JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)

Published: May 08, 2020
doi:
10.3791/61147
, , , , , ,
1Institute of Science and Technology Austria

Summary

Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.

Abstract

Beginnend bij een beperkte pool van voorouders, vormt de hersenschors van zoogdieren zeer georganiseerde functionele neurale circuits. Echter, de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen reguleren van de overgang van de afstamming van neurale stamcellen (NSC’s) en de uiteindelijke productie van neuronen en glia in de zich ontwikkelende neuroepithelium blijft onduidelijk. Methoden om NSC-divisiepatronen te traceren en de afstamming van clonally gerelateerde cellen in kaart te brengen, zijn dramatisch gevorderd. Echter, veel hedendaagse lineage tracing technieken lijden aan het gebrek aan cellulaire resolutie van nakomelingen cel lot, dat essentieel is voor het ontcijferen van voorloper celdeling patronen. Gepresenteerd is een protocol met behulp van mozaïek analyse met dubbele markers (MADM) uit te voeren in vivo kloon analyse. MADM manipuleert gelijktijdig individuele voorlopercellen en visualiseert nauwkeurige delingpatronen en lijnprogressie bij ongekende single cell resolutie. MADM-gebaseerde interchromosomale recombinatie gebeurtenissen tijdens de G2-X fase van mitose, samen met tijdelijk inducible CreERT2, bieden exacte informatie over de geboortedata van klonen en hun verdeling patronen. Zo biedt MADM lineage tracing ongekende kwalitatieve en kwantitatieve optische uitlezingen van de proliferatiemodus van stamcelverervertellers op het niveau van één cel. MADM maakt het ook mogelijk voor onderzoek van de mechanismen en functionele eisen van kandidaat-genen in NSC-afstammingprogressie. Deze methode is uniek in die vergelijkende analyse van controle en mutant subclonen kunnen worden uitgevoerd in dezelfde weefselomgeving in vivo. Hier wordt het protocol in detail beschreven en worden experimentele paradigma’s om MADM in dienst te nemen voor kloonanalyse en afstammingstracering in de zich ontwikkelende hersenschors aangetoond. Belangrijk is dat dit protocol kan worden aangepast om MADM kloonanalyse uit te voeren in elke murine stamcelniche, zolang de CreERT2-driver aanwezig is.

Introduction

De hersenschors is een zeer georganiseerde structuur bestaande uit zes verschillende lagen. De cortex bevat een breed scala aan celtypen, waaronder neuronen en glia, die interageren tot functionele neurale circuits. De meeste, zo niet alle, corticale excitatory projectie neuronen en glia zijn afgeleid van een gemeenschappelijke pool van neurale stamcellen (NSC’s) bekend als de radiale glia voorlopers (RGPs)1,2,3. RPP’s zelf zijn afgeleid van neuro-pitheliale stamcellen (NESCs) die het vroege embryonale neuroepithelium vormen. Op embryonaal dag 9 (E9) bij muizen beginnen NESC’s over te stappen naar RGPs4. RGP-lijnprogressie vereist nauwkeurige temporele en ruimtelijke regulatie, en wanneer dit proces wordt belemmerd, kunnen ernstige neurologische aandoeningen zoals megalencephalie, microcefalie, lissencephalie of stoornissen zoals schizofrenie en autisme5,6resulteren. Bij E10 ondergaan de meeste RSP’s symmetrische proliferative divisies, wat resulteert in een uitbreiding van de neurale voorloperpool4,7. RPP’s uiteindelijk beginnen te verdelen asymmetrisch, het produceren van corticale projectie neuronen in een tijdelijk gedefinieerde manier. Door opeenvolgende golven van neurogenese migreren pasgeboren neuronen naar de corticale plaat die corticale laminae vormt met vroeggeboren neuronen die diepe lagen bezetten en laatgeboren neuronen die zich in de oppervlakkige lagen8,,9,10bevinden. Omdat clonally verwante piramidale neuronen radiaal migreren naar de cortex met zeer weinig tangentiële dispersie, hebben dochtercellen de neiging om een kolom of kegelvormige structuur te vormen die wordt aangeduid als een neuronale radiale eenheid4,11,12,13. Door E17, embryonale neurogene expansie is voltooid bij muizen14. RPP’s kunnen ook ependymale cellen en sommige klassen van glia produceren, waaronder astrocyten en oligodendrocyten1,15,16,17,18,19. Het potentieel van RPP’s om zowel neuronen als astrocyten te geven lijkt consistent te zijn in alle corticale regio’s18, met ongeveer 1/6 van de neurogene ROP’s die ook glia11produceren .

Momenteel zijn de genetische en epigenetische factoren die de temporele progressie van een stamcel langs de afstamming reguleren meestal onbekend. Temporele patronen van genexpressie kunnen aanzienlijke gevolgen hebben voor de afstammingsbesluiten in RGPs20,21,22,23,24. Hoe deze hechte relatie tussen temporele en ruimtelijke patronen leidt tot de moleculaire diversiteit van volwassen neuronale types in corticale gebieden is niet bekend. Ook hoe de individuele stamcel potentieel en de cellulaire output wordt gemoduleerd op cellulair en moleculair niveau is een belangrijke onbeantwoorde vraag. Toekomstige studies zullen hopelijk een aantal van deze vragen aan te pakken, uiteindelijk het uitbreiden van ons begrip van functionele corticale circuit vorming.

Ontwikkelingsneurobiologie probeert de afstammingsrelatie te begrijpen die cellen in de hersenen met elkaar delen. Aanvankelijk waren er zeer weinig onderzoeksinstrumenten beschikbaar voor dit, en veel vroege studies gebaseerd op visuele waarnemingen van divisie patronen in transparante organismen zoals Caenorhabditis elegans25. De afgelopen decennia is het aantal en de verfijning van de beschikbare techniekenmet 13,26,27,28,29drastisch toegenomen . De opkomst van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem maakt synthetische reconstructie van cellijnrelaties mogelijk door de invoering van evoluerende DNA-barcodes27,30. Twee recente voorbeelden van barcoding strategieën zijn het gebruik van homing gids RNA dat CRISPR-Cas9 richt op specifieke DNA barcode loci of een cytidine deaminase gefuseerd met nickase Cas9 om endogene gestrooide herhaling regio’s31,32richten . Deze technologieën bieden zeer multiplexed benaderingen door de introductie van barcodes die geleidelijk en stabiel unieke mutaties in de tijd accumuleren. Genoombewerkingsbenaderingen zijn zeer waardevol omdat ze een retroactieve analyse mogelijk maken van de relatie tussen twee cellen op basis van de gedeelde overerving van deze barcodes. Echter, om de barcodes in individuele cellen te lezen, moet het weefsel meestal worden verstoord, en daarom gaat informatie over positie, morfologie en absolute celnummers van een individuele voorloper verloren.

Combinatorische etiketteringsparadigma’s behouden ruimtelijke informatie en maken in principe ook het onderscheid mogelijk tussen nauw gelokaliseerde of zelfs overlappende klonen33,34. Om een lijntraceringsmethode informatief te laten zijn, moet het individuele voorouders en hun nakomelingen op een schaarse en onuitwisbare manier etiketteren. Met name de Brainbow35 en Confetti36,37 benaderingen gebruiken stochastische veelkleurige Cre recombinase-gebaseerde verslaggevers die een combinatie van fluorescerende eiwitten uit een enkele locus uitdrukken. Het uitgebreide aantal gelijktijdige kleurencombinaties dat in vivo kan worden bereikt, maakt dit een krachtig hulpmiddel bij het traceren van corticale RGP-klonen en astrocyten34. Transposon-gebaseerde systemen die een stabiele genomische integratie van transgenes coderen fluorescerende verslaggevers en het toestaan van afstamming tracering van corticale voorouders zijn ook ontwikkeld33,38,39,40,41. Transposon-gebaseerde systemen hebben een bijkomend voordeel in die zin dat de verslaggever constructies stabiel integreren in het genoom, en daardoor betrouwbaar label lineally gerelateerde dochter cellen. Om astrocyten afstammingen specifiek te traceren, zijn een aantal methoden ontwikkeld die betrekking hebben op elektroporatie van piggyBac-transposases, waaronder Star Track, die gebruik maakt van een combinatie van constructies die verschillende fluorescerende eiwittencoderen 40,42. Een andere benadering, MAGIC markers,introduceert Brainbow vectoren als transposable transgenes. Dit is met succes gebruikt om embryonale neurale en astrocyten voorlopers34,43te traceren. Onlangs bleek mozaïekanalyse door dubbele recombinase-gemedieerde cassetteuitwisseling (MADR) om gemuteerde cellen die transgene elementen uitdrukken van precies gedefinieerde chromosomale loci44stabiel te etiketteren. Deze krachtige in vivo combinatorische etiketteringstechnieken hebben tal van inzichten opgeleverd in de afstammingsdynamiek van voorlopercellen. Deze analyses worden echter uitgevoerd op vast weefsel, waardoor een momentopname wordt gemaakt van individuele klonen in een bepaalde ontwikkelingsfase. Om veranderingen in de afstammingsdynamiek van enkele klonen in de loop van de tijd waar te nemen, moeten chronische in vivo beeldvormingsmethoden worden toegepast die vergelijkbaar zijn met die welke worden uitgevoerd in de volwassen dentate gyrus45.

Mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) is een krachtige dual color labeling methode die het mogelijk maakt in vivo lijn tracering van individuele voorloper cellen in muizen46,47. Er zijn twee componenten nodig om MADM-etiketteringsgebeurtenissen te laten plaatsvinden: Ten eerste moeten MADM-cassettes gericht zijn op identieke loci op homologe chromosomen. Cassettes bestaan uit twee chimerische tlfluorescerende reportergenen, eGFP (groen, [G]) en tandem dimer Tomato (rood, tdT[T]). De GT cassette bevat het N-eindpunt van eGFP en het C-eindpunt van tdT, gescheiden door een intron met een loxP site. De TG cassette is omgekeerd gebouwd, met het N-eindpunt van tdT en het C-eindpunt van eGFP. Ten tweede is de expressie van Cre recombinase in dezelfde cel met de beoogde MADM-cassettes essentieel. Bij afwezigheid van Credrukken de chimerische cassettes geen functionele eGFP of tdT uit omdat hun coderingssequenties worden verstoord. De loxP-sites dienen als doelwit voor cre-gemedieerde interchromosomale recombinatie, wat resulteert in de reconstructie van beide expressiecassettes tegelijk. Als recombinatie optreedt tijdens de G2-fase van de celcyclus gevolgd door X-segregatie (G2-X), zullen de twee dochtercellen elk een van de twee fluorescerende eiwitten uitdrukken. Temporele regulering van de CreERT2-activiteit met behulp van tamoxifen (TM) geeft nauwkeurige informatie over de geboortedatum van MADM-klonen en de verdelingspatronen van hun nageslacht (figuur 1A)29,46,47.

MADM kan potentieel systematisch label individuele klonen met een hoge eencellige resolutie in de muis hersenen vergelijkbaar met traditionele, maar niet-specifieke en moeizame methoden zoals Golgi kleuring48 of kleurstof vullen49. Omdat alleen de promotor die CreERT2 bestuurt de specificiteit van het celtype van kloon-MADM-etikettering bepaalt, kan MADM in principe worden toegepast voor kloonlijntracering in alle murineorgel en weefsel47,50,51,52. In studies is madm reeds gebruikt om afstammingsrelaties aan het licht te brengen in klonen47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentele paradigma’s zijn toegepast om afstamming te bestuderen in corticale projectie neuronen, glia, en postnatale stamcellen in de zich ontwikkelende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM is ook gebruikt om celstamen te bestuderen in de volwassen dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulaatcellen en interneurons op kloonniveau (zie tabel 1 voor een volledige lijst)47,53,54,56,57,66.

Een uniek kenmerk van MADM is het vermogen om mutaties distaal te koppelen aan één MADM cassette, waardoor een genetisch mozaïek ontstaat(figuur 1B en figuur 2). Dit resulteert in wilde dochtercellen van het type met een fluorescerende marker (tdT in figuur 1B)en homozygootmuts broers en zussen met de andere (eGFP in figuur 1B) in een niet-gelabelde heterozygoot omgeving. MADM is uniek in die vergelijkende analyse van controle en mutant subclonen kunnen worden uitgevoerd in dezelfde weefselomgeving in vivo. Oorspronkelijk waren MADM cassettes gericht op de Rosa26 locus47,maar MADM-analyse van de genfunctie was beperkt tot genen die distaal waren voor de locus. Om deze beperking (ten minste gedeeltelijk) te overwinnen en de mogelijkheden voor MADM-gebaseerde genanalyses uit te breiden, werden MADM-cassettes dicht bij de centromeres van Chr. 751, Chr. 1146en Chr. 1251ingeklopt . Gericht op alle 19 muis autosomen met MADM cassettes is in volle gang en zal het mogelijk maken voor vrijwel elk gen te bestuderen in de toekomst, het verstrekken van een ongeëvenaard platform voor de studie van ontwikkelingslijn relaties in combinatie met functionele genetische analyse.

Protocol

Muisprotocollen werden beoordeeld door institutionele preklinische kernfaciliteit (PCF) en interne ethische commissie van IST Oostenrijk. Alle fok- en experimenten werden uitgevoerd onder een door het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschap en Onderzoek goedgekeurde vergunning in overeenstemming met de Oostenrijkse en EU-dierenwetgeving. 1. Fokken van experimentele muizen voor CLONAL-analyse van MADM Getimede experimentele MADM-paringen instellen (>P56; CD-1) in de late namiddag (17:00 uur) en controleer op vaginale pluggen de procedure ochtend (8:00 UUR). De ochtend dat de stekker aanwezig is telt als dag 0,5. Zie figuur 2 voor een overzicht van de experimentele muisparingset. Zorg ervoor dat tijdpunten voor TM-inductie van CreERT2-activiteit en -analyse geschikt zijn om experimentele vragen aan te pakken.OPMERKING: Zie figuur 3 en representatieve resultaten hieronder voor meer informatie. Voor postnatale bemonstering, het opzetten van fokkerijen om pleegmoeders te genereren in parallel.OPMERKING: Deze moeten tot 1−2 dagen voor het opzetten van experimentele veredeling worden gestart. 2. TM-inductie bij MADM-muizen Bereid een 20 mg/mL TM werkoplossing door het op te lossen in maïsolie in een 15 mL of 50 mL conische centrifugebuis en plaats deze op een schommelplatform voor ~ 4 uur bij kamertemperatuur (RT), zodat TM volledig is opgelost. Bewaar de werkoplossing bij 4 °C bedekt met aluminiumfolie en gebruik binnen 2 weken. Om MADM recombinatie gebeurtenissen te induceren, leveren een enkele injectie van TM intraperitoneally (IP) met behulp van een 1 mL tuberculine spuit en een 25 G naald in een getimede zwangere moeder. Injecteer TM tussen E10−E15 bij een dosis van 1−2 mg/zwangere moeder. Voor vroege timepoints (d.w.z. E10) wordt maximaal 1 mg/drachtige moeder (25 mg/kg) gebruikt om complicaties tijdens de zwangerschap te voorkomen11. Gebruik voor tijdpunten tussen E11-E15 2 mg/drachtige moeder (50 mg/kg)7.OPMERKING: Als alternatief kan TM worden toegediend met een orale gavage voor late zwangerschappen. Voor MADM kloonanalyse tot postnatale tijdpunten, herstel levende embryo’s bij E18−E19 via keizersnede en voed je pups op met een pleegmoeder.OPMERKING: Afhankelijk van de gezondheidstoestand van het zwangere vrouwtje, kan het niet nodig zijn om een keizersnede uit te voeren, maar het verhogen van pups met een pleegmoeder is nog steeds nodig omdat de oorspronkelijke TM-behandelde moeder problemen kan hebben met borstvoeding. Om levende embryo’s te herstellen per keizersnede of om embryonale tijdpunten voor analyse op te halen, offer de zwangere dam op door cervicale dislocatie. Plaats het dier in een supine positie en desinfecteren bont met 70% ethanol. Maak een kleine incisie in de huid in de onderbuik boven de baarmoeder met behulp van chirurgische forceps en schaar. Maak een tweede incisie door de spieren en de buikspierwand om het buikvlies te onthullen. Verwijder de baarmoeder door het scheiden van de omliggende weefsels met een schaar. Breng intacte baarmoeder op een handschoen gevuld met warm water om de overlevingskans van het embryo te verhogen totdat elk afzonderlijk uit het amnion wordt verwijderd. Gebruik fijne getipte schaar en vingers om de baarmoederwanden zorgvuldig te openen om embryo’s vrij te geven. Snijd de navelstrengs niet te dicht bij het lichaam om uitgebreid bloedverlies te voorkomen. Als embryo’s moeten worden gebruikt voor analyse, gaat u verder met stap 3.9. Als pups moeten worden bevorderd, ga dan naar stap 2.8. Als het bevorderen vereist is, reinig de pups alvorens hen aan de pleegmoeder over te brengen. Tijdens het schoonmaken van de pups, druk zachtjes op de borst van tijd tot tijd om de ademhaling te starten. Plaats terug op een tweede handschoen gevuld met warm water om de overlevingskans te verbeteren.LET OP: Het is belangrijk om de resterende amnion en/of placenta voorzichtig te verwijderen met een papieren handdoek. Voordat je pups naar de pleegmoeder breng, verwijder je de pleegmoeder uit haar kooi, verwijder je de originele pups en vervang je de experimentele pups. Breng de pleegmoeder terug naar haar kooi.OPMERKING: Zie discussie voor aanvullende suggesties om de acceptatiegraad te verbeteren. Als genotypering nodig is, verzamel dans- of staartbiopten tussen P6−P8.OPMERKING: Voer deze stap alleen uit als proeflicenties voor dieren deze praktijk goedkeuren. 3. Weefselvoorbereiding voor MADM klonen in de hersenen OPMERKING: Ga voor experimenten met postnataalweefsel (≥P4) door naar stap 3.1. Voor embryonale timepoints en vroege postnatale (P0−P3) blijft stap 3.9. Verdoof het experimentele MADM-dier met een IP-injectie van een ketamine/xylazine/acepromazine-oplossing (respectievelijk 65 mg, 13 mg en 2 mg/kg lichaamsgewicht) en bevestig dat de muis niet reageert door de achterpoot te knijpen.OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke MADM muizen (CD-1 achtergrond) worden gebruikt voor analyse. Als genotypering nodig is, verzamel dan op dit punt oorbiopten. Plaats het verdoofde dier in de supinepositie op de perfusieoperatielade en desinfecteer bont met 70% ethanol. Om te beginnen met de operatie, zorgvuldig een incisie met schaar en chirurgische tangen door de buitenste laag van de huid en vervolgens een tweede incisie door de spierlaag. Til de punt van het borstbeen en snijd bindweefsel aan de zijkanten, het nemen van extra voorzichtigheid om te voorkomen dat het snijden van de lever. De borstholte zal zichtbaar zijn. Knip het middenrif en til op om het hart te onthullen. Zorgvuldig trim de ribbenkast en pin aan de chirurgische lade om het hart bloot te leggen. Voor pups, verwijder de ribbenkast volledig. Steek een naald met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de linkerbenedenkrikkel (bleker weefsel). Met behulp van kleine iris schaar maken een incisie aan het achterste uiteinde van het rechter atrium (donkerrood weefsel) voor het bloed af te voeren. Voer perfusie uit met PBS, onmiddellijk gevolgd door vers gemaakte, ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in PBS. Voor pups (P4−P10) gebruiken spuiten om perfusie uit te voeren. Vul een spuit met 10 mL PBS en een andere met 10 mL van 4% PFA. Zorg ervoor dat alle luchtbellen in de spuiten zijn verwijderd. Voor oudere dieren, gebruik maken van een peristaltische pomp. Begin met perfusing met PBS (10 mL bij 2−4 mL/min bij pups; 20 mL bij 4−6 mL/min voor volwassenen die een peristaltische pomp gebruiken). De lever wordt helder en lichtgeel als de naald correct is geplaatst. Zodra u klaar bent, verwijder de naald van pups en steek de naald met PFA in hetzelfde gat. Voor volwassenen, stop de peristaltische pomp voor het uitwisselen van de PBS-oplossing met ijskoude PFA, zorg ervoor dat bellen in de opnamebuizen te voorkomen. Hervat het perfusing met PFA (10 mL bij 2−4 mL/min bij pups; 30 mL bij 4−6 mL/min voor volwassenen die een peristaltische pomp gebruiken). Wanneer de perfusie is voltooid, onthoofden de muis en verwijder de hersenen door zorgvuldige dissectie. Breng hersenen over naar 4% PFA. Gebruik ten minste 5x de hersenvolumes (d.w.z. ~ 5−10 mL PFA in een 15 mL conische centrifugebuis) en incubeer ‘s nachts bij 4 °C voor postperfusiefixatie om volledige fixatie van weefsel te garanderen. Ga door naar stap 3.10. Voor embryonaal weefsel en vroeg postnataal weefsel (d.w.z. P0−P3), na het uitvoeren van een keizersnede, onthoofden de embryo’s met een schaar. Als genotypering nodig is, verzamelt u op dit punt de staart van het embryo. Ontleed onmiddellijk de hersenen en breng over op een 12 putplaat met 2−3 mL van 4% PFA/put. Incubeer ‘s nachts bij 4 °C voor postfixatie. Volgende ochtend uitwisseling PFA met 10 mL (volwassene) of 2−3 mL (embryo) van PBS en herhaal wassen 3x gedurende 15 min op RT. Breng weefsel naar 30% sacharose oplossing in fosfaat buffer (PB) en bewaar op 4 °C op een schommelplatform totdat het weefsel zinkt in de oplossing. Veranker de hersenen in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding in een inbedding schimmel, het verzorgen van de hersenen oriënteren voor ofwel coronale of sagittale sectie. Vries door het plaatsen van de inbedding schimmel op droog ijs tot OKT wordt volledig ondoorzichtig (~ 10−15 min). Bewaar weefsel bij -80 °C tot verder gebruik. 4. Bereiding van MADM-weefsel op immunohistochemie Bevestig het weefselblok aan de monsterschijf in de cryostat door een ring van OCT op de schijf aan te brengen en het blok direct in de LGO te plaatsen wanneer het begint te bevriezen. Zorg ervoor dat het blok correct is georiënteerd op het gewenste snijvlak.OPMERKING: Hier wordt coronale secties beschreven om corticale MADM-klonen te onderzoeken. Stel de bloktemperatuur in de cryostat in op -20 °C en de bladtemperatuur op -21 °C. Laat het weefselblok zich aanpassen aan de kamertemperatuur door de monsterschijf op de monsterhouder te monteren en laat in cryostat gedurende ~ 5 minuten voor aanvang van de sectie. Trim blok in dikke secties (45−60 μm) totdat het weefsel gebied van belang is bereikt. Zodra de rand van de cortex duidelijk zichtbaar is, stop sectie en vergrendel het mes. Zorg ervoor dat het mes is afgeschermd voordat u het blok bijkrimt. Trim overtollige OKT rond het weefsel met een mes, waardoor ~ 1−2 mm van OCT aan alle zijden van de hersenen. Vervolgens oriënteren het blok, zodat een van de laterale randen van de cortex is naar beneden georiënteerd en de andere naar boven (dat wil zeggen, de meest rostral rand van de cortex is gericht rechts). Begin met een sectie met een dikte van 45 μm voor volwassen klonen en 30 μm voor embryonale klonen. Voer elke sectie afzonderlijk uit en gebruik een kleine borstel om het gebied onder het mes schoon te houden van vuil dat overblijft tijdens het trimmen van het blok.OPMERKING: Als dit niet gebeurt en een sectie valt, kan het moeilijk zijn om de juiste volgorde van de segmenten te bepalen. Als secties beginnen te krullen, trim de randen van het blok en / of zorgvuldig aanpassen van de glazen antirollplaat. Voor embryonale kloonanalyse, zet secties direct aan een matte dia. Droog op een verwarmingsplaat bij 37 °C voordat u direct doorgaat naar stap 5.6.OPMERKING: Er kunnen verschillende secties aan één dia worden toegevoegd, maar zorg ervoor dat de opeenvolgende volgorde wordt gehandhaafd. Om volwassen klonen te verzamelen, bereid 24 goed platen met 1 mL PBS / goed (meestal, 5−6 platen per hersenen). De aanvang van de eerste goed, met koude tangen verzamel individuele seriële secties in PBS in de orde van het sectie.OPMERKING: De zwevende sectiemethode wordt aangenomen voor volwassen weefsel om ervoor te zorgen dat er geen secties worden gemist en dat gemonteerde secties geen rimpels bevatten. Stop met secties zodra het einde van de neocortex is bereikt. Voor volwassen klonen, ga naar de montage van drijvende secties.LET OP: Secties kunnen tot 24 uur in PBS bij 4 °C worden bewaard. 5. Montage van volwassen weefsel voor beeldvorming OPMERKING: De volgende gereedschappen zijn vereist: kleine penseel, petrischaal, PBS met 0,5% Tween (PBS-T), hechtingsdia’s (Tabel van materialen),montagemedium (Tafel van materialen),coverslips en tangen. Vul een petrischaaltje met PBS-T.LET OP: Wasmiddel wordt gebruikt om te helpen bij het montageproces. Als vlekken op extra antigenen die gevoelig zijn voor detergentia (d.w.z. glycoproteins) nodig zijn, is het het beste om de toevoeging van Tween over te slaan. Plaats een hechtingsdia in de PBS-T zodat deze bijna tot aan het etiket is bedekt. Breng het eerste deel over naar de PBS-T. Met behulp van een kleine verfborstel, manoeuvreer de sectie op de dia en schik het om de volgorde van het snijden te behouden. Ga op dezelfde manier te werk met alle verdere secties. Zodra alle secties in positie zijn, plaatst u de dia (~12−16 secties/dia) in een donkere diakamer. Til het deksel iets op om de secties volledig te laten drogen (~10−20 min), zodat ze in de volgende stappen blijven hangen. Als immunohistochemie voor extra antigenen wordt uitgevoerd, gaat u rechtstreeks naar sectie 6 of 7.OPMERKING: Voor embryonale tijdpunten is het noodzakelijk om immunostainingstappen uit te voeren voor ten minste GFP en tdT (punt 6). Voor volwassen klonen is dit alleen nodig als er parallel wordt bevlekt voor extra antigenen (secties 6 en 7). Rehydraat- en wassecties 1x met 1x PBS gedurende 5 minuten om resterende PBS-T te verwijderen. Breng ~1 mL van 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) verdund in 1x PBS (1 μg/mL) aan op de dia, zodat alle secties 15 min bedekt en incubaat zijn bedekt en incubaat. Verwijder de DAPI voorzichtig en was 1x met 1x PBS gedurende 5 minuten. Verwijder overtollige PBS en droog gedurende ~1−2 min voordat u inbedding in 110 μL van montagemedium. Verzegel met een afdekking van 24 x 60 mm en laat minstens 3 uur drogen voordat de beeldvorming wordt geüpst. 6. LET OP: Deze sectie is noodzakelijk voor embryonale klonen. Plaats dia’s horizontaal in een bevochtigde dia incubatiekamer. Markeer diagrenzen met een waxmarkering om de benodigde buffer te minimaliseren. Rehydraatsecties met 1x PBS. Om de kleurkwaliteit te verbeteren, werkt u met vers gedesneed weefsel. Voeg 250−400 μL blokkeringsbuffer (0,5% Triton X-100, 2−3% normaal ezelserum in 1x PBS) per dia toe, zodat alle secties bedekt zijn. Incubeer voor 1 uur.OPMERKING: De concentratie wasmiddel (Triton X-100 of Tween-20) zal variëren afhankelijk van de extra primaire antilichamen die worden gebruikt omdat sommige antigenen gevoeliger zijn voor detergentia dan andere. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg primaire antilichamen toe bij het blokkeren van de buffer aan de dia (300−400 μL/slide).OPMERKING: Een voorbeeld van een standaard primaire antilichaamreactie voor anti-GFP/anti-tdT (MADM) kan kipanti-GFP (1:500) en konijnanti-RFP (1:500) gebruiken. Incubeer met primaire antilichamen ‘s nachts bij 4 °C.LET OP: De glijbanen moeten perfect horizontaal worden geïncubeerd met een buffer die alle secties bedekt. Anders kan ongelijke of slechte kleuring het gevolg zijn. Bevestig de volgende ochtend dat de blokkeringsbuffer met primaire antilichamen nog steeds alle secties op de dia bedekt. Zo niet, herhaal dan de incubatiestap voor 3−4 uur bij RT. Verwijder primaire antilichamen en was 4x met 1x PBS gedurende 10 minuten bij RT. Voeg secundaire antilichamen verdund in blokkeerbuffer toe aan dia (300−400 μL/slide): Alexa Fluor 488 anti-chicken IgG (1:500) en Cy3 anti-konijn IgG (1:500). Incubeer bij RT voor 2 uur. Houd dia’s bedekt van licht om te voorkomen dat bleken van fluoroforen. Verwijder secundaire antilichamen en was 2x met 1x PBS gedurende 10 minuten. Incubeer met DAPI verdund in PBS (1:5.000) gedurende 15 min. Was secties 1x met 1x PBS gedurende 10 minuten. Verwijder overtollige PBS en droog gedurende ~1−2 min voordat u inbedding in 110 μL van montagemedium. Verzegel met 24 x 60 mm coverslip en laat minstens 3 uur drogen voordat de beeldvorming. Beeld dia’s binnen 1−2 weken na het uitvoeren van immunohistochemie om een optimaal signaal te garanderen. 7. Immunostaining voor GFP, tdT en aanvullende antigenen Voer stap 6.1−6.3 uit. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg primaire antilichamen toe bij het blokkeren van de buffer aan de dia (300−400 μL/slide).OPMERKING: Wanneer vlekken voor drie of meer antigenen (d.w.z. GFP, tdT en een eiwit van belang) en het antilichaam voor het eiwit van belang bij konijnen zijn opgeworpen, wordt aanbevolen om het anti-tdT (geit) primaire antilichaam te gebruiken bij een verdunning van 1:500. Een voorbeeld van een primaire antilichaamreactie voor drie antigenen met alternatieve tdT-kleuring kan gebruik maken van kipanti-GFP (1:500), geitenanti-tdT (1:500) en antilichaam tegen het eiwit van belang (d.w.z. konijn). Voer stap 6.5−6.7 uit. Voeg een secundaire antilichaammix toe die wordt verdund in het blokkeren van buffer om te schuiven (300−400 μL/slide): Alexa Fluor 488 anti-chicken IgG (1:500), Cy3 anti-goat IgG (1:500) en Alexa Fluor 647 anti-rabbit IgG (1:500). Voer stap 6.9−6.14 uit. 8. Confocale beeldaanwinst en kwantificering van MADM-klonen Hersensecties identificeren en documenteren met klonen en hun locaties in de cortex.OPMERKING: Het aantal secties dat een kloon omspant, is afhankelijk van wanneer de kloon is geïnduceerd, de CreERT2-driver en het tijdstip van analyse. Deze stap kan worden uitgevoerd op een confocale microscoop of een epifluorescentiemicroscoop. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, beginnen met het selecteren en configureren van de juiste laserlijnen en filters. Voor MADM-hersenen selecteert u dapi, GFP en tdT (excitatie: respectievelijk 358 nm, 488 nm en 554 nm; piekemissie: respectievelijk 461 nm, 507 nm en 581 nm). Zorg ervoor dat het gaatje is ingesteld op 1 luchtige eenheid voor een optimale beeldkwaliteit. Voor confocale specifieke instellingen, beeld klonen met een 20x doelstelling en 1x zoom. Voor afbeeldingen die worden gebruikt in kwantificeringen, gebruikt u een pixelwaarde van de scansnelheid van 1,52−2,06 μs (waarden 7−8 in de software voor het verkrijgen van afbeeldingen) zonder middeling. Pas de laserintensiteit aan en verkrijg de instellingen voor elk kanaal naar gelang van het geval.OPMERKING: Afhankelijk van de vereiste beeldkwaliteit kunnen de instellingen voor scansnelheid en middeling variëren. Zodra de kloon duidelijk is geïdentificeerd, regelen imaging tegels om alle relevante secties in de kloon te dekken. Pas de z-stack zo aan dat alle MADM gelabelde cellen in de kloon worden vastgelegd met een interval van 1,5 μm/z-stack slice. Pas het betegelde gebied zo aan dat de volledige breedte van de cortex wordt vastgelegd bij het beeldvorming van de kloon (d.w.z. van pialoppervlak naar het corpus callosum). Afbeelding afzonderlijke klonen verspreid over meerdere secties achter elkaar, ervoor te zorgen dat alle secties zonder cellen binnen een kloon nog steeds worden afgebeeld met het oog op 3D reconstructie en de juiste interpretatie van cel ruimtelijke informatie. Analyseer elke sectie met cellen van een MADM-kloon achtereenvolgens van de rostral tot het staarteinde van de cortex. Onderscheid individuele neuronen en glia op basis van hun morfologie en / of marker kleuring. Record positionele informatie parallel op basis van de respectieve laaggrenzen gedefinieerd door nucleaire kleuring (DAPI).OPMERKING: Zie figuur 4 voor representatieve resultaten voor embryonale analyse en figuur 5 voor representatieve resultaten voor analyse van volwassenen. 9. Seriële 3D-reconstructie van klonen OPMERKING: De 3D-reconstructie van individuele klonen afgebeeld over seriële hersensecties is nuttig voor visuele weergave, evenals de analyse van 3D-kloonarchitecturen en kan worden uitgevoerd volgens de volgende stappen. Steek en zekering confocale betegelde beelden op basis van acquisitieparameters met behulp van image acquisition software. Open .czi-bestand en voer de stikmethode uit onder het tabblad Verwerking in de ZEN-software (Zeiss). Exporteer gestikte afbeeldingsstapels als afzonderlijke z-vlakken in TIFF-formaat. Open het gestikte czi-bestand en voer de methode Afbeeldingsexport uit onder het tabblad Verwerken. Exporteert voor afbeeldingen met meerdere kanalen als Rood/Groen/Blauw-afbeeldingen voor volgende beeldverwerking. Herhaal stappen 9.1 en 9.2 voor elke seriële hersensectie van een kloon.OPMERKING: Voor een nauwkeurige 3D-reconstructie moeten ook alle hersensecties binnen een kloon, inclusief die zonder gelabelde cellen, worden verwerkt. Concatenate individuele beelden in een enkele stapel in volgorde te beginnen van de meest rostral tot de meest caudal z-vliegtuig met behulp van open source beeldverwerking software zoals ImageJ / Fiji67,68.OPMERKING: Alle lege afbeeldingen aan de randen van elke hersensectie moeten op dit punt worden verwijderd. Corrigeer indien nodig de beeldstapel die is verkregen uit stap 9.4 voor verkeerde uitlijning met behulp van een ImageJ-plug-in genaamd “MultiStackReg” door stap 9.5.1−9.5.5 te volgen. Als beelduitlijning niet vereist is, gaat u naar stap 9.6.OPMERKING: Deze plug-in voert beelduitlijning van het kanaal met het hoogste contrast (meestal DAPI) uit en past vervolgens de opgenomen transformatie toe op de andere kanalen, waardoor betrouwbare beelduitlijning van multichannel-stacks mogelijk is. Een hulpplug-in genaamd “TurboReg” moet vooraf worden geïnstalleerd. Installeer in ImageJ de “MultiStackReg” en “TurboReg” plugins. Open de afbeeldingsstapel van kloonafbeeldingen die zijn verkregen uit stap 9.4 om te worden uitgelijnd. Splits kanalen op in DAPI (blauw), GFP (groen) en tdT (rood) binnen de optie Kleur onder Het tabblad Afbeelding. Voer “MultiStackReg” plugin uit om het DAPI-kanaal uit te lijnen door “Rigid Body” transformatie en sla het transformatiebestand op. Pas het opgeslagen transformatiebestand toe op de andere twee kanalen met “MultiStackReg”. Voeg alle drie de uitgelijnde kanalen samen en sla uitgelijnde stack op. Om de kloon in ImageJ te oriënteren draai stapel kloonafbeeldingen verkregen uit stap 9.4 (of stap 9.5.5 na uitlijning) in een verticale oriëntatie met het pialoppervlak aan de bovenkant en het corpus callosum aan de onderkant. Snijd indien nodig in het xy-vlak. Voor zowel kwalitatieve presentatie als kwantitatieve analyse genereert u een maximaal z-projectiebeeld (stap 9.8) of voert u 3D-rendering (stap 9.9) van de kloon uit. Open in ImageJ de afbeeldingsstack vanaf stap 9.6 en selecteer de optie Z-projectie met maximale intensiteit van hetprojectietype . Dit genereert een beeld van de hele kloon geprojecteerd op hetzelfde vlak. Open in ImageJ de afbeeldingsstack vanaf stap 9.6 en selecteer 3D Project z-functie om een 3D-visualisatie van de kloon te genereren die kan worden gedraaid.OPMERKING: Het is belangrijk in deze stap om het juiste segmentinterval in te voeren dat gelijk is aan de dikte van individuele z-stacks tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. Het interpolatiegereedschap moet worden gebruikt om hiaten tussen segmenten te verwijderen.

Representative Results

MADM resulteert in de reconstructie van functionele groene en rode fluorescerende eiwitten met twee dochtercellen die elk een van de twee fluorescerende eiwitten uitdrukken op G2-X-chromosoomsegregatie(figuur 1A). Omdat MADM-gebeurtenissen resulteren in permanente en duidelijke etikettering van de twee nakomingslijn, kan een kwantificeerbare beoordeling van groene en rode dochtercellijnen (subklonen) worden uitgevoerd. Variabelen zoals het verdelingspatroon (bijvoorbeeld symmetrisch versus asymmetrisch) en het potentiële (bijvoorbeeld het aantal nakomelingen) van de oorspronkelijke voorloper kunnen worden bepaald.  Het kwantificeren van elk fluorescerend gelabeld subclone is informatief wanneer met terugwerkende kracht wordt bepaald of de oorspronkelijke voorvadercel symmetrische proliferative divisionen ondergaat, of asymmetrische, neurogene divisies op het moment van TM-inductie. Eerdere studies gegroepeerd Emx1-CreERT2 of Nestin-CreERT2 afgeleid excitatory projectie klonen in de cortex in twee brede klassen7,11,46. De eerste, genaamd “symmetrische proliferative klonen”, zijn samengesteld gemiddeld uit een aanzienlijk aantal neuronen, met zowel groene als rode subklonen met vier of meer neuronen elk. De tweede groep, “asymmetrische klonen” definieert een klasse van klonen waar de “minderheid” subclone bevat minder dan drie neuronen en de “meerderheid” subclone, vier of meer11. Deze definities zijn specifiek voor corticale RPP’s en moeten mogelijk opnieuw worden bekeken voor andere hersengebieden en weefsels. Voor beide klassen van corticale klonen, zal het nageslacht worden verdeeld over de oppervlakkige en diepe lagen. Bij het ontwerpen van MADM kloonstudies zijn er een aantal aspecten waarmee rekening moet worden gehouden. Het tijdstip waarop MADM-gebeurtenissen worden veroorzaakt door toediening van TM is een belangrijke overweging(figuur 3). Voor corticale excitatory projectie neuron MADM klonen (dat wil zeggen, met behulp van Emx1-CreERT2 of Nestin-CreERT2) op E10, bijna alle RRGPs waren nog steeds ondergaan symmetrische divisies11. Daarom, inductie op E10 met TM gevangen meerdere rondes van proliferative RGP versterking en resulteerde in klonen met hoge neuron nummers. Echter, het aantal RGPs op E10 was over het algemeen klein en dus TM administratie gegenereerd zeer weinig MADM gebeurtenissen (soms minder dan een per hersenen). De meerderheid van de RPP’s schakelde rond E12 over van symmetrische naar asymmetrische neurogene divisies. Om strikt asymmetrische neurogene klonen te targeten, was het het beste om te induceren op E12 of hoger(figuur 3). De tijd tussen TM-inductie en het observeren van MADM recombinatie gebeurtenissen in de cortex had de neiging om minder dan 24 uur. IP-injecties waren de voorkeur methode voor het toedienen van TM in embryonale stadia voor deze methode, omdat het leidde tot een grotere reproduceerbaarheid in klonale inductie. Het is ook belangrijk om de TM-dosis tot een minimum te beperken om twee redenen. Ten eerste, als de MADM recombinatie snelheid toeneemt, de kans op het induceren van meerdere, misschien overlappende, klonen is hoger. Ten tweede, als er te veel TM wordt geleverd, kan een verhoogd percentage abortus, embryo-reabsorptie en kleinere nestgroottes worden waargenomen. Abortussen bij ongeveer de helft van alle drachtige dammen werden waargenomen toen TM-injecties werden geleverd op E10. Deze frequentie daalde vanaf E11 en nam af tot ongeveer 1/3 van de zwangere dammen die afbreken. Voor een samenvatting van TM-doses, inductietijden en CreER T2-stuurprogramma’sT2 die in eerdere MADM-studies werden gebruikt, verwijzen we naar tabel 1. Reporter activiteit in de afwezigheid van TM werd waargenomen met een aantal TM-inducible CreERT2 drivers69. Ectopische expressie of MADM recombinatie gebeurtenissen in de afwezigheid van TM werd niet waargenomen met de Emx1-CreERT2 van Nestin-CreERT2 drivers. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan het feit dat TM-gemedieerde chromosomale trans-recombinaties optreden bij ongeveer 1:1.000 tot 1:10.000 lagere frequentie dan cis-recombinaties, waardoor de kans op ectopische MADM-etikettering wordt verminderd. Een andere factor om te overwegen bij het plannen van een MADM kloonanalyse experiment is de duur van de studie. Als u de tijdsduur tussen TM-inductie en het analyseren van het experiment (A) (tijdvenster) varieert, wordt de stamceldynamiek in de loop van de tijdweergegeven 64. Korte embryonale tijdvensters (d.w.z., TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) ving de dynamiek van embryonale neurogenese(figuur 4). Het vergelijken van klonen uit twee of meer tijdvensters geeft kwantitatief inzicht in het aantal geproduceerde cellen en hoe de neuronverdeling varieert in verschillende stadia van de afstammingprogressie64. Om het volledige potentieel van individuele klonen vast te leggen, is het noodzakelijk om het geanalyseerde tijdvenster uit te breiden tot postnatale of volwassen tijdpunten7,,11,12. Voorbeelden van neocorticale klonen geïnduceerd in het embryo en geanalyseerd in de volwassene worden weergegeven in figuur 5. Van nota, corticale neurogenese is meestal voltooid en gliogenese toeneemt met E17. Ongeveer 1/6 neurogene RGP gaat ook over tot het genereren van astrocyten en/of oligodendrocyten11. Symmetrische klonen treden op wanneer RPP’s een of meer rondes van proliferatieve divisie11ondergaan. RGP-klonen tussen E10−E12 waren gemiddeld groter en boden meer ruimtelijke kenmerken van de uiteindelijke neuronverdeling(figuur 4A-C). Klonen met neuronen relatief gelijkmatig verdeeld over diepe en oppervlakkige lagen nam op een “cilinder” vorm, terwijl klonen met neuronen meer verspreid in oppervlakkige lagen dan diepere lagen ontwikkelde een “kegel” vorm11. Om de ruimtelijke en morfologische informatie van een kloon volledig vast te leggen, was het noodzakelijk om elke kloon computationeel te reconstrueren met behulp van opeenvolgende beelden. Om kloonspreiding te meten, werd de maximale laterale dispersie (gemeten in alle dimensies) in oppervlakkige lagen (LII−VI) van een kloon vergeleken met neuron dispersie in diepe lagen (LV/LIV). Deze verhouding (verdeling boven:verdeling lager) zorgde voor een kwantificeerbare uitlezing van de algehele kloonvorm. Asymmetrische klonen, waar het minderheidsdeelvlies drie of minder was, gaven inzicht in de neuronale output van één RGP (figuur 4D-F en figuur 5A-F)7,11,12. De meerderheidspopulatie (grote subclone) kan worden gelabeld in rood of groen, met een gemiddelde van ongeveer zeven excitatory projectieneuronen per kloon wanneer ze worden geïnduceerd met behulp van een Emx1-CreERT2 of Nestin-CreERT2(Figuur 5G)7,11,12. Het totale aantal cellen in een MADM-kloon kan verder worden ontleed door het analyseren van de verdeling van neuronen in het grote subclone over oppervlakkige en diepe lagen. De minderheidspopulatie (klein subclone) werd aangeduid met de wederkerige kleur en was gemiddeld 1−2 cellen per kloon (figuur 5H). De totale “eenheidsgrootte”, die gemiddeld 8−9 neuronen bedroeg, kon worden berekend door de kleine en grote subkloten samen toe te voegen (figuur 5I)7,11,12. Het is belangrijk op te merken dat, terwijl de neuronale output van RGPs was zeer voorspelbaar, was er een zekere mate van kloon heterogeniteit12,70. De introductie van een mutatie distaal aan de MADM cassette maakt het genereren van genetische mozaïeken, het verstrekken van een unieke methode om de moleculaire regelgevers van stamcellijn progressie ontleden. Als zodanig biedt MADM een ongeëvenaard experimenteel platform om de celautonoome functie van een gen te bestuderen (bijvoorbeeld de associatie met microcefalie of macrocefalie). Door klonen geïnduceerd in een MADM genetisch mozaïek te vergelijken met klonen geïnduceerd in een controle MADM, kan een zeer kwantitatieve uitlezing van veranderingen in neuron nummers en distributie worden gegenereerd. Eerdere madm-gebaseerde studies kwantificeerde de cel-autonome functie van Otx1 in microcefalievorming op kloonniveau (zie figuur 6A-E voor een representatief voorbeeld)11. In een andere studie, MADM kloon analyse aangetoond dat Ndel1 niet cel-autonoom reguleren projectie neuron nummers, maar in plaats daarvan het vermogen van pasgeboren neuronen in te voeren of te migreren binnen de corticale plaat, die later vormt de volwassen cortex46. Deze studies toonden de zeer kwantitatieve aard van de Kloonanalyse van MADM aan bij het bestuderen van de cel-autonome functies van genen die corticale ontwikkeling reguleren. Er zijn momenteel geen voorbeelden in de literatuur met behulp van MADM om genen te bestuderen die betrokken zijn bij macrocefalie op kloonniveau. Echter, in toekomstige studies analyse van genen die relevant zijn voor de controle van corticale grootte in het algemeen kan zeer wenselijke inzichten op moleculair en cellulair niveau. Figuur 1: Het MADM-principe voor het traceren van afstammingen en kloonanalyse op enkelstamcelniveau. (A) Om lijntracering en kloonanalyse met MADM uit te voeren, moeten twee componenten aanwezig zijn. Ten eerste moeten MADM-cassettes gericht zijn op identieke loci op homologe chromosomen. Cassettes bestaan uit twee chimerische tlfluorescerende reportergenen, eGFP (groen, [G]) en tandem dimer Tomato (rood, tdT[T]). De GT cassette bevat het N-eindpunt van eGFP en het C-eindpunt van tdT, gescheiden door een intron met een loxP site. De TG cassette is omgekeerd gebouwd, met het N-eindpunt van tdT en het C-eindpunt van eGFP. Ten tweede moet de expressie van Cre recombinase plaatsvinden in de cel met de beoogde MADM-cassettes. De loxP-sites dienen als doelwit voor cre-gemedieerde interchromosomale recombinatie, wat resulteert in de reconstructie van beide expressiecassettes tegelijk. Als recombinatie optreedt tijdens de G2-fase van de celcyclus gevolgd door X-segregatie (G2-X), zullen de twee dochtercellen een van de twee fluorescerende eiwitten uitdrukken. (B)MADM-beginsel voor genetische mozaïekanalyse op één kloonniveau. Mutant allelen (puntmutaties, schrappingen, toevoegingen, loxP-geflankeerde voorwaardelijke allelen zoals afgebeeld in figuur 1B, enz.) kunnen distaal worden geïntroduceerd in de TG-MADM cassette via meiotische recombinatie (zie figuur 2 en Hippenmeyer et al.46 voor details over hoe mutante allelen in het MADM-systeem kunnen worden geïntroduceerd). Als een G2-X Cre recombinase-gemedieerde interchromosomale transrecombinatie optreedt tussen MADM-cassettes, resulteert dit in één GFP+ homozygootvormige mutantcel(GeneX-/)voor het gen van belang en één tdT+ homozygootachtige wilde typecel(GeneX+/+) in een niet-gelabelde heterozygootachtige omgeving46,47,71. Alternatieve etiketteringsresultaten die niet worden gebruikt in de kloonanalyse (d.w.z. gele cellen) zijn eerder in detail beschreven11,46,47. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Fokschema’s voor het genereren van experimentele MADM muizen voor lijntracering. Fokschema voor de generatie van de controle MADM (A) en Gene X MADM(B)experimentele MADM muizen voor kloonanalyse. Voor meer informatie over MADM fokparadigma’s zie Beattie et al.7 en Hippenmeyer et al.7,46. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Time course paradigma’s voor MADM-gebaseerde kloonlijnanalyse. Schematisch van de experimentele ontwerptijdvensters. Voor longitudinale bemonsteringsparadigma’s bleef het tijdspunt van klooninductie constant en varieerde de tijdsduur voordat de analyse varieerde. In progressieve intervalbemonstering bleef het tijdspunt van de analyse constant, maar de tijd van inductie varieerde. Een combinatie van één of beide benaderingen kan worden gebruikt, afhankelijk van de behandelde vragen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: MADM kloonanalyse in de zich ontwikkelende en volwassen neocortex. TM-gemedieerde MADM-klooninductie in symmetrisch proliferative (TM at E10) (A-C)en asymmetrisch neurogeen (TM bij E12) (D-F) verdelen RGPs. Afgebeeld zijn individuele MADM klonen in vivo in de ontwikkeling (TM/E10−A/E16 en TM/E12−A/E16) (B,E) en volwassen (TM/E10−A/P21 en TM/E12−A/P21) (C,F) in MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) en MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuron output was onafhankelijk van subclone kleur en groene meerderheid / minderheid subklonen kunnen worden vergeleken met rode meerderheid / minderheid subklonen onder controle voorwaarden7,11. Ongeveer 1/6 van de volwassen klonen bevatte ook astrocyten en/of oligodendrocyten, aangegeven door witte sterretjes. Panelen B en F worden gereproduceerd met toestemming van hippenmeyer et al.46 en Rulands en Simons72, respectievelijk. CP = Corticale plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: MADM kloonanalyse om rgp-gemedieerde neuronoutput te kwantificeren. Analyse van excitatory neuron (eenheid) productie door individuele neurogene RRGPs op kloonniveau met behulp van MADM7,11. (A) Experimenteel paradigma voor het induceren van meestal asymmetrische MADM klonen in de zich ontwikkelende cortex. (B) Mogelijke asymmetrische kloonresultaten met de meerderheidsubclone gelabeld in groene of rode (C) Representatieve opeenvolgende secties verspreid over een enkele neurogene asymmetrische kloon (D,E) 3D-reconstructiebeelden van representatieve asymmetrische G2-X MADM-klonen met meerderheidspopulatie in rood (D) of groen (E) in MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- met TM inductie op E12 en analyse op P21. Let op zowel groene als rode gelabelde cellen zijn wild type. (F) Schematisch met vermelding van de twee mogelijke experimentele MADM-kloonresultaten. (G) Kwantificering van de omvang van de meerderheidspopulatie die voortvloeit uit de vernieuwing van RPP’s in MADM-11-klonen. (H) Kwantificering van de omvang van de minderheidsbevolking die voortvloeit uit de vernieuwing van RPP’s in MADM-11-klonen. (I) Kwantificering van de eenheidsgrootte van asymmetrische neurogene MADM-11 klonen. Hypothetische waarden kunnen betekenen ± SEM. Schaalbalk = 100 μm (D en E). TM = Tamoxifen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6: MADM kloonanalyse om genen te bestuderen die leiden tot microcefalie en macrocefalie. Hypothetische MADM kloonanalyse resultaten bij het uitvoeren van functionele genetische dissectie van kandidaat-genen die leiden tot microcefalie of macrocefalie. Om de cel-autonome functies van een gen van belang (Gene X) op neuron output te ontleden, vereist MADM mutant allelen distaal worden geïntroduceerd in de MADM cassettes via meiotische recombinatie (voor details hoe mutante allelen in het MADM-systeem te introduceren zie ook figuur 2, Hippenmeyer et al.46, en Laukoter et al.46,73). (A,B) Schematisch met daarop experimenteel MADM-paradigma voor functionele analyse van kloon RGP-eenheden. De gemuteerde subclone kan ofwel de minderheid(A) of meerderheid(B)bevolking vormen. (C-E) Hypothetische MADM klonale analyse resultaten bij het kwantificeren van controle MADM (witte balken), Gene-X MADM microcefalie (grijze balken) en Gene-X MADM macrocefalie zwarte balken) asymmetrische klonen. cC) Kwantificering van de omvang van de meerderheidsbevolking. (D) Kwantificering van de omvang van de minderheidsbevolking. (E) Kwantificering van de eenheidsgrootte van asymmetrische neurogene klonen. Hypothetische waarden kunnen betekenen ± SEM. S = Hypothetisch scenario waarbij het verschil in subclone celnummer betekenis kan bereiken ten opzichte van controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Tabel 1: MADM klonale studies in de literatuur. Samenvatting van studies in de literatuur met MADM kloonlijn experimenten, met inbegrip van CreERT2 driver gebruikt, TM dosis, en tijd van injectie. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussion

Een methode om MADM te gebruiken om cellijn van individuele RGPs in vivo in de zich ontwikkelende neocortex te volgen wordt beschreven. In combinatie met TM-inducible CreERT2kunnen MADM-gebeurtenissen nauwkeurig worden getimed, wat zorgt voor een zeer kwalitatieve en kwantitatieve visuele uitlezing van stamceldelingspatronen op het niveau van één cel. Door de geleverde dosis TM te titreren, kan in een ideale situatie gemiddeld minder dan één kloon per corticale hemisfeer worden verkregen, waardoor een adequate ruimtelijke scheiding ontstaat om individuele klonen ondubbelzinnig te onderscheiden. Door het handhaven van weefselintegriteit, deze methode vangt ook essentiële informatie met betrekking tot positie, morfologie, en absolute celnummers. MADM cassettes op Chr. 117,11,12,46,56,57, op Chr. 751, en de originele MADM bij Rosa2647,53,59 zijn gebruikt in MADM kloonanalysestudies. De hoge resolutie van individuele cellen biedt ongekend inzicht in zowel morfologie als de klonale relatie van dochtercellen en maakt de live beeldvorming van zich vermenigvuldigende stamcellen en opkomende klonen46,52mogelijk .

Keizersnede en het bevorderen van pups voor analyse van klonen op postnatale tijdpunten is een noodzakelijke en kritieke stap in het protocol. Afhankelijk van de gezondheidstoestand van de met TM behandelde zwangere moeder, kan het niet nodig zijn om een keizersnede uit te voeren. Het verhogen van de pups met een pleegmoeder is echter nog steeds vereist, omdat de met TM behandelde moeder problemen kan hebben met borstvoeding. Er zijn geen verschillen waargenomen in de noodzaak om te stimuleren met verschillende CreERT2-drivers. Zowel MADM lijnen en pleegmoeders worden onderhouden op een outbred CD-1 achtergrond. Als keizersnede niet nodig is, kan de met TM behandelde drachtige moeder die wordt gebruikt om experimentele pups te genereren, worden hergebruikt voor aanvullende experimentele fokken overeenkomstig de beginselen van 3R (houd er rekening mee dat dit alleen kan worden gedaan als experimentele diervergunningen deze praktijk goedkeuren). Pleegmoeders kunnen worden gebruikt voor het bevorderen van pups binnen 2 dagen nadat ze bevallen, maar hogere slagingspercentages zijn waargenomen wanneer pleegmoeders bevallen op dezelfde dag als de experimentele muizen die moeten worden bevorderd. Daarom is het belangrijk om getimede paringen voor pleegmoeders in te stellen parallel aan experimentele paringen in stap 1.1. Het handhaven van een vergelijkbaar nestnummer als het nest van de oorspronkelijke pleegmoeder kan de overlevingskans van pleegkinderen verbeteren, en daarom kan het verwijderen van sommige naar alle originele nesten nodig zijn. Extra stappen die het bevorderen kunnen verbeteren, zijn onder andere het wrijven van de handschoenen van de onderzoeker met strooisel en voedsel (om de geur van de handschoenen te verwijderen); wrijven de pups zachtjes na de keizersnede met fragmenten van de pleegmoeder vervuilde nest en nest; en plaatsing van de pups in nauw contact met de pups van de pleegmoeder voorafgaand aan hun plaatsing in de pleegmuiskooi.

Net als bij andere reporter-gebaseerde lijn tracering methoden, moet zorgvuldig worden overwogen bij het kiezen van de optimale CreERT2 driver voor MADM kloon experimenten. Ten eerste moet de gebruikte promotor de recombinase zowel tijdelijk als ruimtelijk uitdrukken in de voorloperpopulatie van belang. Het vinden van deze promotor kan een uitdaging zijn, omdat sommige promotors expressiepatronen kunnen veranderen of in verschillende stadia van ontwikkeling het zwijgen kunnen worden opgelegd. Om de specificiteit van het celtype te verbeteren, zijn er meerdere sitespecifieke recombinases gebruikt, elk aangedreven door afzonderlijke promotors. Wanneer een of beide recombinases in dezelfde cel worden uitgedrukt, labelt dit de cel en het nageslacht met een tl-verslaggever74,75,76,77. Samengevat is het belangrijk om een CreERT2-driver te kiezen die specifiek is voor de populatie van voorouders die worden geanalyseerd.

De meest kritieke stap in deze methode is de identificatie van een kloon, omdat alle cellen ondubbelzinnig moeten worden afgeleid uit een enkele recombinatiegebeurtenis (stap 8.1). Titratie van TM-concentratie zorgt voor minder dan één cluster van rode/groene cellen per hersenrondisfeer en maximaliseert de kans op het analyseren van een enkele kloon (stap 2.2)7,11. Klonen moeten worden weggegooid als naburige clusters van cellen optreden binnen 500 μm van de kloon van belang. Daarom is het belangrijk om verschillende secties voor en na het verschijnen van een kloon te onderzoeken om ervoor te zorgen dat er geen extra recombinatiegebeurtenissen in de buurt zijn. Vanwege een zwakker signaal van de fluoroforen is het noodzakelijk om immunohistochemie uit te voeren voor eGFP en tdT in embryonale klonen (zie punt 6). Dit wordt alleen aanbevolen bij volwassen klonen als extra antigenen worden gecolabeld. Bij het beeldvorming van klonen is het belangrijk om de volledige breedte van de cortex vast te leggen waar de kloon zich bevindt (d.w.z. van pialoppervlakte tot het corpus callosum; zie stap 8.4) om geen cellen te missen. Dit vergemakkelijkt ook beelduitlijning tijdens beeldverwerking (sectie 9). Sectie 8 van het protocol vereist een omgekeerde confocale microscoop, maar kan worden aangepast afhankelijk van de microscoop setup beschikbaar. Epifluorescentie microscopie kan worden gebruikt, maar confocale microscopie wordt aanbevolen omdat dit leidt tot een afname van lichtverontreiniging van buiten het focusvlak. Het is ook belangrijk dat de laserintensiteit en gain wordt aangepast, zodat groene, rode en gele cellen ondubbelzinnig kunnen worden geïdentificeerd. Ongeacht de setup wordt aanbevolen om een doelstelling van ten minste 20x te gebruiken om volledige ruimtelijke scheiding van dicht gepositioneerde cellen te garanderen. Naast het registreren van de corticale diepte van alle cellen (stap 8.6), moeten corticale gebieden waar de klonen zich bevinden worden geïdentificeerd met behulp van een hersenatlas zoals de Allen Brain atlas of andere stereotaxic coördinaatkaarten. Een bestand naamgeving paradigma moet ook worden aangenomen om ervoor te zorgen kloon beelden zijn gemakkelijk te identificeren. De volgende informatie kan worden opgenomen in de bestandsnaamgeving: unieke afbeelding-ID, datumafbeelding is genomen, genotype van het dier, leeftijd van inductie, leeftijd van analyse, beeldnummer ten opzichte van de rest van de beelden van dezelfde kloon.

De introductie van een mutatie distaal tot een MADM cassette onderscheidend maakt het genereren van genetische mozaïeken71 en maakt de dissectie van moleculaire regelgevers van afstamming en celtype diversiteit op het kloonniveau7,11,46,62. Om een genetisch mozaïek met MADM te genereren, moeten de MADM-cassettes meiotisch worden gekoppeld aan hetzelfde chromosoom als het gen van belang (zie figuur 2 voor fokschema). Dit beperkt de huidige kloonanalyse met MADM tot genen op Chr.7 51, Chr. 1146, Chr. 1251en Chr. 6 distal aan de Rosa26 locus47. Toekomstige studies zullen gebruik maken van MADM cassettes gericht op elk chromosoom, waardoor de mozaïek analyse van vrijwel alle genen van de muis genoom op klonale niveau.

Ten slotte is MADM niet beperkt tot de analyse van voorlopercellen in de zich ontwikkelende neocortex. De studie van veel stamcelniches zou kunnen profiteren van de mogelijkheid om spatiotemporale regelingen van clonally gerelateerde cellen op te lossen. Door madm toe te passen op andere hersengebieden, aandoeningen van de ziekte (bijvoorbeeld kanker), of in andere weefsels47,50,51,52,53,,54,,55,56,57,58,59, studies onthulden afstammingrelaties in klonen afkomstig van diverse klassen van voorloper en stamcellen (zie tabel 1 voor de huidige lijst van MADM-kloonstudies). Een andere interessante toekomstige toepassing van MADM is om het te combineren met extra functionele of subcellulaire verslaggevers, die de mate van informatie die kan worden verkregen van klonen zou verhogen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken alle leden van het Hippenmeyer laboratorium voor discussie, de Bioimaging Facility, Life Science Facility en Pre-Clinical Facility van IST Austria voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door institutionele fondsen van IST Austria; R.B. kreeg steun van het Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner programma (M 2416); N.A kreeg steun van austrian science fund (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC kreeg steun van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. A.H. kreeg steun van een ÖAW DOC (Doctoral Fellowship van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen). Deze studie werd ook ondersteund door de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 725780 LinPro) aan S.H.

Materials

1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) Roth 0718.2
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 8508429N
15 mL conical centrifuge Sarstedt 65.554.502
24 multi-well dishes Roth/Greiner Bio-one CE56.1
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) Braun 16010256E
Corn oil Sigma C8267-500ML
Coverslips (24 x 60 mm #1) Thermo Fisher Scientific (Menzel) 15747592
Cryostat Cryostar NX70 Thermo Fisher Scientific 957000H
Dako Pen (Wax marker) Agilent S200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) Thermo Fisher Scientific 705830
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools (FST) 11254-20
Glass anti-roll plate Histocom M 449980
Glycerol Sigma G5516
LSM 800 Confocal Zeiss
Mounting medium 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88 Roth 0713.2
Normal donkey serum Innovative Research IGDNSER100ML
Paraformaldehyde Sigma 441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPM Watson-Marlow 036.3124.00A
Sucrose Sigma S8501-5KG
Superfrost plus glass slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNT
Tamoxifen Sigma T5648
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) Polysciences Inc. 18986-1
Tissue-Tek O.C.T Sakura 4583
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Trizma hydrochloride Sigma 93363
Tween-20 Sigma P9416-100ML
Software and Plugins:
Fiji 1.52p Fiji
MultiStackReg 1.45 Download link
TurboReg EPFL Bioimaging
Zen Blue 2.6 Zeiss
Experimental Models: Organisms/Strains:
Mouse: Emx1-CreER The Jackson Laboratory JAX:027784
Mouse: MADM-11-GT The Jackson Laboratory JAX:013749
Mouse: MADM-11-TG The Jackson Laboratory JAX:013751
Primary antibodies:
Chicken anti-GFP 1:500 Aves Labs GFP-1020
Goat anti-tdTomato 1:500 Sicgen Antibodies AB8181-200
Rabbit anti-RFP 1:500 MBL PM005
Secondary antibodies:
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 Jackson Immuno Research 715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 711-165-152
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176 (2017).
  11. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381 (2019).
  13. Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522 (2019).
  23. Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443 (2016).
  25. Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229 (2019).
  31. Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234 (2019).
  32. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  33. García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  38. Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  44. Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658 (2018).
  46. Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Ramón y Cajal, S. . Histologie du système nerveux de l’homme et des vertébrés. , (1911).
  49. Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382 (2016).
  53. Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685 (2016).
  56. Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516 (2017).
  57. Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211 (2018).
  58. Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163 (2007).
  60. Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14 (2017).
  62. Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946 (2019).
  63. Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335 (2018).
  64. Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301 (2008).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533 (2010).
  70. Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice?. eLife. 9, e54042 (2020).
  71. Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195 (2020).
  74. Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385 (2015).
  78. Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332 (2012).
  97. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Entwicklungsbiologie. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Schuchardt, A., D’Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036 (2015).
  102. Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Tags

Lineage TracingClonal AnalysisMosaic Analysis With Double Markers (MADM)Single-cell AnalysisGenetic AnalysisTamoxifen InductionPerfusionBrain HarvestingFixation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Beattie, R., Streicher, C., Amberg, N., Cheung, G., Contreras, X., Hansen, A. H., Hippenmeyer, S. Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). J. Vis. Exp. (159), e61147, doi:10.3791/61147 (2020).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image