Измерение трансклеточного взаимодействия через агрегацию белка в гетерологийной клеточной системе
Summary
Здесь мы представляем оптимизированный протокол для быстрого и полуквантитативного измерения взаимодействия лиганд-рецепторов в транс в гетерологозной клеточной системе с использованием микроскопии флуоресценции.
Abstract
Белковые взаимодействия в клеточных интерфейсах диктуют множество биологических исходов, начиная от развития тканей и прогрессирования рака до формирования и поддержания синапса. Многие из этих фундаментальных взаимодействий происходят в транс и, как правило, индуцированных гетерофильных или гомофильных взаимодействий между клетками, выражают мембраны якорь связывающих пар. Выяснение того, как соответствующие мутации болезни нарушают эти фундаментальные белковые взаимодействия, может дать представление о множестве областей клеточной биологии. Многие анализы взаимодействия белка и белка, как правило, не размягываются между cis и транс-взаимодействиями, что потенциально приводит к переоценке степени связывания, которая происходит in vivo и включает в себя трудоемкую очистку белка и/или специализированного оборудования мониторинга. Здесь мы представляем оптимизированный простой протокол, который позволяет осуществлять наблюдение и количественную оценку только транс-взаимодействий без необходимости длительной очистки белка или специализированного оборудования. Анализ агрегации клеток HEK включает в себя смешивание двух независимых популяций клеток HEK, каждая из которых выражает мембранные согнатные лиганды. После короткого инкубационного периода образец изображения и полученные агрегаты количественно.
Introduction
Синаптические взаимодействия, облегчаемые молекулами синаптической адгезии, являются основополагающими для развития, организации, спецификации, обслуживания и функции синапсов и генерации нейронных сетей. Идентификация этих транссинаптических молекул адгезии клеток быстро растет; Таким образом, принципиально важно определить связывающих партнеров и понять, как эти новые молекулы адгезии взаимодействуют друг с другом. Кроме того, секвенирование генома выявило мутации во многих из этих молекул адгезии, которые обычно связаны с множеством нейроразвития, нейропсихиатрических и пристрастийрасстройств 1. Мутации в генах, кодящие молекулы синаптической клеточной адгезии, могут пагубно изменять транс-взаимодействия и могут способствовать патофизиологическим изменениям в формировании и обслуживании синапса.
Существует несколько анализов для количественной оценки белково-белковых взаимодействий, таких как изотермальная калорийность, круговой дихроизм, поверхностныйплазмоновый резонанс 2 и, хотя количественный по своему характеру, они имеют несколько ограничений. Во-первых, они требуют рекомбинантного белка, иногда требуя длительных и утомительных шагов по очистке. Во-вторых, они требуют сложного специализированного оборудования и технических знаний. В-третьих, они могут переоценить степень связывания, поскольку они позволяют как cis, так и транс-взаимодействия между белками, которые естественным образом привязаны к мембране in vivo. Здесь мы предлагаем простой и относительно быстрый анализ, который исключительно тестирует транс-взаимодействия.
Чтобы обойти многие из осложнений, связанных с очищенными анализами белка, мы оптимизировали клеточное белковое взаимодействие, которое резюмирует транс-взаимодействия в уменьшенной гетерологио-клеточной системе. Этот анализ ранее использовался в различных формах для изучения трансклеточных взаимодействий. При этом подходе молекулы адгезии клеток-кандидатов трансфицированы в клетки HEK293T. В физиологических условиях клетки HEK293T не проявляют самоагрегации, что делает их образцовыми моделями для этого анализа. Однако, когда отдельные популяции клеток HEK, выражаюющих рецептор и лиганд, объединяются, связывание рецептора и лиганда заставляет агрегацию клеток HEK произойти. Эта агрегация опосредовано исключительно транс-взаимодействиями и обычно наблюдается в десятки минут. В этом методе не требуется никаких шагов по очистке белка, и эффективность метода зависит от парадигмы, что популяции клеток HEK, выражают молекулы адгезии cognate, объединяются, а затем образовываются только через десятки минут. Кроме того, этот метод является относительно недорогим, так как ни антител, ни дорогостоящее оборудование не требуется. Единственным оборудованием, необходимым для получения данных, является стандартный флуоресцентный микроскоп. Дополнительным преимуществом этого клеточного анализа является способность быстро проверять влияние соответствующих точечных мутаций заболевания на транс-взаимодействия. Это может быть выполнено путем трансфектирования клеток HEK с cDNAs мутантных вариантов белка интереса.
В этом протоколе мы представляем пример, в котором мы исследуем, изменяет ли мутация в Neurexin3(Neurexin3’A687T),выявленную у пациента с диагнозом глубокая интеллектуальная инвалидность и эпилепсия, взаимодействия в транс с богатым лейцином ретрансляторным трансмембранным белком 2 (LRRTM2). Neurexin3 является членом эволюционно сохраненного семейство пресинаптических молекул адгезии клеток и в то время как недавняя работа определила несколько ролей в синапсе3,4,5,6,7, наше синаптическое понимание этой молекулы и всех членов семьи неурексинов остается неполным. LRRTM2 является возбуждающей постсинаптической клеточной адгезии белка, который участвует в формировании и обслуживаниисинапса 8,9,10. Важно отметить, что LRRTM2 исключительно взаимодействует с изоформами неурексина, которые не имеют сращивания сайта 4 альтернативный экзон (SS4-), но не с neurexin изоформы, содержащие сращивание сайт 4 альтернативный экзон (SS4 “). Мутация человеческой миссенсе (A687T), выявленная в Neurexin3, находится в неизученной внеклеточной области, которая эволюционно сохраняется и сохраняется между всеми альфа-неврексинами7. Поскольку взаимодействие между этими двумя молекуламибыло установлено 8,9,11, мы поставили вопрос: является ли связывающая способность Neurexin3’SS4- к LRRTM2 изменена мутацией точки A687T? Этот анализ показал, что мутация точки A687T неожиданно усилила агрегацию Neurexin3 до LRRTM2, предполагая, что внеклеточная область, в которой находится точка мутации, играет определенную роль в посредничестве транссинаптических взаимодействий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рассечение белково-белковых взаимодействий, которые происходят в транс во время клеточной адгезии, может привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе основных клеточных процессов, включая образование, функцию и поддержание синапсов во время созревания и рек…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института психического здоровья (R00MH103531 и R01MH116901 до J.A.), додокторского обучения Грант от Национального института общей медицины (T32GM007635 к S.R.), и Лида Хилл Гиллиам стипендий для перспективных исследований (GT11021 в S.R.). Мы благодарим доктора Кевина Вульфри за помощь с микроскопом, доктора К. Ульриха Байера за использование его эпифлуоресцентного микроскопа и Томаса Сюдхофа (Стэнфордский университет) для плазмиды LRRTM2.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
Referenzen
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
