Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım
Summary
Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.
Abstract
Hücre içi bakteriyel patojen Klamidya trachomatis iki morfolojik ayrık gelişim formundan oluşan bir gelişim döngüsünden geçer. Replikatif olmayan temel cisim (EB) konaklayıcının enfeksiyonunu başlatır. Bir kez içinde, EB reticulate vücut (RB) içine ayırt eder. RB daha sonra bulaşıcı EB formuna geri ayırt etmeden önce, çoğaltma birden fazla tur uğrar. Hücre türleri arasında geçiş başarısızlığı ya ana konak işgali veya çoğaltma önler gibi bu döngü klamydial sağkalım için gereklidir.
Klamidya’nın zorunlu hücre içi doğasınedeniyle genetik tekniklerde sınırlamalar hücre tipi gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını engellemiştir. Canlı hücre mikroskobu ile birlikte hücre tipi anahtarlamanın gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyan yeni bir çift promotör-muhabir plazmid sistemi tasarladık. Hücre tipi gelişimin düzenlenmesinde yer alan genleri belirlemek için, canlı hücre promotör-muhabir sistemi, çift muhabir in kimyasal mutagenezi birleştirerek ileri genetik bir yaklaşım geliştirilmesi için kaldıraçlı, görüntüleme ve altered gelişimsel kinetik ile Klamidya izleme, mutantların klonal izolasyon izledi. Bu ileri genetik iş akışı genetik yollar geniş bir yelpazede içine yönlendirilmiş sorgulama için değiştirilebilir esnek bir araçtır.
Introduction
Klamidya trachomatis (Ctr) onun hayatta kalma ve proliferasyon için gerekli olan bir bifhasik gelişim döngüsü ile ilerler zorunlu bir hücre içipatojen1. Bu döngü iki gelişimsel formdan oluşur: temel gövde (EB) ve retikülat gövdesi (RB). EB çoğaltma yetersiz ama etkili veya indüklenen endocytosis2ile hücre invazyonu aracılık . Bir kez ana bilgisayarda, EB çoğaltıcı RB olgunlaşır. RB, sonraki enfeksiyon turlarını başlatmak için EB’ye geri dönmeden önce birden fazla çoğaltma turu yapar.
Genetik araçların sınırlı dizi biyokimyasal çalışmalar veya vekil sistemlerin kullanımı için klamydial araştırma çoğu kısıtlamıştır. Sonuç olarak, gen regülasyonu ve gelişim döngüsünün kontrolü açıklaması zor olmuştur3,4. Klamydial alanında daha önemli sorunlardan biri klamydial gelişim döngüsünün yüksek çözünürlüklü zamansal izleme ve onun düzenlenmesinde yer proteinlerin belirlenmesidir. Klamydial gelişim döngüsü sırasında gen ekspresyonu geleneksel RNAseq, qPCR ve sabit hücre mikroskobu5dahil yıkıcı “bitiş noktası” yöntemleri ile yapılmıştır 5,6. Bu yöntemler paha biçilmez bilgiler sağlasa da, kullanılan teknikler zahmetli dir ve düşük zamansal çözünürlüğesahiptir 5,6.
Son on yıl içinde, Ctr genetik manipülasyon plazmid dönüşüm ve mutagenesis,7,8,9için yöntemlerin giriş ile ilerlemiştir. Bu çalışma için, plazmid tabanlı bir sistem bir enfeksiyon boyunca gerçek zamanlı olarak bireysel inklütal gelişimi izlemek için geliştirilmiştir. Bir chlamydial transformant hem bir RB ve EB hücre tipi özel organizatör-muhabir ifade oluşturuldu. RB özel muhabiri floresan protein Yonca erken RB gen euo upstream organizatörü eriterek inşa edilmiştir. EUO geç EB ilişkili genlerin bir alt kümesi bastırır transkripsiyondüzenleyici10. HCTBorganizatörü , EB nükleoid yoğuşması dahil bir histon benzeri protein kodlar, doğrudan mKate2 (RFP) upstream EB özel muhabir oluşturmak için klonlandı11. hctBprom-mKate2/euoprom-Clover için omurga p2TK2SW27oldu. HctB ve euo organizatörleri Ctr-L2 genomik DNA’sından güçlendirilmiştir. Her organizatör dizisi belirtilen klamydial gen artı ilgili ORF ilk 30 nükleotit (10 amino asit) için öngörülen transkripsiyon başlangıç alanının yukarı ~ 100 baz çiftleri oluşuyordu. Floresan FP varyantları ticari olarak Ctr kodonu optimize gen blokları olarak elde edildi ve her bir klamydial gen ve promotör ilk 30 nükleotit ile çerçeve içinde klonlanmış. IncD terminatör doğrudan mKate2 aşağı klonlanmış oldu. İkinci organizatör-muhabir incD terminatör aşağı yerleştirildi. P2TK2SW2’deki ampisilin direnç geni(bla)pBam4’ten aadA geni (Spectinomycin direnci) ile değiştirildi. Bu son yapı p2TK2 sonuçlandı-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Şekil 1A) Ctr-L27dönüştürülmüştür . Bu RB/EB muhabiri, canlı hücre mikroskopisi kullanılarak tek dahil ler içinde gelişim döngüsünün gözlemlemesine olanak sağlar (Şekil 1B,C).
Organizatör-muhabir yapımımızı kimyasal mutagenez ile birlikte kullanan bir protokol, Ctr serovar L2’nin mutajenleşmiş popülasyonlarından gelişimsel anormallikler sergileyen bireysel klonları izlemek ve izole etmek için bir protokol geliştirildi. Bu protokol, tek tek klamydial inklüetlerin doğrudan izlenmesine, zaman içinde gen ekspresyonunun izlenmesine, değişmiş bir gelişimsel gen ekspresyonu deseni ifade eden klamyal klonların tanımlanmasına ve Klamidya’nın tek tek içermelerden klonal izolasyonuna olanak sağlar.
Bu protokol özellikle klamydial gelişime dahil olan genlerin tanımlanması için oluşturulmuş olsa da, herhangi bir sayıda kimydial genetik yolu sorgulamak için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klamydial gelişim döngüsünü kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, mevcut genetik araçların sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. Canlı hücreli otomatik mikroskopi ile birlikte organizatör-muhabirkla Klamidya’yı istihdam eden bir sistem, 24 saatlik bir süre içinde bireysel içermelerde hücre tipi gelişimin izlenmesini sağlayan bir sistem inşa edilmiştir. Bu sistem, kimyasal mutagenez ve doğrudan dahil izolasyon ile birlikte hızlı ve klonsal klamidya değiştirilmiş gelişi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Washington State Üniversitesi’nden Dr. Anders Omsland’a CIP-1 baltalı medyayı sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe R01AI130072, R21AI135691 ve R21AI113617 tarafından desteklenmiştir. Idaho Üniversitesi ve Merkezi Modelleme Karmaşık Etkileşimler için kendi NIH hibe P20GM104420 aracılığıyla başlangıç fonları tarafından ek destek sağlanmıştır.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
Referenzen
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. . Collaborative data science. , (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
