Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

1. Volar la producción de alimentos Por cada 1 L de agua, preparar alimentos para moscas que consistan en 4,69 g de melaza seca, 19,70 g de levadura activa seca, 87,22 g de harina de maíz y 7,83 g de agar. Combine el contenido mencionado anteriormente en un crockpot y gire el calor a 250 oF. Se añaden mezclas e ingredientes. Mantenga la tapa en el crockpot mientras el alimento para moscas se calienta mientras que también mezcla el contenido cada 10 minutos hasta que llegue a un hervor rodante. Deje que el hervor continúe durante 20 minutos antes de apagar el fuego. Añadir 83,60 ml de agua y mantener la tapa de la olla se enfríe mientras se enfría la comida. Mezclar y registrar la temperatura del alimento cada 10 minutos con un termómetro de vidrio. Evite dejar que una capa de película se asiente encima de la comida. Una vez que el alimento se haya enfriado a 60 oC, añadir 10,44 ml de Tegosept y 5,51 ml de ácido propiónico por litro de agua añadido (ver paso 1.1). Mezcle bien y gire el calor hasta 60 oC para evitar que los alimentos se vuelvan demasiado fríos. Bombee los alimentos para moscas según sea necesario utilizando el Droso-filler. Para viales estrechos, bombee 10 ml y para botellas inferiores cuadradas de 6 oz bombee 60 ml. 2. Recolectar moscas de la edad definida Monitorear las botellas de moscas de tipo salvaje almacenadas a 25 oC durante 5-7 días hasta que se adhieran grandes cantidades de pupa (alrededor de 200 pupa) al lado de la botella. Las botellas utilizadas son botellas drosophila de 6 oz con fondos cuadrados. Borre a los adultos existentes de la botella. O bien inclina a los adultos en una botella nueva o colóquelos en 70% etanol. Usa el extremo opaco de un pincel #0 para empujar a los adultos restantes a los alimentos para moscas. Asegúrese de limpiar el cepillo de pintura con 70% de etanol antes y después de los usos. Deje que las botellas despejadas se sienten durante 3 días en una incubadora de 25 oC para permitir que la próxima generación se eclose. Estas moscas tendrán entre 0 y 3 días de edad. 3. Separación de moscas Después de 3 días, separar los machos de las hembras y recoger el número deseado para cada sexo para cada uno de los cuatro puntos de tiempo. Las moscas se pueden diferenciar por sexo examinando los genitales; los machos tienen genitales redondeados oscuros, mientras que las hembras tienen genitales más claros y puntiagudos. Las hembras también son mucho más grandes que las moscas macho. Utilice una almohadilla de anestesia de CO2 para separar eficazmente las moscas y diferenciar entre los sexos. Mueve las moscas con pinceles para evitar matarlas. Recoger 100 machos y 100 hembras por cada punto de tiempo, con 50 machos por vial y 100 hembras por vial. Los hombres tienden a ser más agresivos y sus interacciones sociales conducen a muchas muertes cuando hay 100 individuos en un vial. Las hembras-hasta 100 individuos- no se ven afectadas mientras están contenidas en el vial. Realice las colecciones en los siguientes puntos de tiempo: ZT1, ZT7, ZT13 y ZT19 (Tabla 1). Tenga en cuenta que las colecciones realizadas en la oscuridad (ZT12-ZT24) son sensibles a las luces, mientras que las colecciones ZT0-ZT11 se realizan durante las horas de encendido y las luces de la habitación pueden estar encendidas. Tenga en cuenta que se utilizan dos incubadoras separadas con patrones de luz inversa de 12 horas para permitir que todas las colecciones se produzcan durante el día y no durante la noche. Usa moscas sobrantes para crear nuevas botellas de moscas para futuras entrainment. Colocar 25 hembras con 5-7 machos en cada botella nueva y colocar en la incubadora a 25oC. 4. Incubación de moscas Permita que las moscas permanezcan en incubadoras reguladas por la luz durante 3-5 días para permitir que se produzca el entrenamiento circadiano. Asegúrese de que las incubadoras sean ligeras porque incluso pequeñas cantidades de contaminación lumínica perturbarán el arrastre. 5. Fijación de inmunofluorescencia Después del entrenamiento, preparar nuevos viales de solución de fijación para muestras que se utilizarán para la inmunofluorescencia. Antes de retirar las moscas de la incubadora, añadir 4,8 ml de 4% de formaldehído diluido en 1x PBS + 0,1% Tween-20 a cada nuevo vial estrecho por cada 100 moscas que se van a fijar. Cada vial albergará 100 moscas circadianas machos o 100 hembras circadianas. Coloque los viales estrechos en hielo. 6. Recolección de inmunofluorescencia Cuando recoja las moscas de la incubadora para la inmunofluorescencia, retire la tapa del frasco e invierta rápidamente la botella en el embudo. Toque suavemente las moscas en la solución a través del embudo para ayudar a guiar a las moscas hacia el vial; combinar dos tubos de los 50 machos para un total de 100 machos en un vial y utilizar un solo tubo de 100 hembras para el otro vial. Realizar colecciones ZT13 y ZT19 en la oscuridad; utilizar una luz roja para ver como drosophila son mucho menos sensibles a estas longitudes de onda de luz y por lo tanto son menos propensos a la contaminación lumínica13. La proteína criptocroma, en particular, es especialmente sensible a la luz azul, que debe evitarse14. Para reducir la exposición a la luz, asegúrese de que la habitación de recogida esté ligeramente apretada con cualquier fuente de luz bloqueada o cubierta. Envuelva estos viales en papel de aluminio para que las moscas ZT13 y ZT19 no se expongan a la luz cuando se coloquen en el mezclador nutating en el siguiente paso. Las moscas ZT1 y ZT7 no son sensibles a la luz y se pueden colocar en la mezcladora sin cubierta de papel de aluminio. 7. Mezclador y almacenamiento de nutating Una vez recogidas las moscas, pegue la parte superior de los viales que contienen fijador para evitar derrames y colóquelos en el mezclador nutating a 165 RPM a 4 oC durante 4 h. Las moscas ya no son sensibles a la luz después de este paso de fijación, por lo que la lámina se puede quitar para verificar que la solución se está moviendo y las moscas están siendo sumergidas en el fijador. Después de retirar la mosca que contiene los viales de la mezcladora nutrida, retire el formaldehído y lave tres veces con 3.000 l de 1x PBS, invirtiendo el vial con cada lavado. Almacene los viales con muestras de inmunofluorescencia a 4 oC para esperar la inmunofluorescencia futura15. 8. Colección para la extracción de proteínas Preparar cuatro tubos de 50 ml y un Dewar que contenga nitrógeno líquido para la preservación de muestras para la extracción de proteínas Para recoger moscas para la extracción de proteínas o ácido nucleico, transfiera las moscas de las botellas al tubo de la misma manera que en el paso 6.1 y tapice rápidamente el tubo para evitar la liberación de moscas y coloque el tubo en nitrógeno líquido para congelar rápidamente. 9. Almacenamiento para la extracción de proteínas Almacene las muestras congeladas para la extracción de proteínas a -80 oC. Estos pueden ser procesados de acuerdo con el protocolo de extracción de proteínas apropiado para el análisis posterior, incluyendo inmunoblotting16.