Isolamento e cultura dei neuroni primari e degli glia dalla vescica urinaria del ratto adulto
Summary
Questo protocollo tenta di stabilire un protocollo ripetibile per i neuroni primari e l’isolamento degli glia dalla vescica del ratto per ulteriori esperimenti cellulari.
Abstract
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali, vale a dire la conservazione periodica delle urine e la micturizione; queste funzioni sono mediate attraverso la neuroregolazione centrale e periferica. Sebbene sia stata condotta un’ampia ricerca sul sistema nervoso del tratto urinario inferiore, la maggior parte degli studi si è concentrata sulla cultura primaria. Questo protocollo introduce un metodo per l’isolamento e la coltura dei neuroni vescicali e degli glia dei ratti Sprague-Dawley. In questo metodo, i neuroni e glia sono stati incubati in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5-7 giorni. Di conseguenza, sono cresciuti in forme mature adatte ai successivi esperimenti di immunofluorescenza correlati. Le cellule sono state osservate morfologicamente usando un microscopio ottico. Neuroni, vescicole sinaptiche e glia sono stati identificati rispettivamente da β-III-tubulina e MAP-2, Synapsin-1 e GFAP. Nel frattempo, l’immunocitochimica è stata eseguita su diverse proteine correlate al neurotrasmettitore, come la colina acetiltransferasi, DYNLL2 e SLC17A9.
Introduction
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali: conservazione periodica delle urine e micturizione1. Il sistema nervoso del tratto urinario inferiore (LUTNS) controlla queste funzioni ed è delicato e suscettibile a molte neuropatie, che possono essere innate (porfiria), acquisite (malattia di Lyme), secondarie agli stati di malattia (cistopatia diabetica), indotte da farmaci (cistite emorragica), chirurgia causata (resezione addominoperineale) o lesioni causate (lesione traumatica del midollo spinale)2,3,4,5,6,7. Negli studi fisiologici/patologici, gli esperimenti in vivo e in vitro sono ugualmente importanti. Mentre la ricerca in vivo sull’LUTNS è stata condotta a livello di organo, cellulare e molecolare per qualche tempo, la ricerca in vitro sui neuroni primari della vescica urinaria è quasi inesistente8,9. Sebbene il presente studio sia limitato, speriamo di essere pionieri della ricerca in questo settore in modo che altri ricercatori possano migliorarla. In questo modo, questa co-coltura può portare a una comprensione cellulare della disfunzione fisiologica nei fenotipi, come la disfunzione neuronale della vescica.
A differenza dei muscoli enterici con una chiara direzionalità delle cellule muscolari in strati discreti, i muscoli della vescica sono disorganizzati10. Pertanto, invece di staccare lo strato esterno della vescica, questo metodo propone di digerire l’intera vescica per ridurre la difficoltà di funzionamento e abbreviare i tempi di pre-elaborazione per un alto tasso di sopravvivenza cellulare.
Seguendo questo metodo, possiamo ottenere una coltura mista di neuroni e altre cellule. Le altre cellule sono indispensabili perché la loro presenza imita un ambiente in vivo11. Inoltre, tali cellule forniscono le sostanze che non sono disponibili nel mezzo.
Questo metodo prevede due passaggi per la digestione. In primo luogo, la collagenasi di tipo II viene utilizzata per idrolizzare il collagene, seguita dalla tripparina, per dissociare il tessuto nelle cellule10. In questo modo, i tessuti della vescica vengono dispersi in singole cellule e quindi crescono relativamente indipendenti. Quando la coltura dei neuroni matura, i neuroni possono essere utilizzati per l’imaging o test funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparazione piastra
L’uso di coverlips in vetro in piastre di coltura da 6, 12 o 48 pozzi per esperimenti di imaging immunofluorescente o di calcio è un’operazione economica e parsimonioso. Le cellule crescono bene in piastre senza coverlips durante la preparazione di colture cellulari primarie. Pertanto, le coverlips sono dispensabili in esperimenti, come la macchia occidentale o la reazione a catena della polimerasi. Inoltre, il rivestimento è un passo necessario prima di placcare le celle, con o…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (Grant n. 81673676) e dal Dongguan Science and Technology Bureau (Grant n. 2019622101002). Gli autori ringraziano la Dott.ssa Maryrose Sullivan (Assistente professore in Chirurgia, Harvard Medical School) per la consulenza tecnica.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
Referenzen
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
