마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징
Summary
마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.
Abstract
생물 의학 화상 진찰 공구는 유전자에서 유기체에 공간 비늘에 걸쳐 분자 기계장치의 조사를 허용합니다. Drosophila 멜라노가스터, 잘 특징적인 모형 유기체는, 세포와 조직의 수준에서 유전자 기능을 이해하기 위하여 빛과 전자 현미경 검사법의 사용에서 유익했습니다. 전체 온전한 유기체의 수준에서 유전자 기능의 이해를 허용하는 화상 진찰 플랫폼의 응용은 유전 기계장치에 대한 우리의 지식을 더욱 강화할 것입니다. 여기에 전체 동물 이미징 방법은 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μ-CT)을 사용하여 모든 발달 단계에서 Drosophila를 시각화하는 데 필요한 단계를 설명 제시된다. μ-CT의 장점은 조직 해부 또는 청산 방법에 대한 필요없이 미크론 수준의 해상도에서 정확한 3D 정보를 생성하기 위해 시판 가능한 계측 및 최소한의 실습 시간을 포함한다. 이미지 분석 및 3D 렌더링을 가속화하는 소프트웨어와 결합하여 모든 조직 또는 장기 시스템의 상세한 형태 분석은 설명 및 가설 테스트 연구를 위한 개발, 생리학 및 해부학 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 수행될 수 있습니다. 전자 현미경 검사법, 광 현미경 검사법 및 μ-CT의 사용을 통합하는 이미징 워크플로우를 활용하여 유전자 기능에 대한 철저한 평가를 수행하여 이 강력한 모델 유기체의 유용성을 발전시킬 수 있습니다.
Introduction
전체 적인 3D 아키텍처를 파괴하지 않고 물체의 내부 구조를 상세히 조사할 수 있도록 하는 이미징 방법은 물리학, 공학, 재료 과학, 고고학, 고생물학, 지질학, 생물학1,2,3,4,5,6,7,8,9등 다양한 분야에 널리 유익한 것으로 입증되었습니다. . 이러한 비파괴 이미징 방법 중, X선 기반 플랫폼은 가시 광선에 비해 최소한의 산란으로 많은 다른 샘플 유형과 재료를 관통하는 고에너지 X 선의 능력으로 인해 특히 유용합니다. 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 (μ-CT), 나노 컴퓨팅 단층 촬영 (나노 CT), 및 싱크로트론 미세 토그래피는, 따라서, 밀리미터에서 마이크로폰에 이르기까지 샘플의 X 선 기반 이미징에 대한 주요 기술로등장10,11,12,13,14.
이러한 플랫폼은 샘플 크기와 해상도의 균형을 맞추기 위해 설계, X-ray 형상 및 구성 요소와 다르지만 모두 물체를 통과하여 검출기에 의해 캡처되는 X 선 소스인 이미지 캡처에 대한 동일한 기본 원칙에 의존합니다. X선 빔이 오브젝트 내의 다양한 밀도를 통과할 때 차감하여 이미지 대비를 생성합니다. 3D 데이터는 샘플 또는 검출기를 회전하여 알고리즘을 사용하여 분해되는 일련의 2D 프로젝션 이미지를 수집하여 x, y,z15에서이소트로픽이 있는 3D 정보를 포함하는 토모그램으로 재구성한다. 원뿔 빔 X선 형상을 사용하여 이미지되는 물체에서 X선을 투영하는 많은 벤치탑 μ CT 스캐너의 경우 Feldkamp 알고리즘은 최소한의 오류16으로물체를 정확하게 재구성하는 데 사용됩니다.
주어진 플랫폼의 해상도는 주로 X선 빔(spot size), 스캐너 지오메트리(물체에서 X선 소스까지의 거리), 검출기의 픽셀 크기 및 채택된 재구성 알고리즘과 같은 시스템 파라미터에 의해 결정됩니다. 스캐너 진동, X선 빔 변동, 샘플 이동 및 물체를 시각화하는 데 사용되는 재료 유형 또는 화학 적 얼룩과 같은 추가 요인은 실제 이미징콘디션(15)에서공간 해상도에 큰 영향을 미칠 수 있다.
생물 의학 응용을 위해, CT와 μ-CT는 해부학, 생리학, 발달 및 질병 기계장치에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을했으며, 인간 환자 진단과 모델유기체17,18을위한 전임상 이미징 플랫폼으로서 역할을 합니다. 예를 들어, 마우스 게놈의 모든 유전자의 기능을 식별하는 것이 목표인 마우스 인터내셔널 페노티핑 컨소시엄은 μ-CT를 피노핑파이프라인(19)의일부로 활용한다. 그들의 결과는 또한 마우스 해부학 및 발달을 위한 아틀라스역할을 하는 동안 발달과 질병 프로세스에 관련되었던 유전자를 이해하기 위한 중요했습니다20. 제브라피시 및 쥐와 같은 다른 모델 유기체는 또한 유전자돌연변이체(17, 21,22,23)의수의 전체 동물 페노핑을 수행하기 위한 μ-CT의 사용을 완전히수용했다.
전체 동물 화상 진찰과 모델 유기체를 결합하는 장점은 주어진 생물학적 과정에 대한 유전자 기능에 대한 기계적 이해가 완전히 탐구 될 수 있다는 것입니다. 이것은 명백한 발달 시점에서 유전자 기능의 정확한 조작을 허용하는 모형 유기체에서 유효한 잘 특징인 게놈 및 많은 유전 공구 때문에 가능합니다, 특정 조직, 개별 세포, 및 심지어 세포 세포 소기관. 여기에는 UAS/GAL4 시스템(및 많은 파생상품), CRISPR/Cas9 및 RNAi24,25, 26과같은 바이너리 식 시스템이포함됩니다. 이러한 유전 적 도구는 전자 현미경 검사법, 광 현미경 검사법 (형광 및 비 형광)으로 구성된 강력한 이미징 파이프 라인과 함께 사용될 때, μ CT와 같은 전체 동물 이미징, 분자, 세포, 조직, 장기 및 전체 유기체의 철저한 평가를 달성 하여 유전자 기능에 대한 훨씬 더 깊은 이해를 가능하게합니다.
이 프로토콜은 비 포유류 모델 유기체 Drosophila melanogaster에서 μ CT의 사용에 초점을 맞추고, 누구의 무수한 유전 도구는 수많은 분자 메커니즘을 해명 하는 데 도움이26,27. 비모델 곤충1,28,29,30,31,32의이전 프로토콜에서 채택되었으며, 드로소필라에서 이전 μ CT 연구를 기반으로 이 동물33,34,35,36,37, 38,38, 39에사용할 수 있는 표준화된 프로토콜을확립했습니다. ,40,41. 상용 스캐너를 사용하여 플라이 μ-CT 데이터 세트의 성공적인 샘플 준비, 이미징 및 분석을 위한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜을 통해 비행의 모든 발달 단계는 분류, 해부학, 발달, 생리학 및질병(27)을포함한 설명 및 가설 테스트 연구 모두에 대해 고해상도로 시각화될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 μ-CT에 의한 시각화를 향상시키기 위해 이미지 대비를 위해 화학 적 염색을 필요로하는 거의 모든 곤충및 비 살아있는 물질을 이미징하는 데 유용할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 발달 단계에서 온전한 Drosophila melanogaster를 시각화하는 것은 주로이 동물에서 발견되는 두껍고 색소화 된 큐티클과 가벼운 현미경 검사법의 비호환성으로 인해 어려움을 유지하고 있습니다. 자기 공명 영상 (MRI), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 조직 클리어링과 결합 된 초미세 검사법과 같은 다른 전체 동물 이미징 방법은 파리50,51,52,53,54,μ-CT와 같은 다른 전체 동물 이미징 방법이 이 유기체13,15,30의 전체 동물 이미징에 이상적이되는 많은 장점을 제시합니다. . 엑스레이는 쉽게 안료 표피를 관통하고 그들의 작은 파장은 서브 미크론 화상 진찰을 허용합니다. 라벨링은 널리 사용 가능한 화학 물질에 대한 최소한의 투자가 필요하며 전문 벤치기술(13)이필요하지 않습니다. μ-CT 스캐너도 시판되고, 비용은 가벼운 현미경 플랫폼에 필적하는 동시에 기관에서 사용할 수 있는 더 넓은 범위(지질학, 고생물학, 엔지니어링 등)에 더 매력적입니다. 싱크로트론 X선 소스는 고정 및 살아있는 곤충31,55,56의고해상도 μ-CT 이미징에도 사용할 수 있지만 상업용 벤치탑 스캐너보다 접근이 덜합니다.
이 프로토콜은 비행 성인, 강아지, 애벌레 및 세포화 배아의 μ CT 이미지를 얻을 수있는 효율적인 방법을 제공합니다. 위에서 설명한 많은 단계의 경우 이미징을 위한 샘플을 준비하기 위해 대체 방법을 적용할 수도 있습니다. 다른 연구는 곤충에 사용하기 위한 상이한 고정, 라벨링 및 건조 단계에 대한 상세한 비교를 제공했으며, 이 기술을 채택하는 데 관심이 있는 사람들은 각 접근법1,4,13,29,30,57의장점을 평가하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하지만 몇 가지 유용한 제안이 표시됩니다.
첫째, 근본적인 연조직이 현저하게 중단되지 않도록 온전한 견본의 표피를 중단할 때 주의해야 합니다. 애벌레와 초기 pupal 단계는 찌르기 전에 부인의 솔루션에서 2 시간 동안 고정을 겪는 것이 중요합니다. 이것은 조직을 뻣뻣하게 하고 기관 건축을 바꿀 수 있는 큐티클 구멍에서 스며드는 혈몰리의 양을 제한할 것입니다. 성인의 개별 신체 세그먼트(머리, 흉부 및 복부)는 관심있는 구조가 있는 경우 분리될 수 있다. 예를 들어, 장이나 중추 신경계의 3D 아키텍처를 방해할 수 있는 집게로 떼어내는 대신 메스를 사용하여 이러한 세그먼트를 깔끔하게 슬라이스하는 것이 좋습니다. 타이밍에 관해서는, 성인은 일반적으로 단지 16 시간 필요. 완전한 고정을 위해, 애벌레와 pupal 단계는 24 h가 필요한 반면. 또한 요오드 또는 PTA 염색이 고르지 않은 것처럼 보이는 경우, 샘플은 얼룩이 도출될 때까지 더 오래 배양하기 위해 용액에 다시 배치될 수 있다. 마지막으로, 수화 시료는 4°C에 배치되어서는 안 되며, 이는 실온으로 온난화한 후 체내의 기포 형성을 유도하는 것으로 보인다.
둘째, 시료 마운팅은 계측기, 스테이지 유형 및 시료가 수분을 유지해야 하는지 또는 임계점을 건조해야 하는지 여부에 따라 달라집니다. 수분을 공급하는 경우 샘플이 누출되지 않고 스캐너를 파괴할 수 있는지 확인합니다. 피펫 팁 안에 샘플을 장착할 때, 표본이 약간의 저항을 겪고 움직일 수 없을 때까지 둔한 물체로 부드럽게 밀어넣으십시오. 너무 강하게 밀면 큐티클 변형과 근본적인 구조적 결함으로 이어질 수 있습니다. 또한 샘플이 가능한 한 회전 축에 가깝게 홀더에 정렬되어 있는지 확인합니다. 모든 흔들림은 더 큰 시야로 인해 스캔 시간을 늘리고 재건 후 최종 토모그램의 해상도를 줄입니다.
셋째, 프로젝션 이미지를 획득하기 위한 스캐너 설정도 기기마다 다릅니다. 스캐너의 해상도 기능을 최대화하려면 X선 빔 스팟 크기는 가능한 한 작아야 합니다(5-10 μm). 이는 X-Ray 전압과 전류 설정의 균형을 맞추어 총 전력이 3-4W인 것을 달성할 수 있습니다. 이러한 설정과 카메라의 적절한 노출 시간을 통해 샘플에 의한 적절한 X선 빔 감쇠와 최적의 이미지 콘트라스트를 달성할 수 있습니다. 물체와 X선 소스 사이에 알루미늄 또는 구리 필터를 사용하여 최적의 이미지 콘트라스트를 위해 최적의 X선 에너지 설정을 미세 조정하거나 더 높은 전원을 사용할 수 있도록 빔을 충분히 감쇠하는 데 사용할 수 있습니다. 이미지 해상도는 얼룩 유형, 투사 이미지 수, 이미지 픽셀 크기, 카메라 위치, 샘플 움직임, 스캐너 진동 및 재구성 매개 변수를 포함한 다양한 변수에 따라 달라집니다. 알려진 크기 마커가 포함된 막대 패턴 팬텀(QRM GmbH)은 지정된 스캐너 및 카메라 설정에 대한 공간 해상도를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.
또한 화상 진찰 임계 점 건조 또는 수화 샘플의 장점을 평가 가치가있다. Sombke 등은 두 가지 방법에 대한 비교 평가를 수행하고절지동물(30)을포함하는 μ-CT 응용 분야에서 임계점 건조가 우수하다는 것을 발견했다. 그러나, 수화 견본의 이득은 동물이 양적 및 형태학적 유물 둘 다로 이끌어 낼 수 있는 더 적은 화학및 기계적인 노출을 복종한다는 것입니다. 이것은 또한 CPD 보다는 더 나은 섬세한 조직을 보존하는 경향이 있습니다. 그러나, 수화 된 샘플은 유통 기한이 훨씬 짧으며 조직 저하 및 감소 된 이미지 품질이 그 시점에서 명백해지기 때문에 고정 후 한 달 이상 이미지화되어야합니다. 또한, 수화 시료의 분해능은 금속 파이펫 팁과 주변 액체(물 또는 완충)를 통해 X선이 침투해야 하기 때문에 임계점 건조 시료보다 약간 적을 것이다. 임계 점 건조 시료는 특히 건조기에 보관할 때 훨씬 더 오랜 시간 동안 보존할 수 있습니다. 또한 날개나 다리를 곤충 핀에 접착하여 스테이지 척에 배치하여 장착 과정을 단순화하여 X선 빔 경로에 직접 배치할 수 있습니다. 그러나, 이러한 샘플의 광범위한 에탄올 탈수는 조직 수축 및 섬세한 조직 아키텍처의 손실로 이어질 수 있으며, 이러한 효과를 최소화하기 위해 EtOH 농도를 증가시키는 것이 중요한 이유입니다. 그럼에도 불구하고, 파라포름알데히드 고정 및 요오드 염색을 포함한 모든 형태의 화학 적 처리가 조직 수축을 일으킬 수 있음을 주목해야한다58,59. 두 방법 모두 살아있는 비행에서 ‘실제 장기 크기’의 측정을 제공하지 는 않지만, 고정, 염색 및 건조 단계가 두 샘플 세트에 대해 동일하게 수행되는 한 돌연변이 및 야생 형 동물을 비교할 때 형태 측정은 여전히 유효합니다.
결론적으로, μ-CT는 드로소필라33,34,35,36,37,38,39,40,41에유용한 전체 동물 이미징 도구를 제공한다. 다른 많은 연구는 곤충 분류, 생태학, 생리학, 개발 및 파리1,28,30,31,32,55,56,57의 미래 연구를 알리는 데 도움이 될 수있는 해부학의 다양한 측면을 이해하기위한이 기술의 힘을선보였습니다. . 이미 이 유기체에서 널리 사용되는 유전 및 가벼운 현미경 도구와 결합된 μ-CT는 유전자형과 표현형 사이의 깊은 이해를 허용하는 실험 파이프라인 내에 위치할 수 있습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나세르 루산의 지원없이는 이 중 어느 것도 불가능했을 것이다. NIH 마우스 이미징 시설의 H. 더그 모리스, 다니엘 도나휴, 브렌다 클라운버그, 그리고 마이크로 포토닉스의 벤 아쉬에게 교육과 유용한 토론을 감사드립니다. 나는 또한 Xradia 520 Versa에 복부 샘플을 스캔자이스의 만수레 노루지 라드 감사합니다. 로렌 스미스, 사만다 스미스, 레이첼 응도 스캔을 도왔다. 물체 연구 시스템의 마이크 마쉬는 잠자리 기술 지원을 제공했다. 또한 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (1K22HL137902-01)와 와이오밍 대학의 시작 기금의 지원에 감사드립니다. 나는 또한 그들의 유용한 제안과 의견에 대한 익명의 검토자에게 감사드립니다.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
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