Análisis de sistemas de la respuesta neuroinflamatoria y hemodinámica a la lesión cerebral traumática

Visión general
Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBIs) afectan a ~ 1.6-3.8 millones de atletas anualmente¹. Estas lesiones, incluidas las lesiones subconmocionales y conmociones cerebrales, pueden dejar a los pacientes con síntomas físicos, emocionales, psicológicos y cognitivos transitorios². Además, el mTBI repetitivo (rmTBI) sostenido dentro de una “ventana de vulnerabilidad” puede conducir a una gravedad acumulativa y a la duración de las consecuencias cognitivas que duran más que los efectos de un solo mTBI solo³ y, en última instancia, incluso a la pérdida permanente de la función ^4,5,6. Aunque muchos pacientes se recuperan en un período de tiempo relativamente corto ( 1 mes, y algunos duran hasta 1 año 3,7,8,9. A pesar de la alta prevalencia y las consecuencias duraderas de estas lesiones, los mecanismos de lesión son poco conocidos y no existen estrategias de tratamiento efectivas.

Dada la alta variabilidad en los resultados después de mTBI / rmTBI, un desafío en la identificación de desencadenantes moleculares en etapa temprana del tejido obtenido en estudios terminales de mTBI / rmTBI es la falta de datos longitudinales que demuestren “enlaces moleculares agudos” definitivos de estos desencadenantes moleculares a resultados a más largo plazo. Para superar este desafío, nuestro grupo ha descubierto que la reducción aguda del flujo sanguíneo cerebral medida agudamente utilizando una herramienta óptica llamada espectroscopia de correlación difusa (DCS), se correlaciona fuertemente con el resultado cognitivo a largo plazo en un modelo de ratón de rmTBI¹⁰. Usando este biomarcador hemodinámico, demostramos que los ratones con flujo sanguíneo cerebral agudamente bajo (y, por extensión, peor resultado predicho a largo plazo) tienen aumentos agudos concomitantes en la fosfo-señalización neuronal dentro de las vías MAPK y NFκB, aumentos en la expresión neuronal de citoquinas proinflamatorias y aumentos en la expresión del marcador fagocito/microglial Iba1¹¹ . Estos datos sugieren un posible papel para la fosfo-señalización neuronal, la expresión de citoquinas y la activación microglial tanto en la regulación aguda del flujo sanguíneo cerebral después de la lesión, así como en el desencadenamiento de una cascada de señalización que conduce a la disfunción neuronal y un peor resultado cognitivo. A continuación, detallamos nuestro enfoque para sondear simultáneamente el entorno hemodinámico y neuroinflamatorio después de rmTBI y cómo integrar estos conjuntos de datos complejos. Específicamente, describimos los procedimientos para cuatro pasos clave para este enfoque integral: (1) un modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve, (2) evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa, (3) cuantificación del entorno neuroinflamatorio y (4) integración de datos (Figura 1). A continuación, proporcionamos una breve introducción a cada uno de estos pasos clave para ayudar a guiar a los lectores a través de la lógica detrás de nuestros métodos. El resto del manuscrito proporciona un protocolo detallado para cada uno de estos pasos clave.

Modelo de caída de peso de lesión cerebral traumática leve
Aunque existen muchos modelos preclínicos excelentes de LCT leve repetitiva 12,13,14,15,16,17,18, empleamos un modelo de lesión craneal cerrada por caída de peso bien establecido y clínicamente relevante. Las características clave de este modelo incluyen (1) impacto contundente del cráneo / cuero cabelludo intacto seguido de una rotación sin restricciones de la cabeza alrededor del cuello, (2) ninguna lesión cerebral estructural manifiesta, edema, daño de la barrera hematoencefálica, muerte celular aguda o pérdida crónica de tejido cerebral, y (3) déficits cognitivos persistentes (hasta 1 año) que surgen solo después de múltiples golpes¹⁹ (Figura 2)..

Evaluación del flujo sanguíneo cerebral con espectroscopia de correlación difusa
La espectroscopia de correlación difusa (EDC) es una técnica óptica no invasiva que mide el flujo sanguíneo ^5,20,21. En DCS, se coloca una fuente de luz infrarroja cercana en la superficie del tejido. Se coloca un detector a una distancia fija de la fuente en la superficie del tejido para detectar la luz que se ha multiplicado dispersa a través del tejido (Figura 3). La dispersión de los glóbulos rojos en movimiento hace que la intensidad de la luz detectada fluctúe con el tiempo. Se utiliza un modelo analítico simple conocido como teoría de difusión de correlación para relacionar estas fluctuaciones de intensidad con un índice de flujo sanguíneo (CBF_i, Figura 4). Aunque las unidades de CBF_i (cm²/s) no son las unidades tradicionales de flujo (mL/min/100 g), un estudio previo en ratones ha demostrado que CBF_i se correlaciona fuertemente con el flujo sanguíneo cerebral medido por espín arterial marcado como MRI²¹.

Como referencia, el instrumento DCS utilizado aquí se construyó internamente y se compone de un láser de longitud de coherencia de 852 nm de largo, una matriz de fotodiodos de avalancha de conteo de fotones y una placa autocorreladora de hardware (tau único, 8 canales, tiempo de muestra mínimo de 100 ns)^21,22. Los datos se adquieren con software casero escrito en LabView. La interfaz animal para el dispositivo consiste en una fibra de fuente multimodo de 400 μm (rango de longitud de onda de 400-2200 nm, núcleo de sílice puro, revestimiento duro TECS) y una fibra detectora monomodo de 780 nm (rango de longitud de onda de 780-970 nm, núcleo de sílice pura, revestimiento duro TECS, corte de modo segundo de 730 ± 30 nm) espaciada a 6 mm de distancia e incrustada en un sensor impreso en 3D negro (4 mm x 8 mm, Figura 3).

Cuantificación del entorno neuroinflamatorio
Aunque la neuroinflamación está regulada por diversos procesos celulares, dos mecanismos clave relevantes son la señalización extracelular por citoquinas / quimiocinas y la señalización intracelular por fosfoproteínas. Para investigar el entorno neuroinflamatorio del cerebro después de la lesión, los cerebros se extraen de ratones, se microdisectan, y las citoquinas / quimiocinas y fosfoproteínas se cuantifican utilizando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Los inmunoensayos multiplexados de Luminex permiten la cuantificación simultánea de una colección diversa de estas proteínas mediante el acoplamiento de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) a perlas magnéticas marcadas fluorescentemente. Se utilizan distintas etiquetas fluorescentes para cada proteína de interés, y las perlas de cada etiqueta se funcionalizan con un anticuerpo de captura contra esa proteína en particular. Cientos de cuentas para capturar cada proteína se mezclan, se colocan en una placa de 96 pocillos y se incuban con la muestra. Después de la incubación de la muestra, se utiliza un imán para atrapar las cuentas en el pozo mientras se lava la muestra. A continuación, el anticuerpo de detección biotinilado se une al analito de interés para formar un sándwich anticuerpo-antígeno similar a un ELISA tradicional, pero con el ELISA para cada proteína que ocurre en una cuenta diferente marcada fluorescentemente. La adición de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SAPE) completa cada reacción. El instrumento Luminex luego lee las cuentas y separa la señal de acuerdo con cada etiqueta fluorescente / proteína.

Integración de datos
Debido a la gran cantidad de analitos (por ejemplo, citoquinas) medidos en el ensayo Luminex, el análisis de datos puede ser difícil de interpretar si cada proteína cuantificada se analiza individualmente. Para simplificar el análisis y capturar las tendencias observadas entre los analitos, utilizamos un método de análisis multivariante llamado regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR, Figura 8)²³. PLSR funciona identificando un eje de pesos correspondientes a cada proteína medida (es decir, citoquinas o fosfoproteínas, denominadas “variables predictoras”) que juntas explican de manera óptima la covarinancia de las proteínas medidas con una variable de respuesta (por ejemplo, flujo sanguíneo cerebral). Los pesos se conocen como “cargas” y se ensamblan en un vector conocido como variable latente (LV). Al proyectar (denominado “puntuación”) los datos de proteínas medidos en cada uno de los dos LC, los datos se pueden volver a trazar en términos de estos LC. Después de calcular el PLSR, utilizamos una rotación varimax para identificar un nuevo VI que maximiza la covarianza entre las proyecciones de la muestra sobre el VI y la variable^{predictora 24}. Este enfoque nos permite definir LV1 como el eje para el que se explica mejor la varianza de la variable de respuesta. LV2 maximiza la covarinancia entre la variable de respuesta y los datos residuales de LV1, que pueden estar asociados con la variabilidad biológica o técnica entre muestras. Por último, llevamos a cabo una validación cruzada Leave One Out (LOOCV) para garantizar que el modelo PLSR no dependa en gran medida de ninguna muestra²³.

En este protocolo, detallamos los métodos para caracterizar la respuesta del tejido neuroinflamatorio y hemodinámico a mTBI. El flujo de trabajo general se describe en la Figura 1. En este protocolo, los ratones están sujetos a uno o más mTBIs utilizando un modelo de lesión en la cabeza cerrada por caída de peso. El flujo sanguíneo cerebral se mide longitudinalmente antes y en múltiples puntos de tiempo después de la lesión. En el momento del punto de interés para el interrogatorio de los cambios neuroinflamatorios, el animal es sacrificado y se extrae el cerebro. Las regiones cerebrales de interés se aíslan a través de la microdisección y luego se lisan para extraer proteínas. Los lisados se utilizan tanto para los inmunoensayos multiplexados Luminex de citoquinas y expresión de fosfoproteínas como para Western blot. Finalmente, este conjunto de datos holístico se integra utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales.