微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング
Summary
マイクロコンピュータ断層撮影を用いた開発のあらゆる段階で、無傷の ショウジョウジョウバエメラノガスター の可視化を可能にするプロトコルが提示される。
Abstract
生物医学イメージングツールは、遺伝子から生物まで、空間的なスケールを越えた分子メカニズムの研究を可能にします。 ショウジョウバエメラノガスターは、 細胞や組織のレベルで遺伝子機能を理解するために光と電子顕微鏡を使用することから恩恵を受けています。無傷の生物全体のレベルで遺伝子機能を理解できるイメージングプラットフォームの応用は、遺伝的メカニズムに関する我々の知識をさらに高めるだろう。ここでは、微小コンピュータ断層撮影(μ-CT)を用いて任意の発達段階で ショウジョウバエ を可視化するために必要なステップを概説する全動物イメージング法を提示する。μ-CTの利点は、組織解剖やクリア方法を必要とせずにミクロンレベルの解像度で正確な3D情報を生成するための市販の計装と最小限のハンズオン時間を含みます。画像解析や3Dレンダリングを加速するソフトウェアと組み合わせることで、組織や臓器系の詳細な形態学的解析を行い、記述的および仮説的試験研究のための発達、生理学、解剖学のメカニズムをよりよく理解することができます。電子顕微鏡、光顕微鏡、μ-CTを利用したイメージングワークフローを活用することで、遺伝子機能の徹底的な評価が可能となり、この強力なモデル生物の有用性を高めることができます。
Introduction
3Dアーキテクチャ全体を破壊することなく、物体の内部構造を詳細に調査できるイメージング法は、物理学、工学、材料科学、考古学、古生物学、地質学、生物学1、2、3、4、5、6、7、8、8、9のさまざまな分野に広く有益であることが証明されています。 .これらの非破壊イメージング法の中でも、X線ベースのプラットフォームは、可視光波に比べて散乱を最小限に抑え、多くの異なる種類のサンプルや材料に高エネルギーX線が浸透する能力のために特に有用である。コンピュータ断層撮影(CT)、微小断層撮影(μ-CT)、ナノコンピュータ断層撮影(Nano-CT)、シンクロトロン微小トモグラフィーは、メートルからミクロンまでのサンプルのX線イメージングの主要技術として浮上し、ミリメートルからサブミクロン分解能10、11、12、13、14に至る。
これらのプラットフォームは、サンプルサイズと解像度のバランスをとるために設計、X線ジオメトリ、コンポーネントが異なりますが、すべて同じ基本原理に依存して画像キャプチャを行います: オブジェクトを通過し、検出器によってキャプチャされるX線のソース。X線ビームがオブジェクト内の様々な密度を通過する際の差動減衰は、画像のコントラストを生成します。3Dデータは、試料または検出器のいずれかを回転させて取得し、アルゴリズムを用いて再構成される一連の2D投影画像を、X、y、z15において等方性の分解能を持つ3D情報を含むトモグラムに再構成する。イメージ対象の物体にX線を投影するためにコーンビームX線幾何学を利用する多くのベンチトップμ-CTスキャナでは、Feldkampアルゴリズムは、最小誤差16でオブジェクトを正確に再構築するために使用される。
所定のプラットフォームの解像度は、主にX線ビームのサイズ(スポットサイズ)、スキャナジオメトリ(物体からX線源までの距離)、検出器上のピクセルのサイズ、および使用される再構成アルゴリズムなどのシステムパラメータによって決定されます。また、スキャナ振動、X線ビームの揺らぎ、サンプルの動き、物体の可視化に使用される材料タイプまたは化学染色などの追加要因も、実世界のイメージング・コンディション15の下で空間分解能に大きく影響を与える可能性がある。
生物医学の応用のために、CTおよびμ-CTは解剖学、生理学、発達および病気のメカニズムについての理解を進める上で重要な役割を果たし、ヒト患者の診断のためのツールとして、そしてモデル生物17、18のための前臨床画像化プラットフォームとして役立つ。例えば、マウス・インターナショナル・フェノタイピング・コンソーシアムは、マウスゲノム中のすべての遺伝子の機能を同定することを目的とし、μ-CTをその表現型パイプライン19の一部として利用する。彼らの結果は、開発および疾患プロセスに関与する遺伝子を理解するために重要であり、マウス解剖学および開発20のアトラスとしても機能している。ゼブラフィッシュやラットなどの他のモデル生物も、多数の遺伝子変異体17、21、22、23の全動物の表現型を行うためのμ-CTの使用を完全に受け入れてきた。
動物イメージング全体とモデル生物を組み合わせることの利点は、特定の生物学的プロセスに対する遺伝子機能の機械的理解を十分に探求できることである。これは、明確な発達時点、特定の組織、個々の細胞、さらには細胞内小器官で遺伝子機能を正確に操作することを可能にするモデル生物で利用可能なゲノムと多くの遺伝的ツールのために可能です。これらには、UAS/GAL4 システム (およびその多くの誘導体)、CRISPR/Cas9、RNAi24、25、26などのバイナリ式システムが含まれます。これらの遺伝子ツールを電子顕微鏡、光顕微鏡(蛍光法、非蛍光)、μ-CTなどの動物イメージング全体と組み合わせて使用すると、分子、細胞、組織、臓器、生物全体の徹底的な評価が可能になり、遺伝子機能の理解が深まる。
このプロトコルは、非哺乳類モデル生物ショウジョウバエメラノガスターにおけるμ-CTの使用に焦点を当てており、その無数の遺伝的ツールは、多くの分子機構26、27を解明するのに役立った。これは、非モデル昆虫1、28、29、30、31、32の以前のプロトコルから採用され、この動物33、34、35、36、37、38、39での使用のための標準化されたプロトコルを確立するためにショウジョウバエの以前のμ-CT研究を構築します 、40,41.市販のスキャナーを使用したフライμ-CTデータセットのサンプル調製、イメージング、分析を成功させるための手順を概説します。このプロトコルを使用すると、ハエのすべての発達段階は、分類、解剖学、発達、生理学、疾患27を含む記述的および仮説試験研究の両方の高解像度で視覚化することができる。このプロトコルは、μ-CTによる可視化を強化するために、画像コントラストに化学的染色を必要とする昆虫や非生きた物質を事実上撮影するのにも有用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
すべての発達段階で無傷のショウジョウバエメラノガスターを視覚化することは、主にこの動物に見られる厚い色素性キューティクルと光顕微鏡の不適合のために、挑戦のままです。磁気共鳴画像法(MRI)、光コヘレンス断層撮影(OCT)、組織クリアリングと組み合わせた超顕微鏡検査などの他の動物イメージング法は、ハエ50、51、52、53、54、μ-CTで成功を収めていますが、この生物の動物イメージング全体に最適な利点が数多くあります。.X線は、色素性キューティクルに容易に浸透し、その小さい波長は、サブミクロンイメージングを可能にする。ラベリングは、広く利用可能な化学物質への最小限の投資を必要とし、専門のベンチスキル13.μ-CTスキャナーも市販されており、コストは光顕微鏡プラットフォームに匹敵する一方で、より幅広い分野(地質学、古生物学、エンジニアリングなど)にとっても魅力的であり、機関での入手可能性からも恩恵を受けることができます。シンクロトロンX線源は、固定および生きている昆虫31、55、56の高解像度μ-CTイメージングにも使用できますが、商用ベンチトップスキャナよりもアクセスが少ないです。
このプロトコルは、フライ成人、子犬、幼虫および細胞化胚のμ-CT画像を得るための効率的な方法を提供する。なお、上記の多くの手順では、イメージング用のサンプルを準備するために代替方法を適用することもできます。他の研究は、昆虫に使用するための異なる固定、標識、および乾燥ステップの詳細な比較を提供しており、この技術を採用することに興味がある人は、各アプローチ1、4、13、29、30、57のメリットを評価することが奨励されている。このプロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの役に立つ提案が提示されています。
まず、基礎となる軟部組織が著しく破壊されないような無傷の標本のキューティクルを破壊する場合には注意が必要です。幼虫と初期のプパル段階は、突く前にブインの溶液中で2時間固定を受けることが重要です。これは、組織を硬化させ、器官のアーキテクチャを変更することができるキューティクルの穴からにじみ出るヘモリンパの量を制限します。目的の構造が存在する場合、成人の個々の身体セグメント(頭、胸部および腹部)を分離することができます。例えば、鉗子でそれらを引き離すのではなく、これらのセグメントをきれいにスライスするためにメスを使用することをお勧めします。タイミングに関しては、大人は一般的に16時間しか必要としないです。完全な固定のために、幼虫およびパパル段階は24時間を必要とする。また、ヨウ素またはPTA染色が不均一に見える場合、試料を溶液中に戻して、染色が達成されるまでより長くインキュベートすることができる。最後に、水和サンプルは、室温に温めた後に体腔内の気泡の形成を誘導するように見えるので、4°Cに置かれるべきではありません。
第2に、サンプル取り付けは、機器、ステージタイプ、およびサンプルが水分補給を維持する必要があるか、または臨界点乾燥されているのかによって異なります。水分が補給された場合は、サンプルが漏れないようにし、スキャナーを破壊する可能性があることを確認してください。ピペットチップ内にサンプルを取り付ける場合は、試料がわずかな抵抗に遭遇して動かなくなるまで、鈍い物体で軽く押し込みます。強く押しすぎると、キューティクルの変形や下層構造の欠陥につながる可能性があります。また、サンプルが可能な限り回転軸に近いホルダーに揃えられていることを確認します。任意のウォブルは、視野の大きさのためにスキャン時間を増加させ、再構築後の最終的な断食率の分解能を低下させます。
3つ目は、投影画像を取得するためのスキャナ設定も計測器によって異なります。スキャナーの分解能を最大限に高めるには、X線ビームスポットサイズを可能な限り小さくする必要があります(5~10 μm)。これは、X線の電圧と電流の設定のバランスをとることで、総電力が3〜4Wになるように実現できます。これらの設定とカメラの適切な露光時間により、サンプルによる適切なX線ビーム減衰と最適な画像コントラストを実現できます。物体とX線源の間にアルミニウムまたは銅フィルターを使用することで、最適なX線エネルギー設定を微調整して、画像コントラストを最適に調整したり、高出力源を使用するためにビームを十分に減衰させることができます。画像解像度に関しては、染色タイプ、投影画像の数、画像ピクセルサイズ、カメラ位置、サンプルの動き、スキャナの振動、再構成パラメータなど、さまざまな変数に依存します。既知のサイズマーカーを含むバーパターンファントム(QRM GmbH)は、特定のスキャナとカメラ設定の空間解像度を評価するのに役立ちます。
また、イメージングクリティカルポイントが乾燥または水和サンプルをイメージングするメリットを評価する価値があります。Sombkeら. 2つの方法の比較評価を行い、節足動物30を含むμ-CT用途に対して臨界点乾燥が優れていることがわかった。しかし、水和サンプルの利点は、動物が定量的および形態学的アーティファクトの両方につながる可能性のある化学的および機械的暴露が少なくて済むということです。これはまた、CPDよりも繊細な組織を保存する傾向があります。しかし、水和サンプルは貯蔵寿命がはるかに短く、組織の劣化と画質の低下がその時点で明らかになるため、固定後1ヶ月で画像化する必要があります。また、X線はプラスチックピペットチップと周囲の液体(水または緩衝液)の両方を貫通しなければならないので、水和サンプルの分解能は、重要な点乾燥サンプルよりもわずかに少なくなります。クリティカルポイント乾燥サンプルは、特にグリエールに保管する場合、はるかに長い期間保存することができます。また、翼や脚を昆虫ピンに接着してステージチャックに入れるだけで、X線ビームパスに直接配置できるため、取り付けプロセスが簡素化されます。しかし、これらのサンプルの広範なエタノール脱水は、組織の収縮および繊細な組織アーキテクチャの損失につながる可能性があり、これらの効果を最小限に抑えるためにEtOH濃度を増加させる範囲を実行することが重要である。それにもかかわらず、パラホルムアルデヒド固定およびヨウ素染色を含むあらゆる形態の化学的処理が組織収縮58,59を引き起こす可能性があることを留意すべきである。どちらの方法も生きているハエの「実際の器官サイズ」の測定を提供しませんが、固定、染色、乾燥のステップが両方のサンプルセットで同じように行われている限り、突然変異型動物と野生動物型動物を比較する場合、モルフォメトリック測定は有効です。
結論として、μ-CTはショウジョウバエ33、34、35、36、37、38、39、40、41のための有用な全体の動物イメージングツールを提供する。他の多くの研究は、ハエ1、28、30、31、32、55、56、57の将来の研究を知らせるのに役立つ昆虫分類、生態学、生理学、開発、解剖学の様々な側面を理解するために、この技術の力を示しています.この生物で既に広く使用されている遺伝および光顕微鏡ツールと組み合わせることで、μ-CTは、遺伝子型と表現型の間のより深い理解を可能にする実験パイプライン内に位置付けることができます。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナセル・ルサンの支援がなければ、これは不可能でした。H・ダグ・モリス、ダニエル・ドナヒュー、NIHマウスイメージング施設のブレンダ・クランバーグ、マイクロフォトニクスのベン・アッシュに、トレーニングと有益な議論に感謝したいと思います。私はまた、Xradia 520 Versaで腹部サンプルをスキャンしてくれたマンソレ・ノロウジ・ラッド・オブ・ツァイスに感謝します。ローレン・スミス、サマンサ・スミス、レイチェル・ンもスキャンを手伝った。オブジェクトリサーチシステムのマイクマーシュは、トンボの技術サポートを提供しました。また、国立心臓・肺・血液研究所(1K2HL137902-01)とワイオミング大学のスタートアップ・ファンドの支援にも感謝しています。私はまた、彼らの役に立つ提案やコメントのために匿名のレビュー担当者に感謝します。
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
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