Circadiano De Drosophila Melanogaster

1. Produção de alimentos voadores Por cada 1 L de água, prepare comida de mosca composta por 4,69 g de melaço seco, 19,70 g de levedura ativa seca, 87,22 g de farinha de milho e 7,83 g de ágar. Misture o conteúdo listado acima em um pote e gire o calor para 250 °F. Misture bem como os ingredientes são adicionados. Mantenha a tampa sobre o pote de crock, pois o alimento de mosca está aquecendo, ao mesmo tempo em que mistura o conteúdo a cada 10 minutos até chegar a uma fervura. Deixe a fervura de rolamento continuar por 20 minutos antes de desligar o fogo. Adicione 83,60 mL de água e mantenha a tampa do pote de crockpot fora enquanto a comida esfria. Misture e regisse a temperatura do alimento a cada 10 minutos com um termômetro de vidro. Evite deixar uma camada de filme se acomodar em cima da comida. Uma vez que o alimento tenha esfriado a 60 °C, adicione 10,44 mL de Tegosept e 5,51 mL de ácido propínico por litro de água adicionado (ver passo 1.1). Misture bem e aumente o calor até 60 °C para evitar que a comida fique muito fria. Bombeie a comida de mosca conforme necessário usando o enchimento Droso. Para frascos estreitos, bombeie 10 mL e para garrafas de fundo quadrados de 6 oz bombear 60 mL. 2. Coleta de moscas de idade definida Monitore garrafas de moscas do tipo selvagem armazenadas a 25 °C por 5-7 dias até que grandes quantidades de pupa (cerca de 200 pupas) sejam anexadas ao lado da garrafa. As garrafas utilizadas são garrafas de calção Drosophila de 6 oz com fundo quadrado. Limpe os adultos existentes da garrafa. Ou coloca os adultos em uma garrafa nova ou coloca-os em 70% de etanol. Use a extremidade maçante de um pincel #0 para empurrar todos os adultos restantes para a comida de mosca. Certifique-se de limpar a escova de tinta com 70% de etanol antes e depois dos usos. Deixe as garrafas limpas descansarem por 3 dias em uma incubadora de 25 °C para permitir que a próxima geração se esclae. Estas moscas terão entre 0 e 3 dias de idade. 3. Separação de moscas Após 3 dias, separe os machos das fêmeas e colete o número desejado para cada sexo para cada um dos quatro pontos de tempo. As moscas podem ser diferenciadas pelo sexo examinando a genitália; os machos têm genitália arredondada escura, enquanto as fêmeas têm genitálias mais claras e pontiagudas. As fêmeas também são muito maiores que moscas machos. Use uma almofada de anestesia de CO2 para separar efetivamente as moscas e diferenciar entre os sexos. Mova as moscas com pincéis de tinta para evitar matá-las. Coletar 100 machos e 100 fêmeas para cada ponto de tempo, com 50 machos por frasco e 100 fêmeas por frasco. Os machos tendem a ser mais agressivos e suas interações sociais levam a muitas mortes quando há 100 indivíduos em um frasco. As fêmeas, com até 100 indivíduos, não são afetadas enquanto estão contidas no frasco. Realizar as coletas nos seguintes pontos de tempo: ZT1, ZT7, ZT13 e ZT19(Tabela 1). Observe que as coleções feitas no escuro (ZT12-ZT24) são sensíveis à luz, enquanto as coleções ZT0-ZT11 são feitas durante os horários de luz e as luzes da sala podem ser acesas. Observe que duas incubadoras separadas são usadas com padrões de luz inversos de 12 horas para permitir que todas as coleções ocorram durante o dia e não durante a noite. Use moscas em excesso para criar novas garrafas de moscas para futuras entranhas. Coloque 25 fêmeas com 5-7 machos em cada garrafa nova e coloque na incubadora a 25 °C. 4. Incubação de moscas Permita que as moscas permaneçam em incubadoras regulamentadas à luz por 3-5 dias para permitir que a entrada circadiana ocorra. Certifique-se de que as incubadoras são leves porque mesmo pequenas quantidades de poluição luminosa perturbarão a entrada. 5. Fixação de imunofluorescência Após a entrada, prepare novos frascos de solução de fixação para amostras que serão utilizadas para imunofluorescência. Antes de remover as moscas da incubadora, adicione 4,8 mL de 4% de formaldeído diluído em 1x PBS + 0,1% Tween-20 a cada novo frasco estreito para cada 100 moscas que devem ser fixadas. Cada frasco abrigará 100 moscas circadianas machos ou 100 fêmeas. Coloque os frascos estreitos no gelo. 6. Coleta de imunofluorescência Ao coletar as moscas da incubadora para imunofluorescência, remova a tampa da garrafa e inverta rapidamente a garrafa no funil. Toque suavemente as moscas na solução através do funil para ajudar a guiar as moscas para o frasco; combinar dois tubos dos 50 machos para um total de 100 machos em um frasco e usar um único tubo de 100 fêmeas para o outro frasco. Realizar coleções ZT13 e ZT19 no escuro; usar uma luz vermelha para ver como a drosophila são muito menos sensíveis a esses comprimentos de onda de luz e, portanto, são menos propensas à poluiçãoluminosa 13. A proteína criptocromática, em particular, é especialmente sensível à luz azul, que deve ser evitada14. Para reduzir a exposição à luz, certifique-se de que o quarto de coleta esteja leve e apertado com quaisquer fontes de luz bloqueadas ou cobertas. Enrole estes frascos em papel alumínio para que as moscas ZT13 e ZT19 não sejam expostas à luz quando colocadas no misturador de nozes na etapa seguinte. As moscas ZT1 e ZT7 não são sensíveis à luz e podem ser colocadas na batedeira sem cobertura de papel alumínio. 7. Misturador e armazenamento de nozes Depois que as moscas tiverem sido coletadas, tape a parte superior dos frascos contendo fixação para evitar derramamento e coloque-as na batedeira de nozes a 165 RPM a 4 °C por 4h. As moscas não são mais sensíveis à luz após esta etapa de fixação, por isso a folha pode ser removida para verificar se a solução está se movendo e as moscas estão sendo submersas no fixador. Depois de remover a mosca contendo frascos da batedeira de nozes, remova o formaldeído e lave três vezes com 3.000 μL de 1x PBS, invertendo o frasco a cada lavagem. Armazene os frascos com amostras de imunofluorescência a 4 °C para aguardar a futura imunofluorescência15. 8. Coleta para extração de proteínas Prepare quatro tubos de 50 mL e um Dewar contendo nitrogênio líquido para preservação de amostras para extração de proteínas Para coletar moscas para extração de proteína ou ácido nucleico, transfira moscas das garrafas para o tubo da mesma forma que na etapa 6.1 e tampar rapidamente o tubo para evitar a liberação de moscas e colocar o tubo em nitrogênio líquido para congelar. 9. Armazenamento para extração de proteínas Armazene amostras congeladas para extração de proteínas a -80 °C. Estes podem ser processados de acordo com o protocolo de extração de proteínas apropriado para análise a jusante, incluindo a imunoblotação16.