使用微计算断层扫描的 果蝇黑色素加斯特 全动物成像

1. 样品选择和甲骨文制备 选择适当的发育时间点（胚胎、幼虫、幼崽或成人）进行成像。 对于胚胎阶段，葡萄汁阿加板上的笼雌性涂上酵母膏，每30-60分钟收集一次卵子。让这些胚胎在25°C下发育，直到达到适当的阶段。 对于幼虫阶段，从时间胚胎采集实验中收集第一和第二星。在非拥挤条件下，直接从食物小瓶的一侧挑选游荡的第三 星。 对于幼虫的计时，收集白色预吐物（倒置螺旋骨），并记录角质层开始变棕色的时间。动物将在甲骨文变黄后，在规定的时间点进行15个阶段的幼崽发育，并可以相应地收集42个。 在闭合后收集成人作为处女，并允许在食物小瓶中老化一定的时间（例如，5 天完全肠道发育）。 将 5-50 只动物转移到 1.5 mL 微中心管中，该管内含 1 mL 0.5% 的 Triton X-100，含 1x 磷酸盐缓冲盐水（0.5% PBST）。在台面上定期敲击管子时，在室温下孵育5分钟（RT），以帮助去除疏水涂层，使动物完全被淹没。 对于胚胎、幼虫和幼崽阶段，将管子放置在 20 年代设置为 100 °C 的热块中，然后在 RT 冷却 5 分钟，从而阻止进一步发育。注：动物也可以在液氮37中闪冻。 2. 固定和染色 去除 0.5% PBST 并添加 1 mL 的 Bouin 解决方案。水龙头管，以确保动物完全淹没。警告：布恩的解决方案含有甲醛。如果溢出，可能会对皮肤和眼睛造成急性毒性，如果吞咽，可能会致命。处理时戴手套、安全眼镜和实验室外套。注意：还可以使用其他固定技术，例如使用乙醇。其他固定剂的优点在参考1，30中详细描述。 对于胚胎和成人样本，在 RT 的台面上孵育 16-20 小时。 对于幼虫和幼虫样本， 在 Rt. 丢弃 Bouin 的溶液时将动物固定 2 小时， 用 1x Pbs 洗 5 分钟三次。转移到包含 1x PBS 的多孔解剖盘中，并使用连接到支架上的一个小细枝末节针戳前肢和后角质层中的一个孔，小心不要破坏任何底层软组织。 将幼虫和幼虫样品移回微灌注管，并加入 1 mL 的新鲜 Bouin 溶液。在 Rt 的台面上孵育 24 小时。 取出 Bouin 的解决方案，用 1 mL 的μ CT 洗涤缓冲器（0.1 M Na2HPO4，1.8% 蔗糖）或 1x PBS 三次清洗样品 30 分钟。 加入1 mL的适当染色溶液，在台面上孵育2-7天。注：污渍选择将取决于许多因素，但通常是渗透、孵化时间和分辨率之间的平衡。一般来说，磷磷酸 （PTA） 提供软组织的优越对比度和分辨率，但需要角质层的机械破坏和更长的孵化时间。不同污渍类型的优点在参考1中详细描述。 对于碘污渍，请使用 1 mL 的 0.1 N I2KI（卢戈尔溶液）。孵化2天。成人甲骨文无需进一步中断。 对于磷酸 （PTA） 染色，请使用 0.5% （w/v） 溶液中的 1 mL 稀释在水中。通过取出口腔部分或在胸腔或腹部角质层上戳孔，将小细枝末节固定在支架上，从而扰乱成人角质层。如果组织染色出现非同质性，则孵育5-7天或更长时间。 用 1 mL 超纯水或 1x PBS 清洗 30 分钟。重复洗涤步骤。将动物存放在 RT 的超纯水中或 1x PBS 中长达一个月。 如果动物在水合时要进行扫描，请直接进入第 4 节。如果需要更长的样品保存时间，则继续执行协议第 3 节。 3. 临界点干燥（可选） 对样品执行乙醇 （EtOH） 脱水系列：10%、25%、50%、75%、100%、100%。添加 1 mL 的 EtOH 溶液，并在台面上孵育 1 小时，以达到所述顺序中的每浓度。 最后 100% EtOH 浸泡后，用新鲜的 100% EtOH 代替，让样品在台面上孵育过夜。 按照制造商的指示对样品进行临界点干燥。注：电子显微镜设备通常有一个临界点干燥机（见 材料表），将在EtOH脱水后对样品进行干燥。 4. 样品安装 对于关键点干燥的样品，热胶样品到昆虫针或其他支架设计，以适应旋转阶段的夹头或将其放置在塑料或玻璃毛细管（+1.0-1.25毫米内径）。 对于水合样品，将 P10 移液器尖端装满水，并通过热密封或石蜡薄膜固定狭窄端，以防止泄漏。注意：请务必将任何连接紧密包裹，以免水泄漏到扫描仪中并造成损坏。 使用钳子将单个标本转移到移液器尖端。使用长而细长的物体，如沉闷的20G针或其他移液器尖端，小心地将标本向下推，直到它接触管道尖的墙壁，将其保持到位。 用石蜡薄膜盖住移液器尖端的开口，以防止长时间扫描时水蒸发。 使用支架安装P10移液器，设计用于安装在旋转舞台的夹头内（图1A-C）。 5. 扫描 在当天成像之前对机器进行任何必要的校准。注：这些将因制造商而异，建议咨询应用专家以确定适当的步骤。有关本协议中使用的设置和软件的具体信息，请参阅 材料表 。通常，校准（如舞台轴对齐）以消除与夹头相对于旋转阶段的离轴相关的任何”摆动”，并执行平场校正，以确保相机上均匀的背景像素强度，为跨多个扫描中可比的最佳分辨率和数据集提供最佳成像条件。 通过单击软件左上角的”打开门”图标，打开扫描仪门，进入旋转舞台夹头。通过拧紧样品支架底部周围的衣领来连接样品。注意：将样品连接到旋转夹头时，使用轻柔的压力来保持扫描仪的对齐。 在控制扫描仪的软件中设置扫描参数，以获得最佳分辨率和对比度。注：这些需要经验确定，因为每个扫描仪的 X 射线源、相机/探测器和几何形状因制造商而异。选择最佳参数的其他信息也可在此处找到43，以及制造商的应用专家。 打开 X 射线源电源控制 （选项|X射线源）。使用滑块条将 X 射线电压设置为 30-40 kV，电流设置为 100-110 μA，以产生具有 3-4W 功率和小点尺寸的 X 射线束，以增强分辨率。 使用获取模式对话（选项|采集模式） 将相机曝光时间设置为 500-800 ms。 使用位于软件底部放大镜图标旁边的滑块条，根据相机设置和位置设置所需的图像像素大小（+700 nm 至 4 μm）。这将确定扫描期间获得的投影图像数量，通过更多的投影，可增强分辨率，但扫描时间更长（见 代表结果）。 单击并拖动位于软件底部旋转箭头旁边的滑块条，以沿其 360° 旋转路径移动示例。确保样品保持在视野内。 单击软件顶部的”开始获取”图标（蓝色圆箭头图标）。对话框显示允许设置额外的扫描参数，以及保存扫描的文件和输出文件夹以命名。 将随机运动设置为 10，平均 4-6 帧。根据使用的摄像机设置自动计算旋转步骤。 通过单击”获取对话框”上的”确定”开始扫描。显示扫描时间的第二个进度条对话。扫描仪现在将沿旋转路径获取一系列标本的投影图像（图1D），无需进行监控。 6. 重建 要生成图光，使用投影图像执行图像重建。注：虽然几乎所有来自圆锥束几何扫描仪的图像重建都依赖于Feldkamp算法16，但各个参数会因软件实现而异，应根据经验来确定。以下设置，具体用于商业可用的软件（参见材料表），可用作指南。参数，如错位补偿、环形器件还原和光束硬化校正（大多数飞行样品为 0%）以迭代方式执行，以选择最终重建的最佳值。对于希望对重建过程进行更多控制的高级用户，请参阅 MATLAB 界面44。 使用基于参考扫描45 的换档校正算法（操作|，执行初始图像对齐X/Y 与参考扫描对齐）。 微调每个重建参数（开始|微调）。 这将激活”参数微调”对话框。 通过单击”下一步”到”调整后对齐”来微调对齐。将迭代数设置为 5，将参数步骤设置为 1.0。单击”开始”按钮以生成一系列预览。选择正确对齐的图像。注：如果出现连续结构（如比质层），则正确对齐的图像不会模糊或显示”剪切”工件。 点击它旁边，微调环子工件的减少。将迭代数设置为 5，将参数步骤设置为 1.0。单击 “开始” 按钮以生成一系列预览。选择包含最少环数的图像。 优化上述参数以提供最佳图像后，确保选定的值在”设置”选项卡（”设置”）中正确表示。 使用直方图调整任何最终亮度和对比值，文件参数（如位深度和类型），并利用仅包含兴趣结构（例如仅限整个苍蝇或头部）的兴趣区域 （ROI） 来减少计算时间 （输出）。 开始重建（开始|开始）。 如果需要多次重建，将当前图像添加到批次管理器（开始|添加到批次） 和重复步骤 6.2-6.5 的剩余图像。 7. 图像分析 可视化两个和三个维度的影像，并利用免费软件或商业软件进行进一步的形态分析。注：本协议中使用的软件的详细信息可在材料表中找到。其他能够评估μ CT 数据集的软件包包括免费软件选项，如 FIJI 46、Seg3D（www.seg3D.org）47 和 ITK-SNAP48，以及商业软件（例如 AMIRA）。其他应用使用基于机器学习的算法来半自动化细分过程，可以帮助加快工作流程并减少人为偏见（例如 Biomedisa49）。 将图单文件导入软件（文件|导入图像文件） 。与文件相关的元数据应自动加载到窗口中，但也可以手动设置以匹配图像属性。 要分割兴趣结构，请单击屏幕左侧的细分选项卡。创建新的兴趣区域 （ROI） （基本|新），给它一个名字，并选择一个合适的颜色。 定义包含兴趣结构的阈值范围（范围| 使用滑块条定义范围） 。 选择合适的 2D 或 3D ROI 画家工具模式（ROI 画家|画笔选项）。 绘制阈值定义的区域;按住 Ctrl 键，同时按住左鼠标键。要移除区域，请按住 移位 键，同时按住左鼠标键。注：要更改圆形或方形画笔的大小，只需滚动鼠标轮，同时握住 Ctrl 或 Shift 键。 在整个 Z 卷中继续绘制兴趣结构。 将投资回报率转换为网格（出口|到网状|正常）。 在右上角 的数据属性 和 设置 面板中单击网格覆盖物，突出显示网格覆盖。 使用适当数量的迭代（平滑网格|迭代）。注：对于要比较的所有图像，使用相同的网格平滑迭代值。 确保网状 ROI（表面积、 体积 和 费雷特直径）的测量显示在屏幕右侧 的信息 面板中，以便进行基本形态分析。其他分析可以使用 对象分析模块执行。 渲染网状物体和整个图像，并可视化为 3D。使用内置电影制作人生成对象的视频（右鼠标单击|显示电影制作人） 使用观众的单独帧（添加键）。注：还可以通过右侧面板中的视觉效果选项卡对电影应用多种视觉增强功能，以突出某些功能等。 使用电影制作人中的 “出口动画 “按钮导出视频观看。