水生甲壳虫中的RNA干扰是特定发育时间点操纵基因表达的有力工具

1. RNA分离和 de novo 转录组组装 使用专为富含脂质的组织设计的RNA隔离试剂盒（见材料表），从晚期第三星潜水甲虫幼虫眼管和成年Table of Materials甲虫进行总RNA分离。从T.马莫拉图斯分离出总RNA，然后按照前面描述的方法18对它进行测序。 德诺沃转录本组装注：要组装新转录组，可以使用各种生物信息学平台（ 参见材料表）。这些平台是市售的，在某些情况下，作为基于 Unix 的命令行脚本存在。由于组装是 de novo，建议在两个平台上独立组装转录组，并比较结果以排除误报或误报。 要开始组装转录组，请将原始读物上传到相应的生物信息学平台上。注意：这些文件通常是压缩的，格式为 FASTQSANGER。广州。无需解压缩文件，因为下一步将接受此格式。 使用 Trimmomatic 命令行修剪原始读取以删除低于默认阈值的适配器序列或短读。解压缩修剪后的原始读取;文件现在将采用 FASTQ 格式。串联每个示例的 FASTQ 原始读取，以获取已准备好进行新程序集的文件。 使用任何命令行脚本组装串联的原始读取 de novo，该命令行脚本可以组装转录组 de novo。保存组装的转录组，该转录组现在将有一个包含其各自序列的连体列表，作为 FASTA 文件。为了扩大组装的覆盖范围，为同一物种组合和组装多个转录组。注：这个过程增加了产生更准确的连体的机会，如果低拷贝数基因感兴趣，这一点尤其重要。 组装完成后，通过计算覆盖率分数来评估转录组是否完整（覆盖评估软件可免费获得， 请参阅材料表）。注：覆盖分数为 +gt;75% 的转录组被认为是不错的。然而，这个分数的相关性取决于转录组生成的原因。例如，如果转录组用于识别低拷贝数基因，则分数 >85% 更好，因为它表示覆盖范围更大。 使用基本的局部对齐搜索工具（BLAST;参见材料表）对 de novo 组装的转 录组进行注释。注：对于这个实验，转录组主要对照一个已知的 果蝇蛋白 数据库和已知的甲虫蛋白数据库进行注释。注释列表可以下载为电子表格文件，指示序列与其他生物体蛋白质相似的连体/连音可以下载为 FASTA 文件。 确定感兴趣的蛋白质的连数/数，并提取核苷酸序列。使用 BLAST 确定感兴趣的注附核苷酸序列中是否存在蛋白质特异性保守区域（如家用盒域）。检查具有相同注释的其他连音核苷酸序列重叠，以生成基因特异性转录的序列。注：识别序列重叠的连体通常不是所有基因都不可能，尤其是低拷贝数基因。 如果需要该基因的全长序列，请从具有最高序列相似性的连体开始，作为使用 cDNA 端的 3° 和 5° 快速扩增等技术识别整个成熟转录笔核苷酸序列的起始点 （RACE19）. 按照步骤 1.2.4=1.2.7 对从第二个平台获取的程序集进行注释。注：理想情况下，结果应该与感兴趣的蛋白质相似;但是，不同平台的覆盖范围在一定程度上会有所不同。 使用组装的转录组合成物种特异性 dsRNA，如第 2 节所述。 2. 克隆和基因特异性 dsRNA 合成 注：基因特异性克隆和dsRNA合成已详细描述T.卡斯塔纽姆2020，21，22。,21,22以下步骤是简要概述。 克隆、细菌转化和质粒测序 从生物体中分离总RNA（如步骤1.1所述），并使用逆转录试剂盒创建互补DNA（cDNA）（ 参见材料表）。从对感兴趣的基因特定的连体中识别一个或两个 100–1000 bp 核苷酸序列。 设计跨越整个核苷酸的底端对，并通过聚合酶链反应（PCR）放大序列。在结束添加额外的 30 分钟步长，在放大的 DNA 产品中创建 3+ 腺苷悬垂。使用 PCR 纯化套件净化本产品（ 参见材料表）。 按照供应商提供的克隆试剂盒协议，将纯化产品克隆成 pCR4-TOPO 质粒载体（参见材料表）。 Table of Materials使用热休克治疗，将克隆质粒转化为称职的细菌细胞（应变：大肠杆菌DH10B），按照供应商的称职细胞协议（见材料表），并筛选成功转化的细胞。注：带菌落的板材可包裹在石蜡膜中，以保留水分，并在4°C下储存长达一个月。 在37°C和200 rpm的摇床培养箱中，使用10μL移液器尖端和含有安西林（50μg/mL）的利生根汤（LB）中培养转化细胞的菌落，持续24小时。注：对于长期储存，培养细胞可用100%甘油稀释1：1，并在-80°C冷冻为甘油储存。 使用微型表分离试剂盒分离含有该培养物感兴趣的基因的质粒（参见材料表）。在评估屈服分光光度后，将分离的质粒（微活）储存在-20°C。具体地说，测量 260 nm、280 nm 和 230 nm 的样品吸光度。计算用于量化DNA的A 260/A280比率，以及用于量化 DNA 纯度的 A260 /A 230比率。260注：260/280比率1.8被普遍接受为足够纯的DNA，低于1.5的比率表示存在残留萃取试剂，如苯酚。260/230 比率应大于或等于 260/280 比率。较低的比率表示残留试剂污染。产量通常为 100 至 500 ng/μL。 对分离的微片进行测序，确认基因特异性片段已成功整合，在质粒中5°T7和3°T3启动子区域之间;这可以使用通用T7和T3测序底像22完成。使用具有基因特异性序列的微头，用于 dsRNA 制备。 PCR扩增和体外 dsRNA 合成 PCR 扩增和产品纯化 设计具有 T7 启动子序列的质粒特异性或基因特异性底转（详情见参考 22）， 以放大插入基因的线性片段。通过设置至少 10 个 20 μL 的反应来优化产量。注：所得产品侧翼有两个20bp T7聚合酶结合位。 使用 PCR 产品纯化套件（参见 材料表）按照供应商的基于列的洗脱协议进行净化 PCR 产品。要增加产量，请使用相同的洗脱剂重复最后的洗脱步骤达3次。以光度测量方式评估产量分光度。注：产量通常为100至700纳克/μL。这种纯化产品可以储存在-20°C，直到进一步使用。 体外 dsRNA 合成和纯化 使用基因特异性PCR纯化产品根据选择的dsRNA合成试剂盒的协议在体外合成dsRNA。如有必要，延长潜伏时间，增加 dsRNA 产量。 根据反应混合物的不透明度评估反应的进展（dsRNA 产品的量越高，浊度越高）。在孵育结束时，使用DNase治疗停止反应。为此，从2U/μL的库存中加入1 μL，加入反应混合物。将此处理延长至 1~2 小时，以确保模板 DNA 的最佳降解。 使用纯化套件或通过以下步骤净化 dsRNA。 用115μL无核酸水稀释所得产品，加入15μL的3M醋酸钠。将2体积的冰冷100%乙醇加入到这种反应混合物中，并在-20°C下将dsRNA沉淀过夜。注：此时，样品可以安全地存储，而不会影响最终产量。 在 0 °C 下将沉淀物在 9000 x g 下离心 20 分钟， 然后丢弃上一代。用冰冷的70%乙醇清洗产品一次，在13000xg下离心机15 分钟。 取出上流液，风干颗粒5~15分钟。将颗粒重新在高达40μL的无核酸酶水中（此体积可根据分离的颗粒大小进行调整），并评估产量和纯度分光度，如2.1.4所述。 将纯化的 dsRNA 储存在 -20 °C 下，直到进一步使用。在所需的发育阶段使用纯化的 dsRNA 进行注射。 3. 收集和制备用于 dsRNA 注射的早期 T. 马莫拉图斯胚胎 准备一个糖板，用于 孵育T.玛莫拉图斯胚 胎。 首先，在100 mL的自溶蒸馏水（2%agarose）中溶解20毫克低熔化的阿加糖粉，然后在微波炉中煮沸这种混合物，直到获得明确的溶液。小心热溶液，因为气泡会导致其溢出。 将溶液放入小培养皿中。要在红玫瑰板表面制作凹槽（用于容纳胚胎），在液体加糖表面凝固之前，将三个 1~2 mm 宽的塑料管（如塑料转移移液器的尖端）放在其表面。 一旦气糖凝固，使用一对钝钳去除这些管子。使用 P1000 微管加入 500 μL 的自体蒸馏水，以覆盖气糖中的这些压痕。 使用精细的天然发刷，从充满自洗蒸馏水的玻璃腔盘中从甲虫筑巢点收集5~8小时老的 T.Marmoratus 胚胎。经常监测筑巢地点，以确保获得的卵子具有适当的年龄。 使用精细的解剖钳在立体显微镜下对胚胎进行解剖。为此，在显微镜下（在所需的放大倍率下）将胆小子可视化，以适当的角度定位光源，然后用锋利的钳子从两侧抓住胆小子，将其撕开，然后轻轻地将胚胎滑出。由于有两个图层，请确保同时删除这两个图层。 使用精细的天然发刷，小心地将胚胎从玻璃腔盘中转移到红糖盘中，并将它们排列在立体显微镜下的凹槽中。在这个过程中要小心，因为被肢解的胚胎非常脆弱。使用准备好的胚胎进行 dsRNA 注射。注：稍厚的端是胚胎的一侧，头部将在其中发育。 4. 早期T.玛莫拉图斯胚胎 的dsRNA微 注射 要用基因特异性dsRNA注射早期胚胎，请使用微注射针拉拔器准备微注射针（ 参见材料表）。在立体显微镜下可视化针尖时，使用一对细钳来打破针尖，从而形成锋利的边缘。理想情况下，对角线断开针尖，使一侧保持更锋利的边缘，从而允许它进入胚胎，同时造成最小的伤害。 在冰上解冻纯化库存 dsRNA 溶液，加入 10x 注射缓冲液 1 μL，用双蒸馏水将其顶上，使 10 μL 的注射溶液。对于注射，dsRNA浓度为1μg/μL通常是合适的，但可以根据结果动物的表型严重程度进行调整。注：通过加入 10 μL 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（通过混合 8.5 mL 的 1 M Na2HPO4 和 1.5 mL 的 1，制备 1 mL 的 10x 注射缓冲液 22 M NaH2PO4 在 25 °C 时调整为 pH 7.6，100 μL 为 0.5 M KCl），100 μL 食品染料和 790 μL 双蒸馏水。22 使用 P10 移液器，使用工作 dsRNA 溶液回填微注射针。溶液充满针头后，将其连接到使用压力喷射技术的微注射系统（参见材料表） 的 微针支架上。 打开微注射系统和加压空气供应。使用微注射系统的微价，将喷射压力调整为15 psi。使用时间调整旋钮调整喷射持续时间（设置为”秒”）。 由于注射持续时间取决于所需的注射量，如有必要，在每次注射前调整微注射系统的此参数。对早期T.玛莫拉图斯胚胎使用1~2nL 的注射 体积。注：注射量越高，往往干扰胚胎存活率。 要测量微注射系统分配的注射液的体积，通过评估注射到空气中时在针头尖端形成的液泡的体积来校准注射针。对于 T. marmoratus 胚胎，使用 100~200 μm 的最佳气泡大小。如果注射持续时间为 ±3 s，注射针的质量良好，这一点可以在 15 psi 时实现。 将针头和含有胚胎的红糖板在立体显微镜下对齐，使针头以 45° 和 60° 的角度接近胚胎。 使用微操纵器，在通过立体显微镜监测进度的同时，缓慢移动微声。一旦针头接触胚胎表面，小心地向前移动针头，直到它刺穿胚胎表面。不要用针尖深入穿孔胚胎，因为这会影响胚胎的生存。为了减少变异性，在胚胎中间注射。 一旦针头进入胚胎内，小心地按下微注射器的注射按钮，将剂量的 dsRNA 送到胚胎。注射1~2nL的dSRNA后，慢慢从胚胎中收回针头，这样不会导致胚胎破裂。 以类似的方式注射其他胚胎。如果微注射针在手术过程中堵塞，则通过增加注射压力和持续时间来解除阻止。通过注射部位存在有色斑来直观地识别成功注射的胚胎（因为注射缓冲液含有食物色素）。 小心地将带注射胚胎的盘子放在湿度室中。 要建造这样的房间，请拿任何带盖子的塑料盒，用70%的乙醇消毒，让其干燥，并在底部将浸泡在自 化水中的组织放在底部，以提供潮湿的环境。将此湿度室放在温度适当（本例中为 25°C）且光循环为 14 小时、暗于 10 小时处的培养箱中。 允许注射胚胎发育成第一个星体幼虫，这需要4~5天。每天使用立体显微镜监测胚胎发育的进展情况，以识别图2中描述的形态可见的击倒 表型。 使用高分辨率摄像机拍摄数字图像，记录此进度。取出死胚胎，每天补充黄玫瑰板上的水，以避免干燥和微生物污染在孵化期间可能扩散到其他存活的胚胎。 对 dsRNA 注射进行适当的控制，包括缓冲注射、根据感兴趣的基因的感知链合成的 dsRNA 注射，以及针对目标生物体内不存在的序列合成的 dsRNA 注射。确认RNAi击倒使用额外的分子方法22。 5. 为 dsRNA 注射 准备 T. 马莫拉图斯幼虫 注：与早期胚胎 不同，T.玛 莫拉图斯幼虫相对坚固，可以注射更大的体积。例如，第二星可以注入高达2μL的dsRNA工作溶液，第三星可注射至少3μL，而不会对存活率产生明显的负面影响。注射dsRNA，通过将幼虫嵌入到阿加罗斯中，使幼虫固定不动是有帮助的。 在收集幼虫之前，熔化2%的气糖，并在60~70°C的水浴中保持液态。将融化的2%的阿加罗斯倒入小培养皿中，然后冷却直到凝固，准备固定盘。使用钝钳在阿加罗斯板中制作一个浅槽（大致相当于要嵌入的节肢动物的大小），用于注射的每个动物。 在适当的发育阶段（分析所需的阶段之前的一个阶段）收集幼年幼虫。为此，请小心地将水从含有幼虫的培养杯中排出，然后按照以下步骤操作。 在冰上麻醉（小心地从水杯中挑出幼虫，轻轻地放在冰上），直到幼虫没有明显的运动。使用钝的，软端钳小心地将幼虫从冰上提起，并放在固定阶段，其颈部和身体在凹槽中，但它的尾巴位于阿加罗斯表面上方，这样它便不会被覆盖，这样幼虫才能继续通过它的尾尖呼吸呼吸。 用一层厚厚的气糖覆盖幼虫，这种加糖仍然是液体，但热不危险。如果不小心被盖住，请使用钳子将尾巴和下方的两段从气管中释放。一旦阿加罗斯凝固，使用幼虫进行dsRNA注射。 6. T. 马莫拉图斯幼虫 的 dsRNA 微注射 使用所需量的基因特异性 dsRNA 工作溶液准备和回填微注射针（如步骤 4.1~4.2 中所述）。将针头连接到连接到手动控制的微注射注射器的针架上。在连接针头之前，将注射器柱塞一直拉出，以避免在中间过程中耗尽注射压力。 定位固定化幼虫，使注射部位位于第三和第四体板段之间的侧身位置，以相对平坦的角度（几乎与舞台平行）与微注射针的轨迹对齐。注：将针头和幼虫插入此位置非常重要，因为它为针尖提供最小阻力路径，以最小的伤害打穿幼虫。 一旦针头和幼虫被定位，小心地将针尖移入幼虫，同时通过立体显微镜监测进展。 尖端穿孔组织后，缓慢而小心地向注射器施加压力。通过观察显微镜下针头中彩色注射液的运动来调节注射压力。 注射后小心地收回针头。使用软钳剥开，从而从红玫瑰中释放幼虫。将幼虫与水一起转移回容器（室温下），在25°u201228°C的培养箱或培养室中进一步发育，光循环为14小时，暗10小时。 采用适当的控制注射和击倒定量，如步骤 4.10 所述。