특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

1. RNA 절연 및 드 노보 전사 조립 지질이 풍부한 조직을 위해 설계된 RNA 격리 키트(재료표참조)를 사용하여 후기 스테이지 3 인스타 다이빙 딱정벌레 애벌레 안구와 성인 딱정벌레로부터 총 RNA 절연을 수행합니다. T. marmoratus에서 총 RNA를 분리하고 이전에 설명된방법(18)에따라 서열한다. 드 노보 전사 어셈블리참고: 전사 드 노보를 조립하려면 다양한 생물정보학 플랫폼을 사용할 수 있습니다(재료표참조). 이러한 플랫폼은 시판되고 있으며 경우에 따라 유닉스 기반 명령줄 스크립트로 존재합니다. 어셈블리는 드 노보이므로 두 플랫폼에서 전사를 독립적으로 조립하고 결과를 비교하여 거짓 긍정 또는 거짓 네거티브를 제외하는 것이 좋습니다. 전사를 조립하기 시작하려면 각 생물 정보학 플랫폼에 원시 판독기를 업로드합니다.참고: 이러한 파일은 일반적으로 압축되며 FASTQSANGER 형식으로 압축됩니다. Gz. 이 형식은 다음 단계에서 허용되기 때문에 파일 압축을 풀 필요가 없습니다. Trimmomatic 명령줄을 사용하여 원시 읽기를 트리밍하여 기본 임계값 미만인 어댑터 시퀀스 또는 짧은 읽기를 제거합니다. 트리밍된 원시 읽기압축을 풀고 있습니다. 이제 파일이 FASTQ 형식으로 표시됩니다. 각 샘플에 대해 FASTQ 원시 판독을 연결하여 드 노보 어셈블리에 사용할 준비가 된 파일을 가져옵니다. 전사 드 노보를 조립할 수 있는 명령줄 스크립트를 사용하여 연결된 원시 읽기 드 노보를 조립합니다. 이제 FASTA 파일로 각 시퀀스와 연속의 목록이있을 것이다 조립 된 전사를 저장합니다. 어셈블리의 커버리지를 높이려면 동일한 종에 대해 여러 전사를 결합하고 조립합니다.참고: 이 과정은 더 정확한 연속을 생성의 기회를 증가하고 낮은 복사 번호 유전자가 관심있는 경우에 특히 중요합니다. 일단 조립되면 커버리지 점수를 계산하여 완전성을 위해 전사를 평가하십시오(커버리지 평가 소프트웨어는 자유롭게 사용할 수 있으며 재료 표참조).참고: 커버리지 점수가 있는 전사체 >75%는 좋은 것으로 간주됩니다. 그러나,이 점수의 관련성은 전사 생성에 대한 이유에 따라 달라집니다. 예를 들어, 전사가 낮은 복사 번호 유전자를 식별하는 데 사용되는 경우, 점수 >85%는 더 큰 커버리지를 의미하기 때문에 더 좋습니다. 기본 로컬 정렬 검색 도구를 사용하여 드 노보 조립 된 전사체에 음장 (BLAST; 재료의 표참조).참고: 이 실험을 위해, 전사는 알려진 Drosophila 단백질의 데이터베이스 및 알려진 딱정벌레 단백질의 데이터베이스에 대하여 주로 부음되었습니다. 주석 목록은 다른 유기체의 단백질과 서열 유사성을 나타내는 스프레드시트 파일 및 연속/연속으로 다운로드할 수 있으며 FASTA 파일로 다운로드할 수 있다. 관심 있는 단백질의 연속 수/숫자를 식별하고 뉴클레오티드 서열을 추출한다. BLAST를 사용하여 단백질 특이적 보존 영역(예: 홈로박스 도메인)이 인가된 뉴클레오티드 서열에 존재하는지 확인합니다. 뉴클레오티드 서열에 대해 동일한 성서가 겹치는 다른 연속체를 확인하여 유전자 특이적 전사체의 서열을 생성한다.참고: 서열 중첩을 가진 연속을 확인하는 것은 일반적으로 낮은 복사 번호 유전자를 위해, 모든 유전자를 위해 가능하지 않습니다. 유전자의 전체 길이 서열이 필요한 경우, cDNA 끝의 3′ 및 5′ 급속 증폭 (RACE19)와같은 기술을 사용하여 전체 성숙한 성적 체형의 뉴클레오티드 서열을 식별하기위한 개시 지점으로 가장 높은 서열 유사성을 가진 연속성으로 시작합니다. 1.2.4-1.2.7 단계에 따라 두 번째 플랫폼에서 얻은 어셈블리에 대해 노트윗합니다.참고: 이상적으로, 결과는 관심있는 단백질에 대해 유사해야 합니다; 그러나 플랫폼 간에 는 범위가 어느 정도 다를 수 있습니다. 조립된 전사체를 사용하여 섹션 2에 설명된 대로 종별 dsRNA를 합성합니다. 2. 복제 및 유전자 특정 dsRNA 합성 참고: 유전자 특이적 복제 및 dsRNA 합성은 T. 카스타뉴움20,,21,,22에대해 자세히 설명되어 왔다. 다음 단계는 간략한 개요입니다. 복제, 세균 변환 및 플라스미드 시퀀싱 유기체로부터 총 RNA를 분리(1.1단계에서 설명한 대로) 역전사 키트를 사용하여 상호 보완적인 DNA(cDNA)를 생성한다(재료표참조). 관심 있는 유전자에 특이적인 연속으로부터 하나 또는 두 개의 100-1000 bp 뉴클레오티드 서열을 식별한다. 전체 규미에 걸친 설계 프라이머 쌍은 전체 규미성드에 걸쳐 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 서열을 증폭시한다. 추가 추가 30 증폭 된 DNA 제품에 adenine 오버행을 만들 끝에 분 단계. PCR 정제 키트를 사용하여 이 제품을 정화하십시오(재료 표참조). 복제 키트와 함께 제공된 공급업체의프로토콜에 따라 정제된 제품을 pCR4-TOPO 플라스미드 벡터(재료 표 참조)로 복제합니다. 열 충격 처리를 사용하여 복제된 플라스미드를 유능한 세균 세포(균주: E.coli DH10B)로 변환하여 유능한 세포(재료 표참조)에 대한 공급업체의 프로토콜에 따라 성공적으로 변형된 세포를 위한 화면을 변형시킵니다.참고: 콜로니가 있는 플레이트는 파라핀 필름으로 싸서 수분을 유지하고 최대 1개월 동안 4°C에 보관할 수 있습니다. 37°C의 셰이커 인큐베이터에서 암피실린(50 μg/mL)을 함유한 리소겐 국물(LB)의 10 μL 파이펫 팁 및 배양물을 사용하여 변형된 세포의 콜로니를 선택하고 24시간 동안 200rpm을 선택한다.참고: 장기 보관을 위해 배양된 세포는 1:1로 희석되고 글리세롤 주식으로 -80°C에서 냉동될 수 있습니다. 미니프레플 격리 키트를 사용하여 이 배양으로부터 관심 있는 유전자를 함유한 플라스미드를 분리한다(재료표참조). 수율을 분광성으로 평가한 후 -20°C에 격리된 플라스미드(minipreps)를 저장합니다. 구체적으로는 260nm, 280nm 및 230nm에서 시료 흡광도를 측정합니다. DNA 정량화에 대한 비율 A260/A280, DNA 순도를 정량화하기 위한 A260/A230을 계산합니다.참고: 1.8의 260/280 비율은 일반적으로 충분히 순수한 DNA로 받아들여지고, 1.5보다 낮은 비율은 페놀과 같은 잔류 추출 시약의 존재를 나타낸다. 260/230 비율은 260/280 비율보다 크거나 같아야 합니다. 비율이 낮을수록 잔류 시약 오염이 있음을 나타냅니다. 수율은 일반적으로 100에서 500 ng/μL 범위입니다. 유전자 특정 단편이 성공적으로 통합되었음을 확인하기 위해 격리 된 미니 프렙을 서열, 플라스미드에서 5′ T7과 3′ T3 프로모터 영역 사이에 측면되고; 이 작업은 범용 T7 및 T3 시퀀싱프라이머(22)를사용하여 수행할 수 있습니다. dsRNA 제제에 대한 유전자 특이적 관심 서열을 사용하여 미니프렙을 사용하십시오. PCR 증폭 및 시험관 내 dsRNA 합성 PCR 증폭 및 제품 정화 삽입된 유전자의 선형 단편을 증폭시키기 위해 5′ 측에 T7 프로모터22 서열을 갖는 플라스미드 특이적 또는 유전자 특이적 프라이머를 설계한다. 각각 20μL의 10회 이상의 반응을 설정하여 수율을 최적화합니다.참고: 결과 제품은 20bp T7 폴리머라제 결합 부위에 의해 측면에 있습니다. 공급 업체의 열 기반 용출 프로토콜에 따라 PCR 제품 정제 키트 (재료 표참조)를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 수율을 높이려면 동일한 용출물로 최종 용출 단계를 최대 3배까지 반복합니다. 수율을 분광성으로 평가합니다.참고: 수율은 일반적으로 100에서 700 ng/μL 범위입니다. 이 정제 된 제품은 추가 사용까지 -20 °C에 보관 할 수 있습니다. 시험관 내 dsRNA 합성 및 정제 유전자 특이적 PCR 정제 제품을 사용하여 dsRNA 합성 키트의 프로토콜에 따라 시험관 내에서 dsRNA를 합성한다. 필요한 경우 dsRNA 생산 증가를 위해 인큐베이션 시간을 연장하십시오. 반응 혼합물의 불투명도에 기초하여 반응의 진행을 평가합니다(dsRNA 생성물의 양이 클수록 탁도가 높을수록). 인큐베이션의 끝에서, DNase 치료를 사용하여 반응을 중지합니다. 이렇게하려면 2 U / μL의 스톡에서 1 μL을 반응 혼합물에 추가합니다. 템플릿 DNA의 최적의 분해를 보장하기 위해이 치료를 1-2 h로 확장하십시오. 정제 키트 또는 다음 단계를 통해 dsRNA를 정화합니다. 생성 된 제품을 115 μL의 뉴클레아제없는 물로 희석하고 3 M 나트륨 아세테이트의 15 μL을 추가하십시오. 이 반응 혼합물에 얼음 차가운 100 % 에탄올 2 부피를 추가하고 -20 °C에서 하룻밤 dsRNA를 침전시한다.참고: 이 시점에서 최종 수율에 영향을 주지 않고 샘플을 안전하게 저장할 수 있습니다. 9000 x g에서 20 분 동안 0 °C에서 침전을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오. 13000 x g에서 15 분 동안 얼음 차가운 70 % 에탄올과 원심 분리기로 제품을 한 번 씻으십시오. 상피및 공기건조펠릿을 5-15분 동안 제거하였다. 정제 된 dsRNA를 -20 °C에서 추가 사용까지 저장합니다. 원하는 발달 단계에서 주입을 위해 정제 된 dsRNA를 사용합니다. 3. dsRNA 주사를 위한 초기 단계 T. marmoratus 배아의 수집 및 준비 T. marmoratus 배아의 잠복에 대 한 아가로즈 플레이트를 준비. 먼저, 20 mg의 저융 아가로즈 분말을 100mL의 오토클레이브 증류수(2% 아가로즈)에 녹인 다음, 투명한 용액이 얻어질 때까지 전자레인지에 이 혼합물을 끓입니다. 기포가 넘쳐 나면 뜨거운 용액을 주의하십시오. 이 솔루션을 작은 페트리 접시에 분배합니다. 아가로즈 플레이트 표면에 홈(배아를 보유하게 됩니다)을 만들기 위해, 액체 아가로즈 표면에 1-2mm 너비의 플라스틱 튜브(예: 플라스틱 이송 파이펫의 끝)를 배치한 후 고화시한다. 아가로즈가 고화되면 무딘 집게 한 쌍을 사용하여 이러한 튜브를 제거하십시오. 아가로즈의 이러한 들여쓰기를 커버하기 위해 P1000 마이크로 파이프를 사용하여 500 μL의 오토클레이브 증류수를 추가합니다. 미세한 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여, 자동 증류수로 채워진 유리 캐비티 접시에 딱정벌레 중첩 사이트에서 5-8 h 의 T. marmoratus 배아를 수집합니다. 중첩 부위를 자주 모니터링하여 얻은 계란이 적절한 나이인지 확인합니다. 미세 해부 집게를 사용하여 스테레오 현미경으로 배아를 부조합니다. 이렇게하려면, 현미경 (원하는 배율에서) 적당한 각도로 광원을 배치하여 현미경 (원하는 배율에서)에서 초리온을 시각화한 다음 날카로운 집게로 양면에서 초리온을 잡고 찢어서 배아를 부드럽게 밀어 냅니다. 두 개의 레이어가 있는 것처럼 두 레이어가 모두 제거되었는지 확인합니다. 미세한 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여 유리 캐비티 접시에서 아가로즈 플레이트로 배아를 조심스럽게 옮기고 스테레오 현미경으로 홈에 배치하십시오. 이 과정에서 비반향배아가 매우 깨지기 때문에 세심한 주의를 기울이십시오. dsRNA 주사를 위해 준비된 배아를 사용하십시오.참고: 약간 두꺼운 끝은 머리가 발달할 배아의 측면입니다. 4. 초기 단계 T. marmoratus 배아에서 dsRNA 미세 주입 유전자 특정 dsRNA를 가진 초기 단계 배아를 주입하려면, 미세 주입 바늘 풀러를 사용하여 미세 주입 바늘을 준비 (재료의 표참조). 스테레오 현미경의 밑에 바늘 끝을 시각화하는 동안, 바늘 끝을 깰 미세 한 집게의 쌍을 사용하여 날카로운 가장자리를 만듭니다. 이상적으로, 바늘 끝을 대각선으로 깨고 날카로운 가장자리가 한쪽에 남아 있어 최소한의 부상을 입히면서 배아에 들어갈 수 있습니다. 얼음에 정제 된 재고 dsRNA 솔루션을 해동, 10 x 사출 버퍼의 1 μL을 추가하고 이중 증류수로 위로, 사출 솔루션의 10 μL을 만들기 위해. 주사의 경우, 1 μg/μL의 dsRNA 농도는 일반적으로 적합하지만 생성된 동물의 현상진 심각도에 따라 조정할 수 있다).참고: 0.1M 나트륨 인산염 버퍼의 10 μL을 추가하여 10x 사출 버퍼22의 1mL을 준비합니다(M Na2HPO4의 8.5mL 및 1의 1.5mL를 혼합하여 제작 M NaH2PO4는 0.5M KCl의 100 μL, 100 μL 의 식품 염료 100 μL 및 이중 증류수 790 μL으로 25°C에서 pH 7.6으로 조정되었습니다. P10 파이펫을 사용하여 작동 dsRNA 용액으로 미세 주입 바늘을 다시 채웁니다. 용액이 바늘의 끝을 채우면 압력 배출 기술을 활용하는 마이크로 주입 시스템에 연결된 마이크로 니들 홀더에 부착하십시오 (재료 표참조). 미세 주입 시스템과 가압 공기 공급을 켭니다. 마이크로 주입 시스템의 마이크로 밸브를 사용하여 사출 압력을 15 psi로 조정합니다. 시간 조정 노브를 사용하여 사출 기간을 조정합니다(“초”로 설정). 주사 기간은 필요한 사출 볼륨에 따라 달라지므로 필요한 경우 각 주입 전에 미세 주입 시스템에 이 매개 변수를 조정합니다. 초기 단계 T. marmoratus 배아에 대 한 1-2 nL의 주입 볼륨을 사용 하 여.참고: 주사량이 많을수록 배아 생존율을 방해하는 경향이 있습니다. 마이크로주입 시스템에 의해 분배되는 사출액의 부피를 측정하기 위해, 공기 중으로 주입할 때 바늘 끝에서 형성되는 유체 버블의 부피를 평가하여 주사 바늘을 보정한다. T. marmoratus 배아의 경우, 100-200 μm의 최적의 거품 크기를 사용합니다. 주사 바늘은 ~3s의 주사 지속 시간으로 15 psi에서 달성 될 수 있다면 좋은 품질입니다. 바늘이 45°와 60°사이의 각도로 배아에 접근하는 것을 예체 현미경으로 배아를 포함하는 바늘과 아가로즈 플레이트를 정렬합니다. 미세 조작기사용, 스테레오 현미경을 통해 진행 상황을 모니터링하는 동안 천천히 마이크로 니들 이동. 바늘끝이 배아의 표면에 닿으면 배아 표면을 관통할 때까지 바늘을 조심스럽게 앞으로 움직입니다. 이 배아의 생존에 영향을 미칠 수 있기 때문에 바늘 끝으로 깊은 배아를 천명하지 마십시오. 가변성을 줄이기 위해 배아 중간에 주사를 전달합니다. 바늘이 배아 내부에 들어가면 마이크로 인젝터의 주사 버튼을 조심스럽게 눌러 dsRNA의 용량을 배아에 전달하십시오. dsRNA의 1-2 nL을 주입 한 후, 천천히 배아에서 바늘을 철회, 그것은 파열 배아를 유발하지 않도록. 유사한 방식으로 다른 배아를 주입하십시오. 미세 주입 바늘이 시술 중에 차단되면 주입 압력과 지속 시간을 증가시켜 차단을 해제하십시오. 주사 부위에 착색 된 반점이 존재하여 성공적으로 주입 된 배아를 시각적으로 식별합니다 (사출 버퍼에는 음식 색이 포함되어 있기 때문에). 조심스럽게 습도 챔버에 주입 된 배아와 접시를 배치합니다. 이러한 챔버를 구성하려면 뚜껑이있는 플라스틱 상자를 가져 가서 70 % 에탄올로 살균하고 건조 할 수 있도록하고 바닥에 있는 오토클레이브 물에 담근 조직을 배치하여 습한 환경을 제공합니다. 이 습도 챔버를 적절한 온도(이 경우 25°C)와 14h 광 및 10h 어둡게 하는 인큐베이터에 놓습니다. 주입된 태아가 4-5일이 필요한 첫 번째 인스타 애벌레로 발전하도록 허용하십시오. 도 2에묘사된 바와 같이 형태학적으로 보이는 녹다운 표현형을 식별하기 위해 스테레오현미경을 사용하여 매일 배아 발달의 진행 상황을 모니터링한다. 고해상도 카메라를 사용하여 디지털 이미지를 촬영하여 이 진행 상황을 문서화합니다. 죽은 배아를 제거하고 잠복 기간 동안 다른 생존 배아에 미생물 오염의 가능한 확산을 피하기 위해 매일 아가로즈 플레이트에 물을 보충. dsRNA 주사에 대 한 적절 한 제어를 수행, 완충 주사를 포함 하 여, dsRNA의 주입 관심 의 유전자의 감각 가닥에 대 한 합성, DsRNA의 주사 대상 유기체 내에서 존재 하지 않는 서열에 대 한 합성. 추가 분자 방법을 사용하여 RNAi녹다운확인(22) 5. dsRNA 주사를 위한 T. marmoratus 애벌레의 준비 참고: 초기 단계 배아와는 달리, T. marmoratus 애벌레는 상대적으로 튼튼하고 더 큰 부피로 주입될 수 있습니다. 예를 들어, 제2 인스타는 생존율에 눈에 띄는 부정적인 영향 없이 최소 3μL를 가진 dsRNA 작동 용액의 최대 2 μL 및 세 번째 인별을 주입할 수 있다. dsRNA를 주입하기 위해 아가로즈에 포함시켜 애벌레를 고정시키는 것이 도움이됩니다. 애벌레를 수집하기 전에 2 % 아가로즈를 녹여 60-70 °C의 수조에 보관하여 액체 형태로 유지하십시오. 녹은 2% 아가로즈를 작은 페트리 접시에 붓고 굳어질 때까지 냉각하여 고정 접시를 준비합니다. 무딘 집게를 사용하여 주입 될 각 동물에 대해 아가로즈 플레이트 (대략 삽입 할 절지 동물의 크기)에 얕은 홈을 만듭니다. 적절한 발달 단계에서 어린 애벌레를 수집하십시오 (분석을 위해 원하는 단계 보다 한 단계 앞선 단계). 이렇게하려면 애벌레가 들어있는 배양 컵에서 물을 조심스럽게 배출하고 아래에 언급 된 단계를 따르십시오. 유충이 주목할만한 움직임을 보이지 않을 때까지 얼음에 마취 (조심스럽게 물 컵에서 애벌레를 선택하고 얼음에 부드럽게 배치). 무딘 부드러운 집게를 사용하여 얼음에서 유충을 조심스럽게 들어 올리고 목과 몸을 홈에 있는 고정 단계에 배치하지만, 아가로즈 표면 위에 있는 꼬리는 덮여 있지 않도록 하여 유충이 꼬리 첨탑을 통해 계속 호흡할 수 있게 합니다. 유충을 여전히 액체이지만 위험하게 뜨겁지 않은 아가로즈 두꺼운 층으로 덮습니다. 실수로 덮여 있는 경우, 집게를 사용하여 꼬리와 그 아래의 두 세그먼트를 아가로즈에서 풀어 주세요. 일단 아가로즈가 고화되면, dsRNA 주사에 대한 애벌레를 사용합니다. 6. T. marmoratus 애벌레에서 dsRNA 미세 주입 원하는 양의 유전자 특이적 dsRNA 작업 용액으로 미세 주입 바늘을 준비하고 백필하십시오(4.1-4.2 단계에서 설명된 대로). 수동으로 제어된 미세 주입 주사기에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 부착합니다. 바늘을 부착하기 전에 주사기 플런저를 끝까지 당겨 주입 압력 중간 시술이 부족하지 않도록하십시오. 제3 체형과 제4체 체판 세그먼트 사이에 등등적으로 위치한 주입 부위가 미세 주입 바늘의 궤적(스테이지에 거의 평행)에 정렬되는 등 고정된 유충을 배치한다.참고 : 바늘과 애벌레를 이 위치에 있는 앵글링하는 것은 바늘 팁에 대한 최소 저항의 경로를 제공하여 최소한의 손상으로 애벌레를 천포하기 때문에 중요합니다. 바늘과 애벌레가 배치되면 스테레오 현미경을 통해 진행 상황을 모니터링하면서 미세 조작기를 사용하여 바늘 끝을 유충으로 조심스럽게 이동합니다. 팁이 조직을 천포화 한 후, 천천히 조심스럽게 주사기에 압력을 적용합니다. 현미경의 밑에 바늘에 있는 착색한 주입 액의 움직임을 관찰하여 사출 압력을 조정합니다. 조심스럽게 주입 후 바늘을 철회. 부드러운 집게를 사용하여 껍질을 벗기고 아가로즈에서 유충을 풀어냅니다. 유충을 물(실온)이 있는 용기로 다시 옮기고 25\u201228°C의 인큐베이터 또는 배양실에서 더 발전할 수 있으며 14h 빛과 10h 의 빛의 경사이클을 갖는다. 4.10 단계에서 설명한 바와 같이 적절한 제어 주사 및 넉다운 정량을 사용하십시오.