Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Alle dierenprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Pittsburgh. Een mannelijke controle muis (C57/BLJ) werd commercieel gekocht en gehuisvest in de afdeling Van Laboratorium Dierlijke Hulpbronnen aan de Universiteit van Pittsburgh. Muizen werden gevoed standaard knaagdier laboratorium chow ad libitum en bewaard in een 12 uur licht / donker cyclus. Leverweefsel werd geoogst en opgeslagen bij −80 °C. 1. Eiwitextractie OPMERKING: Deze stappen worden handmatig uitgevoerd. Was muislever (100 mg) met zout en homogenaat met 500 μL van 8 M ureum met behulp van een mechanische homogenisator met behulp van lysing matrix Een kralen voor 4 m/s voor 20 s.OPMERKING: In deze studie werden geen protease- of fosfataseremmers toegevoegd, maar kunnen indien nodig aan de buffer worden toegevoegd op basis van het experiment. Ook kunnen eiwitextractiestappen dienovereenkomstig worden aangepast voor verschillende monstersoorten. Breng het weefselhomogenaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis, spoel en combineer de lysingbuizen met 100-500 μL PBS met 8 M ureum. Centrifugeren de gehomogeniseerde weefsels (12.800 x g,4 °C en 15 min) en verzamel de supernatant.OPMERKING: De rest van de stappen worden uitgevoerd op de robotvloeistofgeleider die beschikbaar is in het laboratorium van de gebruiker. De vloeistofafhandelaar moet in staat zijn buffers van en naar de typen van de ANCI gespecificeerde plaat te aspireren en af te geven, met minimale deelname van de exploitant. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic zuur (BCA) test volgens de instructies van de fabrikant. Zet de PPA, verwarmings-/koelapparaat en de vacuümpompen aan en sluit alle accessoires aan met vloeistofafhandelaar. De vloeistof handler toont een blauw licht zodra het is aangesloten op de computer en klaar om te werken. Voeg voor reagensplaat 1 (96 putplaat) 30 μL van 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL cysteïne en 25 mM 30 μL iodoacetamide (IAA) toe aan respectievelijk rijen 1, 2 en 3. Voeg 8 M ureum en 20 mM Tris met 10 mM CaCl2 (pH 8.2) toe aan een reservoirplaat. Voeg 500 μL van 5% mierenzuur toe aan 2 mL diepe putplaat, 20 μL trypsine aan rij 1 van trypsineplaat en plaats in de deklocatie zoals gespecificeerd door de methode.OPMERKING: IAA en trypsine werden toegevoegd aan de 96 goed plaat voorafgaand aan het toevoegen aan het monster. Aliquot 300 μL van het leverhomogenaat in een 500 μL buis en plaats op een 2 mL diepe putplaat en plaats op 4 °C tot het begin van het protocol. Voor dit experiment werden 22 aliquots gegenereerd uit het eenle leverhomogenaat.OPMERKING: Voeg een interne kwaliteitscontrolenorm (bijvoorbeeld runder alfa caseïne of ander exogeen eiwit) toe met de verhouding 1 μg norm: 100 μg eiwitmonster. Definieer het volume van de buffers dat aan de monsters moet worden toegevoegd aan de variabele namen en waarde volgens tabel 1. Voer op basis van de BCA het volume van de monster- en normalisatiebuffer (8 M ureum) in op een spreadsheet en voeg deze toe aan de software(tabel 2).OPMERKING: Verdere verdunning met buffer kan nodig zijn als de eiwitconcentratie te hoog is. De resulterende concentraties voor monster uit het leverweefsel waren 10 μg/μL. Het volume van de buffers werd geoptimaliseerd voor 100 μg eiwit. Verwijder monsterbuizen van 4 °C, plaats op de opgegeven deklocatie van de geautomatiseerde vloeistofafhandelaar en laat 10 minuten opwarmen. Open de methode en volg de instructies om de vereiste tips (1070, 90 en 230 μL) en labware in de gewenste posities te plaatsen. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten.OPMERKING: De begeleide set-up informeert de gebruiker om een vereist volume van buffer toe te voegen aan de specifieke labware, afhankelijk van het protocol en de dek locatie te worden bewaard. 2. Steekproefreductie, alkylation en spijsvertering Laad 230 μL-tips en haal 90 μL van 8 M ureum uit het reservoir en doseer aan rij 1 van de zwarte 2 mL diepe putplaat. Ontlaad de tips. Herhaal deze stap tot 8 M ureum wordt toegevoegd aan alle putten die overeenkomen met de 22 monsters.OPMERKING: De denaturatiebuffer ontkracht de eiwit driedimensionale structuur om de primaire structuur op te leveren, zodat de trypsine effectief kan werken en het eiwit kan breken. De 8-kanaals pipet kan verschillende volumes voor de 8 kanalen aanzuigen en kan op verschillende locaties in het labware worden afgegeven. In deze stap hebben alle kanalen hetzelfde volume aangezogen als gedefinieerd in de software. Na het toevoegen van de denaturatiebuffer, laad de 90 μL-uiteinden en het aanzuigen van 10 μL (komt overeen met 100 μg) van het muisleverhomogeen met behulp van de 8-kanaals pipet op de zwarte 2 mL diepe putplaat. Ontlaad de tips. Herhaal deze stap totdat alle 22 monsters zijn overgedragen. Na elke overdracht voert u een mengstap uit om 50 μL van de putinhoud driemaal op te zuipen om ervoor te zorgen dat het eiwit met de buffer wordt gemengd om een 1:1-verhouding te vertonen.LET OP: Verwijder het monster van het homogenaat op voorraad en plaats in -80 °C. Om de gedenatureerde eiwitten te verminderen, laadt u één rij van 90 μL-uiteinden en 3 μL DTT uit de reagensplaat 1. Geef DTT af aan rijen 1 en 2 van de zwarte 2 mL diepe putplaat en ontlaad de uiteinden.OPMERKING: Het eiwit: DTT molaire ratio wordt gehandhaafd op 1:40 voor vermindering van disulfide bindingen. De berekening voor de molaire verhouding is gebaseerd op de eiwitmassa van runderserum albumine (BSA), dat is 66,5 x 103 g/mol. Verzegel de monsterplaat met aluminiumfolie en incubeer bij 37 °C voor 600 s bij 300 tpm. Voeg 30 μL van 0,25 M IAM toe aan rij 3 van reagensplaat 1 vlak voor gebruik en plaats op het dek. Maak de monsterplaat los en keer terug naar het dek.LET OP: IAM is lichtgevoelig. Laad één rij van 90 μL-tips, haal 6 μL IAM van de reagensplaat 1 bij rij 3 en doseer aan rij 1 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.OPMERKING: Het eiwit: IAM molaire verhouding wordt gehandhaafd op 1:80 voor elk monster. Deze reactie moet in het donker gebeuren. Sluit de monsterplaat en de incubaat gedurende 30 minuten bij 300 tpm op het verwarmings-/koelapparaat af bij 4 °C.OPMERKING: Het afdichten van de plaat wordt uitgevoerd om te voorkomen dat het monster licht, verdamping en morsen uit de put. Maak de monsterplaat los en laad één rij 90 μL-tips en haal 5 μL cysteïne uit de reagensplaat 1 bij rij 2. Doe af op rijen 1 en 2 van de monsterplaat en los de tips uit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.OPMERKING: Het eiwit: L-cysteïne molar ratio wordt gehandhaafd op 1:40. Plaats de monsterplaat op de orbitale shaker om een getimede shake van 1800 rpm gedurende 30 minuten uit te voeren. Voeg 800 μL van 20 mM Tris buffer met 10 mM CaCl2 (pH 8.2) toe aan elke put van de monsterplaat om de ureumconcentratie te verdunnen tot 2 M. Ontlaad de uiteinden.OPMERKING: Trypsine activiteit wordt belemmerd bij hogere ureumconcentraties en dus moet worden teruggebracht tot minder dan 2 M. Deze studie werd uitgevoerd met een eiwit om de kiesverhouding van 50 te trypsin: 1 op 14 uur. Voeg 20 μL trypsine toe aan rij 1, kolom 1-12 van een 96 putplaat en plaats op een bepaalde locatie op het dek. Laad één rij van 90 μL-tips, aspirate 2 μL trypsine uit de trypsineplaatrij 1 en doseer aan rijen 1 en 2 van de monsterplaat. Ontlaad de tips. Sluit de plaat af en sluit de plaat 14 uur bij 37 °C bij 600 tpm af op het verwarmings-/koelapparaat. Na incubatie, ontzegelen van de monsterplaat en voeg 5% mierenzuur aan rij 3, kolom 1-12 van een diepe put collectie plaat en plaats deze op het opgegeven dek. Stop de spijsvertering door 150 μL van 5% mierenzuur toe te voegen van rij 3 van de mierenzuurplaat en doseer af aan monsterplaat bij rijen 1 en 2. Ontlaad de tips. 3. Desalting stap 1 Desalt de peptiden met SPE plaat met 20 mg Targa C-18 materiaal. Bevestig het volume voor elke bufferuitwisseling als 600 μL en bevestig de druk op 100 mbar. Laad 1070 μL-tips en aspiraat 600 μL acetonitril en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen. Met dezelfde tips, aspirate 600 μL acetonitril en afzien aan rijen 1 en 2 van SPE plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.LET OP: De doorstroom kan worden afgevoerd naar afval met behulp van een zuigpomp. Laad 1070 μL-tips en draag 600 μL buffer A (100 % water in 0,1 % mierenzuur) en doseer aan de rijen 1 en 2 van de SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.OPMERKING: Als het volume van de buffer niet aanzienlijk vermindert, probeer dan de druk of tijd te verhogen. Laad 2 rijen van 1070 μL-tips, aspirate 534 μL verteerde monsters en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen. Herhaal deze stap totdat alle monsters zijn geladen.OPMERKING: Aangezien het totale volume na het toevoegen van mierenzuur 1068 μL zal zijn en de monsters in twee passen zijn toegevoegd. Laad 2 rijen gebruikte 1070 μL-tips, aspirate 600 μL buffer A en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen. Herhaal de bovenstaande stap een keer om het monster schoon te maken. Laad 1 rij van 1070 μL-tips, aspirate 600 μL ACN: Water (60:40) en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Leg de SPE-plaat op een verzamelplaat om de peptiden met PPA te ontwijken en druk uit te oefenen. Herhaal de bovenstaande stap om de peptiden in de verzamelplaat te ontwijken. Droog de afhaalplaat droog en bewaar op -80°C tot verdere verwerking. 4. Dimethylation Labeling (peptide N-termini) Plaats de gewenste tips (1070, 90 en 230 μL) en labware in de gewenste posities in de software. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten. Voeg voor reagensplaat 2 450 μL azijnzuur, 50 μL lichtformaldehyde (CH2O), 50 μL zware formaldehyde(13CD2O) en 150 μL mierenzuur toe aan respectievelijk rijen 1, 2, 3 en 4. Voeg aan reagensplaat 3 50 μL licht CB, 50 μL zware CB, toe aan rijen 1 en 2 en 50 μL ammoniak aan rij 3 en 4. Laad 2 rijen van 230 μL-tips en loker 100 μL van 1% azijnzuur uit rij 1 van reagensplaat 2 en doseer aan de gedroogde peptiden in monsterplaat 2 (verzamelplaat van de desalting step) rijen 1 en 2 en voer een getimede schudden gedurende 5 min bij 1800 rpm uit. Laad 90 μL-tips en aanzuig 16 μL van 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) van rij 2 van reagensplaat 2 en af te zien aan rij 1 van de monsterplaat. Ontlaad de tips. Laad 1 rij van 90 μL-tips en aanzuig 16 μL van 60 mM (4%) 13. CD2O (20% wt/v) van rij 3 van reagensplaat 2 en af te zien aan rij 2 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.OPMERKING: In deze studie rij 1 komt overeen met licht en rij 2 komt overeen met zware dimethylated monsters (zie figuur 1). Laad 2 rijen van 90 μL-uiteinden en draag 16 μL van 24 mM NaBH3CN en 24 mM NaBD3CN uit rij 1 en 2 van reagensplaat 3 en geef af aan respectievelijk rijen 1 en 2 van de monsterplaat. Ontlaad de uiteinden en voer een getimede shake gedurende 15 minuten bij 1800 rpm uit met behulp van de orbitale shaker.OPMERKING: Het toevoegen van natriumcyanoborohydride initieert de reactie dus om de variabiliteit tussen experimenten te verminderen deze stap eenmaal per batch wordt uitgevoerd. Laad 2 rij van 90 μL-tips en draag 32 μL ammoniak (~28-30% v/v) uit rijen 3 en 4 van reagensplaat 3 en doseer plaats aan rijen 1 en 2 respectievelijk van de monsterplaat 2. Ontlaad de tips.OPMERKING: Het toevoegen van ammoniak stopt de reactie dus om de variabiliteit tussen experimenten te verminderen deze stap wordt eenmaal per batch uitgevoerd. Combineer gelijke volumes licht en zwaar (1:1) dimethylated peptiden tot een nieuwe 2 mL diepe putplaat voor ontzilting.OPMERKING: In dit onderzoek werd 90 μL van de putinhoud van rij 1 gecombineerd met 90 μL rij 2 van monsterplaat 2 tot een nieuwe 2 mL-verzamelplaat (Monsterplaat 3). De verhouding van licht: zware menging is afhankelijk van het experimentele protocol, in deze studie werd een 1:1 verhouding gebruikt. Laad 2 rijen van 230 μL-tips en zuig 32 μL van 5% mierenzuur aan de gecombineerde monsters en voer een getimede schudden voor 30 s bij 1800 rpm uit.OPMERKING: De dimethyleratie-efficiëntie is afhankelijk van de pH van het reactiemengsel en elke verandering in buffer pH zal resulteren in onvolledige etikettering van de peptide N-termini. Dimethylation efficiëntie moet groter zijn dan 97% bij zoekopdrachten als dynamische wijziging op het peptide N-termini. In deze studie was de etiketteringsefficiëntie van lichte en zware peptiden respectievelijk 99,7% en 99,5%. 5. Desalting stap 2 Voer monsterdesalting uit dat vergelijkbaar is met stap 1 van de desalt voor de gecombineerde monsters. Droog de monsters in de monsterplaat met behulp van een snelheid vac en bewaar op -80 °C tot verdere verwerking. 6. Isobarische tagging (Lys residuen) Volg de begeleide labware-installatie en plaats de benodigde tips (1070, 90 en 230 μL), met de juiste buffers. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten. Voeg 250 μL van 100 m triethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB), 30 μL hydroxylamine (10% w/v) toe aan rijen 1 en 2 reagensplaat 4. Plaats de TMT-buizen op de 2 mL deep-well plaat volgens de spreadsheet in tabel 3. Bewaar een lege buis van 1,5 mL in een tube rackhouder voor het bundelen van de getagde peptiden. Plaats de gedroogde monsterplaat op P9 en TMT-verwerkingsplaat op P14. Om de peptiden te reconstrueren, laad je 230 μL-tips en draag je 100 μL van 100 m triethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB) buffer (pH ~8.5) uit rij 1 op DE TEAB-plaat en doseer je af aan de gedroogde peptiden in rij 3 van monsterplaat 3. Plaats de plaat op de orbitale shaker voor 30 s bij 1800 rpm.OPMERKING: Reconstitute 100 μg dimethylated peptiden bij een concentratie van 1 μg/μL. Laad 90 μL-tips en aspiraat 10 μL watervrije acetonitril van H12 van de TMT-plaat en doseer in elk van de gedroogde TMT-buizen. Verwijder de TMT buizen, vortex, en snel draai de buizen en terug te keren naar het dek in diepe put plaat. Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 12,5 μL van de gecombineerde dimethylated peptiden en doseer aan de rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips.OPMERKING: De TMT: peptide ratio werd gehandhaafd op 1:8 voor dit experiment. Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 10 μL TMT en doseer aan de rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips, voer een getimede shake uit gedurende 1 uur bij 1800 rpm. Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 8 μL hydroxylamine (10% w/v) van rij 2 op TEAB-plaat en doseer aan rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips, voer een getimede schudden voor 15 min bij 1800 rpm. Combineer 30,5 μL van de TMT gelabelde peptiden van TMT-verwerkingsplaat tot 1,5 mL buis. Ontlaad de tips na elke overdracht. Verwijder de buis met de gepoolde monsters en droog om de acetonitril te verdampen. Reconstitute peptiden in 0,2 mL water in 0,1 % mierenzuur en keer terug naar het dek.OPMERKING: De etiketteringsefficiëntie van isobaric tagging is ook pH-specifiek en de etiketteringsefficiëntie moet meer dan 98% bedragen per instructies van de fabrikant. In deze studie was de TMT labeling efficiëntie van de lysine beëindigd licht en zware peptiden respectievelijk 99,4% en 99,5%. 7. Desalting stap Voer monsterdesalting uit dat vergelijkbaar is met de desalt 1 voor één monster. Droog de monsters en bewaar in -80 °C tot de analyse. 8. Vloeibare chromatografie–tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) en MS3 Reconstrueren van de peptiden in MS-kwaliteit water met 0,1% FA om ~1 μg/μL-concentratie te verkrijgen. Filtermonsters met microcentrifugebuizen met een filter van 0,65 μm. Centrifuge peptiden op 12.000 x g gedurende 3 minuten en plaats de stroom door in een auto-sampler flacon.LET OP: De peptideconcentratie kan in dit stadium indien gewenst worden bevestigd. De peptiden zou moeten worden gereconstitueerd in LC-MS grade water en onderworpen aan een BCA peptide test. In deze studie werd de peptide BCA-test niet uitgevoerd en werden alle peptidehoeveelheden gebaseerd op de eerste eiwit BCA-test. Bereid de mobiele fasebuffers als volgt voor: 100% (v/v) water met 0,1% FA (A) en 100% ACN met 0,1% FA (B). Injecteer 1 μL monster op een valkolom vol met 2 cm C18-materiaal (3 μm, 100 Å poriegrootte).LET OP: Monster reiniging op de val is als volgt: 10 min, 100% A; 2 μL/min met behulp van een 2D vloeibaar chromatografiesysteem. Voer de analytische scheidingsmethode uit. Gebruik een 100 μm i.d. x 26 cm laser pulled-tip gesmolten silica capillaire kolom verpakt met C18 materiaal (2,5 μm, 100 Å). Het verloop is: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min. Voer de gegevensverwerving uit voor de massaspectrometer terwijl de analytische scheidingsmethode wordt uitgevoerd. Gebruik de volgende parameters voor de MS-enquête: 375-1.500 m/z,120.000 resolutie, Cyclustijd 3 s (topsnelheid), automatische gain control (AGC) doel 4.0e5, maximale injectietijd 50 ms. Gebruik de volgende parameters voor CID-MS/MS met ionenval: dataafhankelijke acquisitiescans per resultaat, 2 m/z isolatiebreedte, 35% genormaliseerde botsenergie (NCE), 0,25 activering q, 10 ms activeringstijd, 1.0e4 AGC, 100 ms maximale injectietijd. Gebruik de volgende parameters voor HCD–MS3 SPS 10: Scanbereik 100-400 m/z, aantal afhankelijke scans 10, AGC 5.0e4, maximale injectietijd 118 ms, HCD-botsingsenergie 55%, MS2 isolatievenster 2. 9. Gegevensanalyse Zoek gegenereerde RAW-bestanden voor de lijst van eiwitten en peptiden met behulp van een eiwitanalyse software tegen een geschikte database.OPMERKING: De RAW-bestanden die in dit onderzoek zijn gegenereerd, zijn doorzocht op een Uniprot-database met de muis. Aangezien er zowel lichte als zware etikettering in één RAW-bestand zit, zoekt u elk bestand met twee workflows naar lichte en zware dimethylated peptiden. Zoek de RAW-bestanden tegen muis Uniprot database (07/13/2019) met 53035 sequentie met de volgende parameters: trypsin decolleté met maximaal twee gemiste decolletés, peptide met minimaal 6 aminozuren lengte, 15 ppm oudermassatolerantie, 1 Da fragmentatietolerantie Statische modificaties: lichte dimethylation (+28.031, peptide N-terminus) of zware dimethylation (+36.076 Da, peptide N-terminus), carbamidomethyl (+57.021 Da, C), Dynamische modificaties: oxidatie (+15.995 Da, M), 11-plex isobaric tag (229.163 Da, K), 1% FDR, reporter ion quantification with 30 ppm peak integration tolerance, most confident centroid for integration method.OPMERKING: De zware dimethylated piek bevat ook een andere wijziging die ~ 7 Da (+35.069 Da, peptide N-terminus) van het licht dimethylated piek en dus een ander zoekknooppunt moet worden opgenomen om deze wijziging ook op te nemen. Voer reporter ion kwantificering op basis van de intensiteit, 65% SPS massa match, gemiddelde S / N ratio 10, isotopencorrectie, normalisatie en schaling werden niet uitgevoerd.OPMERKING: Normalisatie en schaling kunnen worden uitgevoerd op basis van de totale hoeveelheid peptide of een specifiek eiwit dat aan het monster is toegevoegd. QC-monsters kunnen ook worden opgenomen in de kanalen voor inter-batch- of intra-batchnormalisatie op basis van een interne referentieschaal18met twee staarten . De isotopenverontreinigingen van verschillende TMT-kanalen werden niet aan de zoekopdracht verstrekt, gebruikers wordt geadviseerd om de isotopenverontreiniging van verschillende reporter-ionen toe te voegen.