הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית
Summary
פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.
Abstract
כלי הדמיה ביו-רפואיים מאפשרים חקירה של מנגנונים מולקולריים על פני קשקשים מרחביים, גנים ועד אורגניזמים. Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל מאופיין היטב, נהנה משימוש במיקרוסקופיה אור ואלקטרון כדי להבין את תפקוד הגנים ברמה של תאים ורקמות. היישום של פלטפורמות הדמיה המאפשרות הבנה של תפקוד הגנים ברמה של האורגניזם השלם כולו ישפר עוד יותר את הידע שלנו על מנגנונים גנטיים. כאן מוצגת שיטת הדמיה מלאה של בעלי חיים המתארת את השלבים הדרושים כדי לדמיין את Drosophila בכל שלב התפתחותי באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μ-CT). היתרונות של μ-CT כוללים מכשור זמין מסחרית וזמן מעשי מינימלי כדי לייצר מידע תלת-ממדי מדויק ברזולוציה ברמת מיקרון ללא צורך בשיטות ניתוח רקמות או ניקוי. בשילוב עם תוכנה המאיצה ניתוח תמונה ועיבוד תלת-ממדי, ניתן לבצע ניתוח מורפומטרי מפורט של כל מערכת רקמות או איברים כדי להבין טוב יותר מנגנוני פיתוח, פיזיולוגיה ואנטומיה הן למחקרי בדיקה תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה. על ידי שימוש בתהליך הדמיה המשלבת שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה ו- μ-CT, ניתן לבצע הערכה יסודית של תפקוד הגנים, ובכך לקדם את התועלת של אורגניזם מודל רב עוצמה זה.
Introduction
שיטות הדמיה המאפשרות חקירה מפורטת של מבנים פנימיים של אובייקט מבלי להרוס את הארכיטקטורה התת-ממדית הכוללת שלו הוכיחו את עצמם כמועילות באופן נרחב למספר דיסציפלינות שונות, כולל פיזיקה, הנדסה, מדע החומרים, ארכיאולוגיה, פליאונטולוגיה, גיאולוגיה וביולוגיה1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בין שיטות הדמיה לא הרסניות אלה, פלטפורמות מבוססות רנטגן שימושיות במיוחד בשל היכולת של צילומי רנטגן באנרגיה גבוהה לחדור סוגים וחומרים שונים רבים עם פיזור מינימלי בהשוואה לגלי אור נראים. טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (μ-CT), טומוגרפיה ננו-ממוחשבת (ננו-CT) ומיקרוטומוגרפיה של סינכרוטרון התגלו, אם כן, כטכנולוגיות העיקריות להדמיה מבוססת קרני רנטגן של דגימות הנעות בין מטרים למיקרונים, עם יכולות רזולוציה מילימטריות עד תת-מיקרון10,11,12,13,14.
בעוד פלטפורמות אלה שונות בעיצובן, בגיאומטריית קרני הרנטגן וברכיבים שלהן כדי לאזן בין גודל דגימה לרזולוציה, כולן מסתמכות על אותו עיקרון בסיסי ללכידת תמונה: מקור לצילומי רנטגן העוברים דרך האובייקט ונלכדים על ידי גלאי. חיכוך דיפרנציאלי של קרן הרנטגן כשהיא עוברת דרך דחיסויות שונות בתוך האובייקט יוצרת ניגודיות תמונה. נתונים תלת-ממדיים מתקבלים על ידי סיבוב המדגם או הגלאי, איסוף סדרה של תמונות הקרנה 2D כי הם משוחזרים לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים לתוך טומוגרמה המכילה מידע 3D שהרזולוציה שלהם היא איזוטרופית x, y,z15. עבור סורקי μ-CT רבים המשתמשים בגיאומטריית רנטגן של קרן חרוט כדי להקרין צילומי רנטגן באובייקט שממוצל, אלגוריתם פלדקמפ משמש לשחזור מדויק של האובייקט עם שגיאות מינימליות16.
הרזולוציה של פלטפורמה נתונה נקבעת בעיקר על ידי פרמטרי מערכת כגון גודל קרן הרנטגן (גודל ספוט), גיאומטריית סורק (מרחק מאובייקט למקור רנטגן), גודל הפיקסלים בגלאי ואלגוריתם השחזור המועסק. גורמים נוספים, כגון תנודות סורק, תנודות קרן רנטגן, תנועת מדגם, סוג החומר או כתם כימי המשמש לדמיין את האובייקט יכול גם להשפיע באופן משמעותי על רזולוציה מרחבית תחת condidtions הדמיה בעולם האמיתי15.
עבור יישומים ביו-רפואיים, CT ו- μ-CT מילאו תפקיד מרכזי בקידום הבנתנו מנגנוני אנטומיה, פיזיולוגיה, פיתוח ומחלות, המשמשים ככלי הן לאבחנות המטופלים האנושיים והן כפלטפורמת הדמיה פרה-אקלינית עבור אורגניזמים מודל17,18. לדוגמה, קונסורציום פנוטיפינג הבינלאומי עכבר, שמטרתו לזהות את הפונקציה של כל גן בגנום העכבר, משתמש μ-CT כחלק צינור פנוטיפינגשלהם 19. התוצאות שלהם היו קריטיות להבנת גנים המעורבים בתהליכי התפתחות ומחלות, ובמקביל שימשו אטלס לאנטומיה ופיתוח שלעכברים 20. אורגניזמים מודל אחרים, כגון דגי זברה וחולדות, אימצו גם את השימוש μ-CT לביצוע פנוטיפינג של בעלי חיים שלמים של מספר מוטציותגנים 17,21,22,23.
היתרון של שילוב הדמיה של בעלי חיים שלמים עם אורגניזמים לדוגמה הוא שניתן לחקור באופן מלא הבנה מכנית של תפקוד הגנים לתהליך ביולוגי נתון. זה אפשרי בגלל הגנומים המאופיינים היטב וכלים גנטיים רבים הזמינים באורגניזמים מודל המאפשרים מניפולציה מדויקת של תפקוד הגנים בנקודות זמן התפתחותיות ברורות, רקמות ספציפיות, תאים בודדים, ואפילו אברונים תת-תאיים. אלה כוללים מערכות ביטוי בינאריות כגון מערכת UAS /GAL4 (ונגזרותיה הרבות), CRISPR/Cas9 ו- RNAi24,25,26. כאשר כלים גנטיים אלה משמשים בשילוב עם צינור הדמיה רב עוצמה המורכב ממיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה (פלואורסצנטית ולא פלואורסצנטית), והדמיה של בעלי חיים שלמים כגון μ-CT, הערכה יסודית של מולקולות, תאים, רקמות, איברים והאורגניזם כולו ניתן להשיג, המאפשר הבנה עמוקה הרבה יותר של תפקוד הגנים.
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש μ-CT באורגניזם המודל הלא יונקי Drosophila melanogaster, שכליו הגנטיים הרבים עזרו להדגיש מנגנונים מולקולריים רבים26,27. הוא אומץ מפרוטוקולים קודמים בחרקים שאינם מודל1,28,29,30,31,32, ובונה ממחקרים קודמים μ-CT בדרוסופילים כדי לקבוע פרוטוקול סטנדרטי לשימושו בחיה זו 33 ,34,35,36,37,38,39 ,40,41. השלבים להכנה מוצלחת של מדגם, הדמיה וניתוח של ערכות נתונים fly μ-CT באמצעות סורקים זמינים מסחרית מפורטים. עם פרוטוקול זה, ניתן לדמיין את כל השלבים ההתפתחותיים של הזבוב ברזולוציה גבוהה הן עבור מחקרים תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה, כולל טקסונומיה, אנטומיה, פיתוח, פיזיולוגיה ומחלה27. פרוטוקול זה יהיה שימושי גם להדמיה כמעט כל חרק ואפילו חומרים שאינם חיים הדורשים כתמים כימיים עבור ניגודיות תמונה כדי לשפר את ההדמיה על ידי μ-CT.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיית Drosophila melanogaster שלם בכל השלבים ההתפתחותיים נותרה אתגר, בעיקר בשל חוסר תאימות של מיקרוסקופיה אור עם עבה, פיגמנט חותך נמצא בחיה זו. בעוד שיטות הדמיה של בעלי חיים שלמים אחרות, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) ו ultramicroscopy בשילוב עם ניקוי רקמות שימשו בהצלחה זבובים50,51,52,53,54, μ-CT מציג מספר יתרונות שהופכים אותו אידיאלי עבור הדמיה חיה שלמה של אורגניזם זה13,15,30 . צילומי רנטגן חודרים בקלות את החתך הפיגמנטי ואורך הגל הקטן שלהם מאפשר הדמיה תת-מיקרונית. תיוג דורש השקעה מינימלית בכימיקלים זמינים נרחבים וללא כישורי ספסל מיוחדים13. סורקי μ-CT זמינים גם הם מסחרית, והעלויות דומות לפלטפורמות מיקרוסקופיות קלות, ובמקביל אטרקטיביות יותר למגוון רחב יותר של דיסציפלינות (גיאולוגיה, פליאונטולוגיה, הנדסה וכו ‘) שיכולות גם ליהנות לזמינותה במוסד. ניתן להשתמש במקורות רנטגן סינכרוטרון גם להדמיית μ-CT ברזולוציה גבוהה של חרקים קבועים וחיים31,55,56, אך הם נגישים פחות מסורקים מסחריים.
פרוטוקול זה מספק דרך יעילה להשיג תמונות μ-CT של מבוגרים מעופפים, גלמים, זחלים ועוברים תאיים. שים לב כי עבור רבים מהצעדים המתוארים לעיל, ניתן להחיל שיטות חלופיות גם כדי להכין דוגמאות להדמיה. מחקרים אחרים סיפקו השוואה מפורטת של של שלבי קיבעון, תיוג וייבוש שונים לשימוש בחרקים ואלה המעוניינים לאמץ טכניקה זו מוזמניםלהעריךאת היתרונות של כל גישה 1,4,13,29,30,57. בעוד פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, כמה הצעות מועילות מוצגות.
ראשית, יש לנקוט זהירות בעת שיבוש חתך של דגימות שלמות, כך שבבית רקמות רכות אינן משובשות באופן משמעותי. חשוב לתת לשלבי זחלים ופופאלים מוקדמים לעבור קיבעון במשך שעתיים בפתרון של בוין לפני לחטט. זה יקשיח את הרקמה ויגביל את כמות המולימפ כי יהיה למטלג מתוך חורי נקב, אשר יכול לשנות את ארכיטקטורת האיברים. מקטעי גוף בודדים (ראש, בית חזה ובטן) של המבוגר ניתן להפריד אם המבנה של עניין ממוקמים שם. מומלץ להשתמש באזמל כדי לחתוך בצורה נקייה את המקטעים האלה במקום להפריד אותם עם מלקחיים, אשר יכול לשבש את הארכיטקטורה 3D של המעיים או מערכת העצבים המרכזית, למשל. באשר לתזמון, מבוגרים בדרך כלל צריכים רק 16 שעות. עבור קיבוע מלא, בעוד שלבים זחל וגופל צריך 24 שעות. כמו כן, אם כתמי יוד או PTA נראה לא אחיד, המדגם יכול להיות ממוקם בחזרה בתמיסה לדגור זמן רב יותר עד אפילו כתמים מושגת. לבסוף, דגימות hydrated לא צריך להיות ממוקם ב 4 °C (50 °F), כמו זה נראה לגרום להיווצרות של בועות אוויר בתוך חלל הגוף לאחר התחממות לטמפרטורת החדר.
שנית, הרכבה מדגם ישתנה לפי מכשיר, סוג שלב והאם המדגם צריך להישאר hydrated או כבר נקודה קריטית מיובשת. אם hydrated, להבטיח את המדגם לא לדלוף ואולי להרוס את הסורק. בעת הרכבת הדגימה בתוך קצה פיפטה, הקפידו לדחוף בעדינות עם חפץ קהה עד שהדגימות נתקלות בהתנגדות קלה ולא יכולות לזוז. לחיצה קשה מדי עלולה להוביל לעיוות בקצרה ולפגמים מבניים. כמו כן, ודא כי המדגם מיושר במחזיק קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. כל תנודה תגדיל את זמני הסריקה בשל שדה הראייה הגדול יותר ותפחית את הרזולוציה של טומוגרמה הסופית לאחר השחזור.
שלישית, הגדרות הסורק לרכישת תמונות הקרנה ישתנו גם הן לפי מכשיר. כדי למקסם את יכולות הרזולוציה של הסורק, גודל ספוט קרן הרנטגן צריך להיות קטן ככל האפשר (5-10 מיקרומטר). ניתן להשיג זאת על ידי איזון מתח רנטגן והגדרות זרם, כך שההספק הכולל הוא 3-4 W. עם הגדרות אלה וזמן החשיפה המתאים במצלמה, ניתן להשיג חיווי נכון של קרן הרנטגן על ידי הדגימה וניגודיות תמונה אופטימלית. השימוש במסנני אלומיניום או נחושת בין האובייקט למקור הרנטגן יכול לשמש לכוונון הגדרות אנרגיית הרנטגן האופטימליות לניגודיות התמונה הטובה ביותר או להחלשת הקרן מספיק כדי להשתמש במקורות בעלי עוצמה גבוהה יותר. באשר לרזולוציית התמונה, הדבר יהיה תלוי במשתנים רבים ושונים, כולל סוג כתם, מספר תמונות הקרנה, גודל פיקסל תמונה, מיקום המצלמה, תנועת הדגימה, תנודות הסורק ופרמטרים של שחזור. פנטום תבנית סרגל (QRM GmbH) המכיל סמני גודל ידועים יכול לסייע בהערכת רזולוציה מרחבית עבור הגדרת סורק ומצלמה נתונה.
כדאי גם להעריך את היתרונות של הדמיה נקודה קריטית מיובש או hydrated דגימות. Sombke ואח ‘ ביצע הערכה השוואתית של שתי השיטות ומצא ייבוש נקודה קריטית להיות מעולה עבור יישומי μ-CT מעורבים פרוקי רגליים30. עם זאת, היתרונות של דגימות hydrated הם כי בעלי חיים חשופים פחות חשיפה כימית ומכאנית שיכול להוביל הן כמותי ומורפולוגית. זה גם נוטה לשמר רקמות עדינות טוב יותר מאשר CPD. עם זאת, דגימות hydrated יש חיי מדף קצרים בהרבה צריך להיות התמונה לא יאוחר מחודש לאחר קיבעון מאז השפלת רקמות ואיכות תמונה מופחתת הופך ברור בשלב זה. כמו כן, הרזולוציה של דגימות hydrated יהיה קצת פחות מדגם מיובש נקודה קריטית, כי צילומי רנטגן חייבים לחדור גם דרך קצה פיפטה פלסטיק ואת הנוזל שמסביב (מים או חוצץ). דגימות מיובשות נקודה קריטית ניתן לשמר במשך פרקי זמן ארוכים בהרבה, במיוחד כאשר נשמר על Drierite. הם גם יכולים להיות ממוקמים ישירות בנתיב קרן הרנטגן פשוט על ידי הדבקת הכנפיים או הרגליים סיכת חרקים והצבתו על צ’אק הבמה, פישוט תהליך ההרכבה. עם זאת, התייבשות האתנול הנרחבת של דגימות אלה יכולה להוביל להתכווצות רקמות ואובדן ארכיטקטורת רקמות עדינה, ולכן חשוב לבצע מגוון של ריכוזי EtOH גוברים כדי למזער את ההשפעות האלה. עם זאת, יש לציין כי כל צורות הטיפול הכימי, כולל קיבעון paraformaldehyde ואפילו כתמי יוד יכול לגרום התכווצותרקמות 58,59. אף על פי שאף אחת מהשיטות לא תספק מדידות של ‘גודל איברים בפועל’ בזבוב חי, מדידות מורפוטיות עדיין תקפות בעת השוואת בעלי חיים מוטנטיים וטיפוסי בר כל עוד שלבי הקיבעון, הכתמים והייבוש מתבצעים באופן זהה עבור שתי קבוצות הדגימות – רצוי במקביל.
לסיכום, μ-CT מספק כלי הדמיה בעל חיים שלם שימושי עבור Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. מחקרים רבים אחרים הציגו את כוחה של טכנולוגיה זו להבנת היבטים שונים של טקסונומיה חרקים, אקולוגיה, פיזיולוגיה, פיתוח ואנטומיה שיכולים לעזור ליידע מחקרים עתידיים זבובים1,28,30,31,32,55,56,57 . בשילוב עם כלי מיקרוסקופיה גנטית ואור כבר בשימוש נרחב באורגניזם זה, μ-CT יכול למקם את עצמו בתוך צינור ניסיוני המאפשר הבנה עמוקה יותר בין גנוטיפ פנוטיפ.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל זה לא היה אפשרי ללא תמיכתו של נאצר רוסאן. אני רוצה להודות לדאג מוריס, דניאל דונהיו וברנדה קלונברג ממתקן הדמיית העכברים של NIH ובן אצ’ה ממיקרו פוטוניקס על האימונים והדיון המועיל. אני גם מודה למנסורה נורוזי ראד מזאייס על סריקת דגימות בטן בקסרדיה 520 ורסה. גם לורן סמית’, סמנתה סמית ורייצ’ל אנג עזרו בסריקה. מייק מארש ממערכות מחקר אובייקטים סיפק תמיכה טכנית שפירית. אני גם אסיר תודה על התמיכה של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (1K22HL137902-01) וקרנות סטארט אפ מאוניברסיטת ויומינג. אני גם מודה לסוקרים האנונימיים על ההצעות וההערות המועילות שלהם.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
Referenzen
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
- Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
- Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
- Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
- Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
- Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
- Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
- Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
- Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
- Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
- Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
- Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
- Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
- Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
- Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
- Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
- Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
- Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetik. 201 (3), 815-842 (2015).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
- Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
- Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
- Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
- Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
- Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
- Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
- Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
- Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
- Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
- Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
- Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
- Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
- Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
- Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
