Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles
Summary
Demostramos pruebas de toxicidad algas para sustancias difíciles (por ejemplo, sustancias de color o nanomateriales) utilizando una configuración iluminada verticalmente con un LED.
Abstract
Los datos de ecotoxicidad son un requisito para el registro previo y posterior al mercado de productos químicos por normativa europea e internacional (por ejemplo, REACH). El ensayo de toxicidad de algas se utiliza con frecuencia en la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. Con el fin de lograr una alta fiabilidad y reproducibilidad, el desarrollo de directrices estandarizadas es vital. Para las pruebas de toxicidad de algas, las directrices requieren condiciones estables y uniformes de parámetros como el pH, la temperatura, los niveles de dióxido de carbono y la intensidad de la luz. Los nanomateriales y otras sustancias llamadas difíciles pueden interferir con la luz causando una gran variación en los resultados obtenidos que obstaculiza su aceptación regulatoria. Para hacer frente a estos desafíos, hemos desarrollado LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuración utiliza iluminación LED desde abajo, lo que permite una distribución homogénea de la luz y un control de temperatura, al mismo tiempo que minimiza el sombreado intramuestra. La configuración optimiza el volumen de la muestra para la cuantificación de la biomasa y garantiza al mismo tiempo una afluencia suficiente deCO2 para apoyar el crecimiento exponencial de las algas. Además, el material de los contenedores de prueba se puede adaptar para minimizar la adsorción y la volatilización. Al probar sustancias de color o suspensiones de partículas, el uso de luces LED también permite aumentar la intensidad de la luz sin generación de calor adicional. El diseño compacto y los requisitos mínimos de equipamiento aumentan las posibilidades de implementación del LEVITATT en una amplia gama de laboratorios. Si bien cumplió con las directrices estandarizadas de ISO y la OCDE para las pruebas de toxicidad de algas, LEVITATT también mostró una menor variabilidad entre muestras para dos sustancias de referencia (3,5-Dicholorophenol y K2Cr2O7)y tres nanomateriales (ZnO, CeO2y BaSO4)en comparación con los matraces y las placas de microtíter Erlenmeyer.
Introduction
El ensayo de toxicidad por algas es uno de los tres únicos ensayos obligatorios utilizados para generar los datos de ecotoxicidad necesarios para el registro antes y después del mercado de productos químicos por normativas europeas e internacionales (por ejemplo, REACH1 y TSCA (EE.UU.)). Para ello, las organizaciones internacionales han elaborado directrices estandarizadas de pruebas de algas (por ejemplo, ISO y OCDE). Estas normas y directrices de prueba prescriben condiciones de prueba ideales en términos de pH, temperatura, niveles de dióxido de carbono e intensidad de la luz. Sin embargo, mantener condiciones de ensayo estables durante las pruebas de algas es en la práctica difícil y los resultados sufren problemas de reproducibilidad y fiabilidad para una serie de sustancias químicas y nanomateriales (a menudo denominados “sustancias difíciles”)2. La mayoría de las configuraciones de pruebas de toxicidad de algas existentes funcionan con volúmenes relativamente grandes (100-250 ml) situados en un agitador orbital dentro de una incubadora. Tal configuración limita el número de concentraciones de prueba y replica volúmenes alcanzables y altos de cultivo de algas y material de prueba. Además, estas configuraciones rara vez tienen un campo de luz uniforme y las condiciones de iluminación fiables son además difíciles de obtener en frascos grandes, en parte como la intensidad de la luz disminuye exponencialmente cuanto más viaja la luz y en parte debido a la geometría del matraz. Las configuraciones alternativas comprenden microtíteres de plástico3 placas que contienen pequeños volúmenes de muestra que no permiten volúmenes de muestreo adecuados para medir el pH, mediciones adicionales de biomasa, extracción de pigmentos u otros análisis que requieren muestreo destructivo. Un desafío particular utilizando las configuraciones existentes para las pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y sustancias que forman suspensiones de color es la interferencia o el bloqueo de la luz disponible para las células de algas, a menudo denominada “sombreado”4,,5. El sombreado puede ocurrir dentro de los viales por el material de prueba y/o interacciones entre el material de ensayo y las células de algas, o el sombreado puede ocurrir entre viales, debido a su posicionamiento en relación entre sí y la fuente de luz.
El método se basa en la configuración de la prueba de toxicidad de algas a pequeña escala introducida por Arensberg et al.6 que permite realizar pruebas de conformidad con normas como la OCDE 2017e ISO 86928. El método se optimiza aún más para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente por: 1) utilizando la tecnología de luz LED para garantizar condiciones de luz uniformes con una generación de calor mínima, 2) proporcionando un volumen de muestra adecuado para el análisis químico/biológico manteniendo un pH constante, niveles deCO2 y 3) lo que permite el uso de material contenedor de ensayo versátil para pruebas de sustancias volátiles o sustancias con un alto potencial de sorción.
Protocol
Representative Results
Discussion
El fitoplancton convierte la energía solar y el dióxido de carbono en materia orgánica y, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el ecosistema acuático. Por esta razón, las pruebas de inhibición de la tasa de crecimiento de algas se incluyen como una de las tres pruebas de toxicidad acuática obligatorias necesarias para la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. La capacidad de realizar un ensayo de toxicidad de algas fiable y reproducible es clave a este respecto. Las configurac…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, acuerdo de subvención 760813 bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40×40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referenzen
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality – Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals – toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O’Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum–capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O’Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
