Circadian Entrainment von Drosophila Melanogaster

1. Fliegenfutterproduktion Pro 1 L Wasser, zubereiten Fliegenfutter bestehend aus 4,69 g getrockneten Melasse, 19,70 g trockene aktive Hefe, 87,22 g Maismehl und 7,83 g Agar. Kombinieren Sie den oben aufgeführten Inhalt in einem Topf topf und drehen Sie die Hitze auf 250 °F. Mischen Sie gut und Zutaten hinzugefügt werden. Halten Sie den Deckel auf dem Topf, wie die Fliege Nahrung erhitzt wird, während auch mischen Sie den Inhalt alle 10 min, bis es ein rollendes Kochen erreicht. Lassen Sie das Walzen 20 min weiterlaufen, bevor Sie die Hitze ausschalten. 83,60 ml Wasser hinzufügen und den Deckel des Topfes abhalten, wenn das Essen abkühlt. Mischen und notieren Sie die Temperatur des Lebensmittels alle 10 min mit einem Glasthermometer. Vermeiden Sie es, eine Schicht Film auf dem Essen absetzen zu lassen. Sobald das Essen auf 60 °C abgekühlt ist, fügen Sie 10,44 ml Tegosept und 5,51 ml Propionsäure pro Liter Wasser hinzu (siehe Schritt 1.1). Gut mischen und bis zu 60 °C wärmen, um zu verhindern, dass das Essen zu kühl wird. Pumpen Sie das Fliegenfutter nach Bedarf mit dem Droso-Füllstoff. Für schmale Fläschchen, Pumpe 10 ml und für 6 Unzen quadratische Bodenflaschen Pumpe 60 ml. 2. Sammeln von Fliegen definierten Alters Überwachen Sie Flaschen von Wildfliegen, die 5-7 Tage lang bei 25 °C gelagert werden, bis große Mengen Pupa (ca. 200 Welpen) an der Seite der Flasche befestigt sind. Die verwendeten Flaschen sind 6 oz Drosophila Lagerflaschen mit quadratischen Böden. Löschen Sie bestehende Erwachsene aus der Flasche. Entweder die Erwachsenen in eine neue Flasche kippen oder in 70% Ethanol geben. Verwenden Sie das stumpfe Ende eines #0 Pinsels, um alle verbleibenden Erwachsenen in das Fliegenfutter zu schieben. Achten Sie darauf, den Pinsel vor und nach dem Einsatz mit 70% Ethanol abzuwischen. Freigegebene Flaschen 3 Tage in einem 25 °C-Inkubator sitzen lassen, damit die nächste Generation ausschließen kann. Diese Fliegen werden zwischen 0 und 3 Tage alt sein. 3. Fliegentrennung Nach 3 Tagen, trennen Männchen von Weibchen und sammeln die gewünschte Zahl für jedes Geschlecht für jeden der vier Zeitpunkte. Fliegen können durch die Untersuchung von Genitalien nach Geschlecht unterschieden werden; Männchen haben dunkel abgerundete Genitalien, während Weibchen hellere, spitzere Genitalien haben. Weibchen sind auch viel größer als männliche Fliegen. Verwenden Sie ein CO2-Anästhesiepad, um die Fliegen effektiv zu trennen und zwischen den Geschlechtern zu unterscheiden.2 Bewegen Sie die Fliegen mit Pinsel, um zu vermeiden, sie zu töten. Sammeln Sie 100 Männchen und 100 Weibchen für jeden Zeitpunkt, mit 50 Männchen pro Durchstechflasche und 100 Weibchen pro Durchstechflasche. Männer neigen dazu, aggressiver zu sein und ihre sozialen Interaktionen führen zu vielen Todesfällen, wenn es 100 Personen in einer Durchstechflasche gibt. Die Weibchen bis zu 100 Individuen sind nicht betroffen, während sie in der Durchstechflasche enthalten sind. Führen Sie die Sammlungen zu folgenden Zeitpunkten durch: ZT1, ZT7, ZT13 und ZT19 (Tabelle 1). Beachten Sie, dass Sammlungen im Dunkeln (ZT12-ZT24) lichtempfindlich sind, während ZT0-ZT11-Kollektionen während der Lichteinlaufzeiten durchgeführt werden und Raumleuchten eingeschaltet sein können. Bitte beachten Sie, dass zwei separate Inkubatoren mit inversen 12-Stunden-Lichtmustern verwendet werden, damit alle Sammlungen tagsüber und nicht über Nacht stattfinden können. Verwenden Sie überschüssige Fliegen, um neue Flaschen von Fliegen für zukünftige Entrainment zu erstellen. 25 Weibchen mit 5-7 Männchen in jede neue Flasche geben und bei 25 °C in den Inkubator stellen. 4. Fliegeninkubation Lassen Sie die Fliegen 3-5 Tage in lichtregulierten Inkubatoren bleiben, damit zirkadiane Eingriffe auftreten können. Stellen Sie sicher, dass die Inkubatoren lichtdicht sind, da selbst geringe Mengen an Lichtverschmutzung die Einbahnung stören. 5. Immunfluoreszenzfixierung Nach der Einschulung neue Fläschchen mit Fixierlösung für Proben vorbereiten, die zur Immunfluoreszenz verwendet werden. Bevor Sie die Fliegen aus dem Inkubator entfernen, fügen Sie 4,8 ml 4% Formaldehyd in 1x PBS + 0,1% Tween-20 zu jeder neuen schmalen Durchstechflasche für jede 100 Fliegen, die fixiert werden sollen. Jede Durchstechflasche wird 100 männliche oder 100 weibliche circadian entrained Fliegen beherbergen. Legen Sie die schmalen Fläschchen in Eis. 6. Immunfluoreszenz-Sammlung Beim Sammeln der Fliegen aus dem Inkubator für Immunfluoreszenz, entfernen Sie die Flaschenkappe und schnell die Flasche in den Trichter invertiert. Tippen Sie vorsichtig die Fliegen in die Lösung über den Trichter, um die Fliegen in die Durchstechflasche zu führen; kombinieren Sie zwei Tuben der 50 Männchen für insgesamt 100 Männchen in einer Durchstechflasche und verwenden Sie eine einzige Röhre von 100 Weibchen für die andere Durchstechflasche. Führen Sie ZT13- und ZT19-Kollektionen im Dunkeln durch; verwenden Sie ein rotes Licht, um zu sehen, wie Drosophila sind weit weniger empfindlich auf diese Lichtwellenlängen und sind daher weniger anfällig für Lichtverschmutzung13. Insbesondere Cryptochrome-Protein ist besonders empfindlich gegenüber blauem Licht, das vermieden werden muss14. Um die Lichteinstrahlung zu reduzieren, stellen Sie sicher, dass der Raum der Sammlung hell dicht ist, wenn lichtdurchetzte oder abgedeckte Lichtquellen vorhanden sind. Wickeln Sie diese Fläschchen in Folie, so dass die ZT13- und ZT19-Fliegen im folgenden Schritt nicht dem Licht ausgesetzt sind, wenn sie auf den Nutmischer gelegt werden. ZT1- und ZT7-Fliegen sind nicht lichtempfindlich und können ohne Folienabdeckung auf den Mischer gelegt werden. 7. Nuten Mischer und Lagerung Nachdem die Fliegen gesammelt wurden, kleben Sie die Oberseite der Fläschchen, die fixativ sind, um Verschüttungen zu vermeiden, und legen Sie sie bei 165 Umdrehungen/min bei 4 °C für 4 h auf den Nutmischer. Die Fliegen sind nach diesem Fixierungsschritt nicht mehr lichtempfindlich, sodass Folie entfernt werden kann, um zu überprüfen, ob sich die Lösung bewegt und Fliegen in das Fixierungsmittel eingetaucht werden. Nach dem Entfernen der Fliege mit Fläschchen aus dem Nutmischer entfernen Sie das Formaldehyd und waschen Sie dreimal mit 3.000 l 1x PBS, wobei die Durchstechflasche mit jeder Wäsche invertiert wird. Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit Immunfluoreszenzproben bei 4 °C auf, um die zukünftige Immunfluoreszenz15abzuwarten. 8. Sammlung zur Proteinextraktion Bereiten Sie vier 50 ml-Röhrchen und einen Dewar-haltigen flüssigen Stickstoff zur Konservierung von Proben für die Proteinextraktion vor Zum Sammeln von Fliegen für die Protein- oder Nukleinsäureextraktion, übertragen Sie Fliegen von den Flaschen in das Rohr in der gleichen Weise wie in Schritt 6.1 und schnell kappen sie das Rohr, um die Freisetzung von Fliegen zu verhindern und legen Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff, um gefrieren. 9. Lagerung für die Proteinextraktion Snap-Gefrorene Proben für die Proteinextraktion bei -80 °C lagern. Diese können gemäß dem für die nachgelagerte Analyse geeigneten Proteinextraktionsprotokoll verarbeitet werden, einschließlich Immunoblotting16.