Quantificazione degli acidi umici e fulvici in minerali di umato, DOC, materiali umificati e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche
Summary
Questo metodo fornisce una quantificazione gravimetrica di sostanze umiche (ad esempio, acidi umico e fulvico) su base priva di ceneri, in materiali secchi e liquidi da carboni molli (cioè lignite ossidata e non ossidata e carbone sub-bituminoso), minerali e scisti umato, torbe, compost e fertilizzanti commerciali e modifiche del suolo.
Abstract
Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una concentrazione accurata e precisa di acidi umici (HA) e/o fulvici (FA) in carboni molli, minerali umici e scisti, torbe, compost e prodotti commerciali contenenti sostanze umiche. Il metodo si basa sull’estrazione alcalina di materiali di prova, utilizzando 0,1 N NaOH come estrattore, e sulla separazione delle sostanze umiche solubili alcaline (HS) da prodotti non solubili mediante centrifugazione. Il pH dell’estratto alcalino centrifugato viene quindi regolato a pH 1 con conc. HCl, che si traduce in precipitazione dell’HA. Gli HA precipitati vengono separati dalla frazione fulvica (FF) (la frazione di HS che rimane in soluzione) mediante centrifugazione. L’HA viene quindi cotto o liofilizzato e viene determinato il contenuto di ceneri dell’HA essiccato. Il peso dell’HA puro (cioè privo di ceneri) viene quindi diviso per il peso del campione e la frazione risultante moltiplicata per 100 per determinare la % HA nel campione. Per determinare il contenuto di FA, l’FF viene caricato su una resina idrofobica DAX-8, che assorbe la frazione FA nota anche come acido fulvico idrofobo (HFA). La restante frazione acida non fulvica, chiamata anche frazione fulvica idrofila (HyFF) viene quindi rimossa lavando la resina con H2O deionizzato fino a quando tutto il materiale non assorbito viene completamente rimosso. La FA viene quindi desorbita con 0,1 N NaOH. Il Na-fulvato risultante viene quindi protonato passandolo su una forte resina a scambio H+. Il FA risultante è cotto o liofilizzato, il contenuto di ceneri determinato e la concentrazione nel campione calcolata come descritto sopra per HA.
Introduction
Le sostanze umiche (HS) sono residui dinamici che derivano dalla decomposizione microbica e dalla trasformazione di tessuti vegetali morti1,2,3 aumentati con sottoprodotti microbici e biomassa3,4,5 attraverso un processo che viene definito umificazione6. Gli HS sono presenti nei suoli, nelle acque naturali, nei sedimenti lacustri, nelle torbe, nei carboni molli e negli scisti umici e rappresentano circa il 25% del carbonio organico totale sulla terra7. Queste sostanze sono miscele complesse di migliaia di molecole uniche che vengono frazionate in tre frazioni principali in base alle loro diverse solubilità in soluzioni acquose fortemente basiche e acide. Queste frazioni sono acidi umici (HA), che comprendono la frazione solubile in alcali ma acido-insolubile; acidi fulvici (FA), la frazione solubile sia in alcali che in acido; e la frazione di utina, che è insolubile a tutti i valori di pH6,8. La frazione fulvica (FF) è ulteriormente suddivisa nelle frazioni idrofoba FA (HFA) e idrofila (HyFA). Queste frazioni sono definite come la parte del FF che si lega a una resina idrofoba DAX-8 (HFA) e la parte che non si lega alla resina (HyFA).
Le HS sono sempre più utilizzate in agricoltura, dove sono ampiamente utilizzate come biostimolanti delle colture, nella zootecnia, in particolare come additivo per mangimi per il bestiame, nell’estrazione mineraria nei fanghi di perforazione e nel risanamento ambientale come navette elettroniche. Anche la ricerca sull’uso dell’HS nelle applicazioni mediche umane è in aumento.
Esistono molti metodi per la quantificazione di HA e FA. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi non sono né accurati né precisi. Ad esempio, i due metodi più utilizzati per la determinazione dell’HA negli Stati Uniti sono il metodo colorimetrico9 e il metodo del California Department of Food and Agriculture (CDFA), entrambi i quali hanno dimostrato di sovrastimare la quantità di HA in una gamma di fonti di minerali ed estratti dagli Stati Uniti occidentali e dal Canada10. Il metodo colorimetrico o spettrofotometrico è impreciso perché si basa sull’assorbanza di estratti alcalini che includono, oltre a HA, FA e altri cromofori che assorbono tutti alla lunghezza d’onda utilizzata e lo standard non è rappresentativo dei materiali testati10. Il metodo CDFA non è accurato perché non fornisce concentrazioni di HA su base priva di ceneri. Poiché minerali diversi hanno quantità diverse di ceneri, alcune delle quali vengono trasportate con l’estrazione e il processo di estrazione stesso aggiunge cenere, questo metodo non fornisce un valore accurato per le concentrazioni di HA10. In risposta alla necessità di un metodo accurato e preciso, nel 2014 è stata pubblicata una procedura gravimetrica standardizzata basata su quella dettagliata di 11 per affrontare la quantificazione sia di HA che di FA su base ash free12. Questo metodo è stato poi adattato, con piccole modifiche, dall’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) nel 2018 sotto Fertilizzanti e ammendanti come “Determinazione delle concentrazioni di acidi fulvici umici e idrofobici nei materiali fertilizzanti”13.
Questo documento delinea il protocollo per l’estrazione e la quantificazione degli acidi fulvici umici e idrofobici e fornisce dettagli sull’accuratezza e la precisione dei dati prodotti dal metodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi iniziali dell’estrazione e dell’isolamento dell’HA in questo metodo sono relativamente semplici. Poiché l’isolamento dell’HFA comporta la cromatografia su colonna, l’ottenimento di risultati ripetibili comporta una stretta aderenza ai dettagli di ogni fase e pratica. In particolare, una corretta preparazione delle resine è di primaria importanza. È estremamente importante che la resina da polimetilmetacrilato DAX-8 sia preparata e imballata correttamente. Il corretto imballaggio della resina influisce sia sulla resa che sulla qualità dell’HFA. Se esiste una canalizzazione, né il pretrattamento (cioè l’acidificazione) né l’adsorbimento dell’HFA saranno completi e la separazione porterà a risultati imprecisi. Se si osservano canali o spazi nella resina prima del caricamento del campione, la colonna deve essere rimossa e agitata per ridistribuire le perle di resina, consentendo loro di depositarsi senza canali, e quindi reimballata pompando DI H2O pulito attraverso la resina. Inoltre, come indicato nel protocollo, mantenere un volume di liquido sopra la resina quando si carica la FF sulla resina, consentirà alla FF di miscelarsi prima di entrare nella resina e si tradurrà in un adsorbimento più efficace. Per la forte resina a scambio cationico H+ (Table of Materials), la rigenerazione completa non può essere affrettata. Lo scambio Na + / H + richiede tempo e quindi questo è meglio farlo in un trattamento di massa in modo che la resina possa essere miscelata mentre viene ri-acidificata. Miscelare la resina durante il risciacquo con DI H2O aiuta a rimuovere l’eccesso di HCl. Quando si solleva la resina acidificata per rimuovere l’acido in eccesso, mescolare la resina aiuta a rimuovere l’HCl. È estremamente importante rimuovere l’acido fino al punto in cui viene raggiunta una conduttività elettrica di ≤ 0,7 μS/cm. In caso contrario, l’HCl verrà riportato con l’HFA.
Infine, quando si desorbe l’HFA dalla resina DAX-8, una volta che l’assorbanza dell’influente è uguale all’assorbanza dell’effluente, è buona norma lasciare riposare la colonna per un paio d’ore per vedere se verrà rilasciato un ulteriore HFA. Se è così, sarà visto come un ingiallimento del liquido sopra la resina. Se ciò si verifica, l’HFA aggiuntivo può essere rimosso mediante continuo desorbimento fino a quando gli assorbimenti di influenza/effluente non sono di nuovo uguali.
Uno degli svantaggi dell’isolamento HFA è che l’intero processo richiede molto tempo. Il completo desorbimento dell’HFA dalla resina DAX-8 e la completa rimozione dalla resina A scambio H+ si traducono entrambi in un volume significativo di HFA che deve essere ridotto mediante evaporazione rotativa. Questo è sicuramente un collo di bottiglia nell’analisi. Nel tentativo di ridurre questo tempo, è stato suggerito di desorbire l’HFA dalla resina DAX-8 usando acetone anziché 0,1 M NaOH14. Gli autori hanno affermato che utilizzando il 50% di acetone come desorbente al posto di NaOH, è stato ottenuto un risultato HFA simile e il DAX-8 è stato adeguatamente rigenerato e quindi la fase di scambio H + potrebbe essere eliminata. Questa modifica ha comportato un tempo di analisi notevolmente ridotto a causa della diminuzione del volume prodotto e dell’evaporazione rotativa più rapida dell’acetone rispetto all’acqua. Questa modifica merita ulteriori studi.
Questo metodo è limitato all’analisi della materia organica che ha subito il processo di umificazione e, per il caso della torba e dei carboni molli, agli ulteriori processi di torba e sia alla torificazione che alla coalificazione, rispettivamente. L’umificazione è il processo per cui il materiale morto, principalmente vegetale, viene decomposto da una sequenza di microbi che consumano e modificano substrati sempre più recalcitranti. I processi abiotici partecipano anche alle reazioni di decomposizione e risintetizzazione. L’umificazione alla fine si traduce nella produzione di materiali relativamente recalcitranti che comprendono miscele eterogenee di migliaia di molecole che formano una gamma di peso molecolare e contenuti di carbonio, ossigeno e idrogeno che formano HS. Gli HS sono ulteriormente modificati dalla torificazione e dalla coalificazione. Pertanto, questo metodo non è appropriato per i materiali vegetali che sono stati modificati da processi chimici. Ad esempio, il lignosolfonato è ampiamente usato come adulterante HFA. Il lignosolfonato è un sottoprodotto del processo di polpa del solfito. Pertanto, questo materiale non è stato prodotto dal processo di umificazione. Inoltre, ci sono molte sostanze che si legano alla resina DAX-8. Ad esempio, la resina DAX-8 è stata utilizzata per assorbire pesticidi dalla soluzione15. Ovviamente, i pesticidi non sono HS. Pertanto, la legatura di un materiale alla resina DAX-8 non giustifica l’affermazione che si tratti di un HFA. I prerequisiti sono sia la produzione mediante umificazione che il legame alla resina DAX-8.
Man mano che si impara di più sul contributo dei vari componenti di HS in diverse applicazioni, può diventare vantaggioso frazionare ulteriormente HS e quindi modificare il metodo di conseguenza. Così com’è, il metodo non quantifica l’HYFA. Tuttavia, questa frazione potrebbe anche avere attività, ad esempio nella biostimolazione delle piante, dove l’intero FF viene generalmente applicato nei trattamenti agricoli piuttosto che nell’HFA purificato.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l’Humic Products Trade Association (HPTA) per il loro sostegno nel finanziamento del lavoro che ha portato alla standardizzazione dei metodi descritti in questo documento e anche Lawrence Mayhew e i dottori Dan Olk e Paul Bloom per il supporto tecnico durante il lavoro di standardizzazione.
Materials
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3˚C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618–03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
Referenzen
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