液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ

1. ポリL-リジン(PLL)とフィブロネクチン様タンパク質(FLP)によるマイクロチップおよびコーティングの洗浄 SiN膜(2.0 x 2.6mm)のマイクロチップを50mLのアセトンに入れます。マイクロチップは平らな面を上に向けて慎重に処理します。フラットビークピンセットを使用してエッジを壊さないようにします。SiNウィンドウの破損を防ぐためにピンセットで取り扱う場合は、マイクロチップの上面に触れないようにしてください。注:マイクロチップの損傷を防ぐために、ポリテトラフルオロエチレンコーティングまたはカーボンチップピンセットを使用することもできます。 慎重にビーカーを振ってチップを2分間洗い、マイクロチップがひっくり返らないのを見てください。 マイクロチップを50mLのエタノールに移し、ビーカーを慎重に振って2分間洗浄します。余分なアセトンが乾燥しないように、転送が速く行われます。 マイクロチップを50mLの水で10分間洗います。 20 mLのエタノールの作りたてのビーカーにマイクロチップを浸します。 乾燥のためにクリーンルームのティッシュにマイクロチップを置く。 プラズマは、70 mTorrで11.5 sccm O2 と35 sccm Ar、50 Wの無線周波数(RF)ターゲットでマイクロチップを5分間洗浄します。 滅菌細胞の仕事のために層流フードにマイクロチップを置く。 水に0.01%PLLの溶液を準備します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で15μg/mL FLPの溶液を調製します。 層流フードの下に24ウェルプレートを準備し、次の順序でソリューションの1 mLで5ウェルを個別に充填:ウェル1 – PLL;まあ2 – 水;まあ3 – 水;まあ4 – FLP;まあ 5 – PBS と ウェル 6 – PBS.注:マイクロチップを示された24または96ウェルに数秒間ピンセットで浸して洗浄手順を行います。指示された時間と温度のために、示された溶液中の24または96ウェルのマイクロチップをインキュベートしてインキュベーションステップを行います。マイクロチップを数秒以内に別の井戸に移します。 マイクロチップをPLL溶液に5分間インキュベートします。その後、マイクロチップを水で2回洗います。 5分間、FLPでマイクロチップをインキュベートします。その後、PBSでマイクロチップを2回洗います。 細胞の播種のための無血清培地の50 μLで事前に充填された新しい96ウェルプレートのウェル(マイクロチップごとに1つ)に両方のマイクロチップを移します。 マイクロチップを37°Cおよび5%CO2でインキュ2ベートし、細胞懸濁液が調製されるまで調製する。 2. SiN膜マイクロチップ上の細胞の播種 滅菌作業を確実にするために、すべての消耗品と装置を積層フローフードに設置します。 乳癌細胞株SKBR3を、増殖培地と一緒に細胞培養フラスコで1回洗浄する。10%の胎児子牛血清(FCS)を含むダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)、および1%非必須アミノ酸(NEAAs)を増殖培地として使用してください。 フラスコから分離した細胞まで細胞脱離液の1 mLで細胞をインキュベートします。 フラスコの脱離した細胞に5mLの増殖培地を加える。この懸濁液を遠心分離管に移します。 20μLの細胞懸濁液をヘモサイトメーターにピペット20μLし、細胞濃度を得る。次の数式を使用します。. 分散した細胞懸濁液を2.5 x 105 細胞/mLで調製します。次の方法で、準備されたセル懸濁液の必要量を計算します。目的のボリュームに成長培地で埋める。 細胞懸濁液の100 μLを、SiN膜を上向きにしたPLLおよびFLPコーティングされたマイクロチップを含む96ウェルプレートの2つのウェルに加え、各ウェルが25,000個の細胞を含むように、50 μLの無血清培地を加えます。 プレートを37°Cで5%CO2で5分間2インキュベートし、細胞がマイクロチップに付着するのを待ちます。注: この時点で、セルはまだ接着していないため、マイクロチップからセルを取り外すことができます。 マイクロチップ上の細胞の密度を反転した顕微鏡で確認します。セルがウィンドウを覆い、フラットアウトして接着するのに十分なスペースがあることを確認します( 図 1Aを参照)。注: 必要に応じて、この時点でさらにセルを追加できます。 マイクロチップを200 μLの成長培地を含む新しいウェルに移し、一晩で37°Cと5%CO2 でインキュベートします。 翌日の午後には、細胞が平坦化して視覚的に検査された合流性(すなわち、細胞で覆われた窓領域の分率)に付着した場合、両方のマイクロチップを無血清培地(血清飢餓培地)に移す(すなわち、細胞で覆われた窓領域の分画)約2/3( 図1B参照)。異なる実験25の比較のために必要に応じて定義された開始条件で細胞を持って来るために必要に応じて無血清培地に変更する。 37°Cおよび5%CO2で一晩2インキュベートする。注: 細胞量は他の細胞株の増殖速度や細胞形態によって異なる場合があることに注意してください。 3. HER2のラベルと固定 補足表 1に記載されているとおりに、ソリューションを準備します。 滅菌作業を確実にするために層流フードの下で働く。ラベリングプレートIと呼ばれる96ウェルプレートを使用し、マイクロチップあたり6つのウェルを200 μLのラベリングプレートI溶液で充填します:PBS/BSA、PBS/BSA/GS、抗体模倣体、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。マイクロチップごとにウェルプレートの1行(例えば、A1からA6)を使用してください。ラベリングプレートを37°Cに温める。 ヒュームフードの下で、固定プレートと呼ばれる24ウェルプレートを準備し、500 μLの固定プレート溶液(CB、FA、CB、PBS、PBS、PBS、PBS/グリシン、PBS/BSA)でマイクロチップあたり8ウェルを充填します。注意:CBは吸入または経口摂取によって急性毒性であり、水に有害である。適切な保護を備えたヒュームフードの下で作業し、安全データシート(SDS)に従ってCBを処分します。FAは腐食性であり、皮膚および健康に有害である。ヒュームフードの下で作業し、取扱いと処分に関する情報については、SDSを参照してください。 ラベリングプレートIIと呼ばれる96ウェルプレートを準備し、マイクロチップあたり4つのウェルを200 μLのラベリングプレートIIソリューション(QD、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA)で満たします。注:ここでは、24ウェルプレートは、井戸内のマイクロチップをよりよく見るために使用されます。抗体模倣体(ステップ3.2)およびQD(ステップ3.4)を少なく使用するには、これらのステップに96ウェルプレートを使用してください。 セルにHER2にラベルを付けます。 これらのプレートが準備できたら、マイクロチップをラベリングプレート1の第1列のウェルに入れることでラベリングを開始する。 マイクロチップをPBS/BSAで、ラベルプレートIとマークされた96ウェルプレートで洗浄します。 ブロック非特異的部位は、PBS/BSA/GSを37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベートすることにより、抗体模倣体の非特異的結合を防2ぐ。 37°Cおよび5%CO2で10分間、200 nM抗体模倣体をインキュベー2トする。 PBS/BSAでマイクロチップを3回洗います。 セルを固定します。 マイクロチップをヒュームフードの24ウェル固定プレートに移します。注:ここから無菌作業は必要ありません。 CBで数秒間一度洗います。 3で細胞を10分間固定します。 CBで1回、PBSで3回洗浄します。 PBS-グリシンと2分間インキュベートすることによりFAの遊離アルデヒド基をブロックする。 PBS-BSAでマイクロチップを一度洗います。 QD を取り付けます。 マイクロチップを96ウェルラベリングプレートIIに移動します。 20 nM QDsを12分間インキュベートします。 マイクロチップをPBS/BSAで2回洗います。 マイクロチップはPBS/BSAを含む井戸に保管してください。 4. 固定細胞の光顕微鏡 直径3.5cmのガラス底皿に2mLのPBS/BSA溶液を用意します。 最初のマイクロチップを取り、ガラス底皿に逆さま(下向きの細胞)に置き、フッ素顕微鏡に皿を置きます。マイクロチップをゆっくりと液体に下げて、細胞の損傷を防ぎます。 40xの目的と適切な蛍光チャネルを持つすべてのマイクロチップの差動干渉コントラスト(DIC)および蛍光画像を取得します。注: ここでは、励起波長 540-580 nm、発光波長 607-683 nm を使用して、QD655 を検出します。 2 番目のマイクロチップに対して手順を繰り返します。 5. 後固定 ヒュームフードの下のすべてのステップを実行します。 96ウェルプレートのマイクロチップあたり6つのウェルを、200 μLの後固定ソリューションで満たします。CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.注意:GAは水に有害であり、皮膚、呼吸器系、および目に有害である。ヒュームフードの下で作業し、取扱いと処分に関する情報については、SDSを参照してください。 両方のマイクロチップをそれぞれのウェルに入れ、細胞を上に向けます。 CBで一度洗います。 2%GAの細胞を10分間固定します。 CBで一度洗います。 PBS/BSAで3回洗います。注:FAによる最初の固定ステップは既に生物学的構造を修正していますが、膜タンパク質拡散のレベルが低下する可能性があり、QDあたり複数のストレプトアビジンの存在により標識誘発クラスタリングにつながる可能性があります。したがって、膜内のタンパク質の拡散を最小限に抑えるために、FA固定からGAへの実験ステップの時間をできるだけ短くしてください。 新しいウェルプレートにグラフェンコーティングするまで4°Cで細菌の増殖を防ぐために、浸透衝撃を防ぐためにPBS/BSAに保管し、アジドナトリウム(NaN3)を使用します。乾燥を防ぐためにパラフィンフィルムとシールウェルプレート。マイクロチップと細胞は、4°Cで保存すると2週間まで安定です。注意:NaN3 は、皮膚および呼吸器系に対して、経口摂取によって水に有害であり、急性毒性である。ヒュームフードの下で作業し、取扱いと処分に関する情報については、SDSを参照してください。 6. 塩結晶へのグラフェンの洗浄と転写 PMMA-グラフェンオンポリマーからポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)-グラフェンを除去する(図2A)。 PMMA-グラフェンの周りのポリマー上の水のいくつかの液滴をピペット.注: PMMA グラフェンが水面に浮かぶように、支持ポリマーから容易に外れるようにしてください。 PMMA-グラフェンオンポリマーを30〜45°の角度で水中に浸し、PMMAグラフェンを放出します。注:ポリマーはわずかに濡れる必要があります。ポリマーに水をピペットしすぎると、PMMAグラフェンが持ち上がり、折り畳まれます。 過硫酸ナトリウム溶液を用いたエッチング銅系汚染物質(図2B)。注:銅箔で栽培された市販のグラフェンは、しばしば銅の銅残渣を含み、銅エッチャント溶液22で除去することができる。 50 mL溶液の過硫酸ナトリウムを水中に調製します。 標準的なガラススライドを使用して、グラフェン側を下にしてPMMA-グラフェンを過硫酸ナトリウム溶液に移します。PMMAグラフェンは溶液の上に浮かびます。 PMMA-グラフェンを過硫酸ナトリウム溶液に一晩放置します。 過硫酸ナトリウム溶液からPMMA-グラフェンを取り出し、ガラススライドを使用してきれいな水の上に置きます。30分間水の上に浮かべましょう。 前のステップを合計3回繰り返し、PMMA-グラフェンから過硫酸ナトリウム残渣をすべて除去する。 PMMA-グラフェンを塩化ナトリウム(NaCl)結晶に移します。 ペトリ皿に水の中にNaClの飽和溶液を準備します。 ガラススライドを使用してグラフェン側を下にしてNaCl溶液の上にPMMA-グラフェンを移します。 ピンセットでNaClクリスタルを保持し、浮遊PMMAグラフェンを拾います。注:NaCl結晶のサイズは、塩の端に突き出たグラフェンを折りたたんだり、ピンセットでグラフェンに接触しないように、PMMA-グラフェンのサイズよりもわずかに大きくする必要があります。これらの実験では、12mm x 12mm x 0.5mmのNaCl結晶が10mm x 10mmグラフェンシートを拾い上げ、後でそれを支持するために使用されます。 PMMAグラフェンオンソルトを2分間垂直に保持し、余分な水を流れ出させます。 PMMAグラフェンオンソルトを室温で30分間乾燥させ、100°Cのオーブンで20分間オーブンで完全に水を取り除きます。 アセトン洗浄を使用してPMMAを取り外します(図2C)。 ガラスペトリ皿にアセトンをフュームフードのホットプレートで~50°Cに予熱します。火を避けるために温度を注意深く見てください。 PMMAグラフェンオンソルトをアセトンで満たされたペトリ皿に浸し、PMMAを30分間溶解させます。 新しいクリーンアセトンで合計3回、前のステップを繰り返します。 グラフェンオンソルトエアドライを十分に乾燥させてから、サンプル調製に使用してください。 7. グラフェンコーティング 注: グラフェンコーティング手順は図 3Aに概略的に示されています。 固定細胞で調製した1つのマイクロチップを洗浄し、清浄な水でHER2を標識し、バッファーから塩の残渣を除去します。マイクロチップをフィルターペーパーの上に置きます。細胞は暗い斑点として見えます(図3B)。 NaCl結晶の多層グラフェンを、カミソリの刃を使用してマイクロチップのSiNウィンドウに収まる部分に切ります。 純水のビーカーを準備し、水面に対して約45°の角度の結晶を傾け、水に触れることによってNaCl結晶からグラフェンを取り除きます。グラフェンは水面に浮かびます(図3C)。 水面から金属ループでグラフェンをキャッチします。グラフェンはループの下の液滴の中に浮かびます(図3D)。 マイクロチップの上面を下のループ面でタッチします。マイクロチップは金属ループにくっつきます。グラフェンはマイクロチップの上に見ることができます(図3E)。 立体顕微鏡では、フィルターペーパーを使用してマイクロチップから残りの水を取り除き、グラフェンがSiNウィンドウ上のすべての細胞を覆う。注:グラフェンはブロットすると移動します。フィルターペーパーの端だけでマイクロチップに触れることで、グラフェンがウィンドウの上部に残っていることを確認します。 ピンセットを使用して、金属ループからマイクロチップを取り外し、フィルターペーパーに置きます。グラフェンはマイクロチップ上の紫色のきらめきとして見えます(図3F)。 マイクロチップを紙からコンパートメントペトリ皿に移します。 水滴をフリーコンパートメントの1つにピペットし、蓋を閉じて水飽和雰囲気を提供します。 パラフィンフィルムでコンパートメント皿を密封し、さらに測定するために必要な場合は4°Cで冷蔵庫に保管してください。 8. ステム 凝縮レンズを調整して少なくとも0.2nmのプローブサイズのアライメント/テストサンプルを使用して200kVビームエネルギーでSTEMを調整し、プローブ電流 I = 180 pA(異なる顕微鏡設定のプローブ電流に関する情報は、5%の精度以内でメーカーによって提供されます)、アンパーチャーを挿入して13.2 mradの収束ビーム半角を調整します。プロジェクター・レンズの設定を調整して、ADF STEM検出器の開口半角度範囲(内側と外側)を68~280 mradに設定します。STEM画像サイズを2048 x 2048ピクセルに設定し、ピクセルのドウェル時間 t = 6 μsに設定します。 グラフェンコーティングされた細胞を持つマイクロチップをTEM用の標準的な標本ホルダーにロードし、細胞が上を向いているようにします。 ホルダーを電子顕微鏡に積み込みます。 手順 8.1 の設定を使用して、拡大率(M)= 800x (図 4) の概要図を取得します。 セル上の関心領域を識別する。 ステップ 8.1 の設定を使用して 、ピクセル サイズ d = 1.3 nm ( 図 4 ) で ADF 検出器を持つ QD をピクセル サイズ d = 1.3 nm (図 4)で画像化します。 露出後の画像を低倍率で取得し(ここでは、M = 50,000x)、露出領域を示す(図4)。 電子線量を計算するeは基本料金です。上記の設定で、5%の誤差を持つ。 同じ設定で用量シリーズの20枚の画像を取得しますが 、t = 60 μsで蓄積された線量が得られます。. グラフェンの存在を確認するには、 顕微鏡をM = 1,200xでTEMに切り替え、セルの近くの領域を選択し、回折モードに切り替えます。露出時間0.5秒、2048 x 2048 x 3ピクセル、選択領域絞り50μm(図4)で回折パターンを記録する。 セッションの終わりに、顕微鏡からサンプルを取り出し、マイクロチップをコンパートメント皿に戻し、パラフィンフィルムで皿を密封し、さらに測定するために必要に応じて4°Cの冷蔵庫に保管します。 グラフェンコーティングなしの第1マイクロチップと同様に作製した2番目のマイクロチップを選択します。 手順 8.2 ~ 8.11 を繰り返しますが、このサンプルでは今すぐ実行します。上記と同じ設定で回折パターンを記録します(図 4)。 9. 分析 注:STEM画像内のQD位置の自動検出のために、分析は他の20で説明されているように、ImageJ(NIH)用のローカル設計のプラグインを使用します。プラグインは、ご要望に応じてご利用いただけます。 ソフトウェアは、次の手順を自動的に適用して、STEM イメージ内のパーティクルを検出します。 ガウス フィルタを適用して、ピクセルノイズを低減します。 高速フーリエ変換(FFT)バンドパスフィルタを適用して、ナノ粒子のみを取得します。 イメージを二項化するしきい値を設定します。 粒子検出には、許容値係数 2 の 10 nm の粒子径を使用します。 パーティクルの位置を検出します。 シリーズごとに10組のQD間の中心から中央までの距離を測定します。ここでは、1系列ごとに、サイズが異なる10の距離を測定した。 次の方法を使用して、各パーティクルの距離と最初のイメージの距離を比較して、パーティクルの距離の相対的な変化を計算します。.