органа. Отдельные сегменты тела (голова, грудная клетка и брюшко) взрослого человека могут быть разделены, если там расположены интересующих структуры. Рекомендуется использовать скальпель, чтобы чисто разрезать эти сегменты, а не раздвигать их щипцами, что может нарушить 3D-архитектуру кишечника или центральной нервной системы, например. Что касается времени, взрослым обычно требуется всего 16 часов. для полной фиксации, тогда как личинкам и куколкам необходимо 24 ч. Кроме того, если окрашивание йодом или ПТА кажется неравномерным, образец можно поместить обратно в раствор для инкубации дольше до тех пор, пока не будет достигнуто равномерное окрашивание. Наконец, гидратированные образцы не следует помещать при 4 °C, так как это, по-видимому, вызывает образование пузырьков воздуха в полости тела после нагревания до комнатной температуры.

Во-вторых, монтаж образца будет варьироваться в зависимости от инструмента, типа ступени и того, должен ли образец оставаться гидратированным или был высушен в критической точке. При гидратации убедитесь, что образец не протекает и, возможно, не разрушает сканер. При установке образца внутрь наконечника пипетки обязательно осторожно надавите на притупленный предмет, пока образцы не столкнутся с небольшим сопротивлением и не смогут двигаться. Слишком сильное нажатие может привести к деформации кутикулы и основным структурным дефектам. Также убедитесь, что образец выровнен в держателе как можно ближе к оси вращения. Любое колебание увеличит время сканирования из-за большего поля зрения и уменьшит разрешение конечной томограммы после реконструкции.

В-третьих, настройки сканера для получения проекционных изображений также будут варьироваться в зависимости от прибора. Чтобы максимизировать разрешающая способность сканера, размер пятна рентгеновского пучка должен быть как можно меньше (5-10 мкм). Это может быть достигнуто путем балансировки рентгеновских настроек напряжения и тока таким образом, чтобы общая мощность составила 3-4 Вт. С этими настройками и соответствующим временем экспозиции на камере может быть достигнуто надлежащее ослабление рентгеновского пучка образцом и оптимальная контрастность изображения. Использование алюминиевых или медных фильтров между объектом и источником рентгеновского излучения может быть использовано для тонкой настройки оптимальных настроек энергии рентгеновского излучения для наилучшего контраста изображения или ослабления луча достаточно для использования источников с более высокой мощностью. Что касается разрешения изображения, это будет зависеть от множества различных переменных, включая тип пятна, количество проекционных изображений, размер пикселя изображения, положение камеры, движение образца, вибрации сканера и параметры реконструкции. Фантом стержневого рисунка (QRM GmbH), содержащий маркеры известных размеров, может помочь оценить пространственное разрешение для данного сканера и настройки камеры.

Также стоит оценить достоинства визуализации критических точек высушенных или гидратированных образцов. Sombke et al. провели сравнительную оценку двух методов и обнаружили, что сушка в критической точке превосходит применение μ-КТ с участием членистоногих30. Однако преимущества гидратированных образцов заключаются в том, что животные подвергаются меньшему химическому и механическому воздействию, которое может привести как к количественным, так и к морфологическим артефактам. Это также имеет тенденцию сохранять нежные ткани лучше, чем CPD. Однако гидратированные образцы имеют гораздо более короткий срок годности и должны быть получены не позднее, чем через месяц после фиксации, поскольку деградация тканей и снижение качества изображения становятся очевидными в этот момент. Кроме того, разрешение гидратированных образцов будет немного меньше, чем у высушенного образца в критической точке, потому что рентгеновские лучи также должны проникать как через пластиковый наконечник пипетки, так и через окружающую жидкость (воду или буфер). Высушенные образцы могут храниться в течение гораздо более длительных периодов времени, особенно при хранения на дриерите. Они также могут быть размещены непосредственно на пути рентгеновского луча, просто приклеив крылья или ножки к штифту насекомого и поместив его в сценический патрон, упрощая процесс монтажа. Однако обширное обезвоживание этанола в этих образцах может привести к усадке тканей и потере деликатной тканевой архитектуры, поэтому важно выполнить ряд увеличивающихся концентраций EtOH, чтобы свести к минимуму эти эффекты. Тем не менее, следует отметить, что все формы химической обработки, включая фиксацию параформальдегида и даже окрашивание йодом, могут вызвать усадку тканей58,59. Хотя ни один из методов не обеспечит измерения «фактического размера органа» у живой мухи, морфометрические измерения по-прежнему действительны при сравнении животных мутантного и дикого типа, если этапы фиксации, окрашивания и сушки выполняются одинаково для обоих наборов образцов — предпочтительно параллельно.

В заключение, μ-CT предоставляет полезный инструмент визуализации всего животного для дрозофилы33,34,35,36,37,38,39,40,41. Многие другие исследования продемонстрировали силу этой технологии для понимания различных аспектов таксономии насекомых, экологии, физиологии, развития и анатомии, которые могут помочь в будущих исследованиях на мухах1,28,30,31,32,55,56,57 . В сочетании с инструментами генетической и световой микроскопии, уже широко используемыми в этом организме, μ-CT может позиционировать себя в экспериментальном конвейере, который позволяет глубже понять генотип и фенотип.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Все это было бы невозможно без поддержки Насера Русана. Я хотел бы поблагодарить Х. Дуга Морриса, Даниэль Донахью и Бренду Клаунберг из NIH Mouse Imaging Facility и Бена Аче из Micro Photonics за обучение и полезную дискуссию. Я также благодарю Мансуру Норузи Рада из Цейсса за сканирование образцов живота на Xradia 520 Versa. Лорен Смит, Саманта Смит и Рэйчел Нг также помогали со сканированием. Майк Марш из Object Research Systems обеспечил техническую поддержку Dragonfly. Я также благодарен за поддержку со стороны Национального института сердца, легких и крови (1K22HL137902-01) и стартовых фондов Университета Вайоминга. Я также благодарю анонимных рецензентов за их полезные предложения и комментарии.

Materials

100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetik. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  48. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  49. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  50. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  51. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  52. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  53. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  54. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  55. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  56. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  57. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  58. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

Drosophila MelanogasterMicrocomputed TomographyWhole Animal ImagingNon-destructive ImagingDevelopmental DefectsDisease ModelingSample PreparationBouin SolutionPBSStainingCritical Point DryingSample Mounting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image