Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.
Çeşitli mühendislik nanomalzemelerinin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, ENM’ye maruz kalmak kaçınılmazdır ve sağlam, tahmine dayalı in vitro test sistemlerinin geliştirilmesi esastır. Karaciğer metabolik homeostaz ve detoksifikasyonda hayati bir rol oynamanın yanı sıra ENM birikimi sonrası maruziyetin önemli bir yeri olduğu için, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti düşünüldüğünde anahtardır. Buna ve 2D hepatosit modellerinin karmaşıklıkları doğru bir şekilde taklit etmediğinin kabul edilen anlayışına dayanarak, in vivo olarak gözlenen karmaşık çok hücreli etkileşimlerin ve metabolik aktivitenin karmaşıklıklarını taklit etmemektedir, enm tehlike değerlendirme amaçları için uyarlanmış fizyolojik olarak ilgili 3D karaciğer modellerinin geliştirilmesine daha fazla odaklanılmıştır. Hayvan deneylerini değiştirmek, azaltmak ve iyileştirmek için 3R’lerin ilkeleri doğrultusunda, hem genişletilmiş hem de tekrarlanan ENM maruz kalma rejimlerini (≤14 gün) destekleyebilen kullanıcı dostu, uygun maliyetli bir sistem olan 3D HepG2 hücre hattı tabanlı bir karaciğer modeli geliştirilmiştir. Bu küresel modeller (çapı ≥500 μm) proliferatif kapasitelerini korur (yani hücre modellerini böler) genotoksisite in vitro’yu etkili bir şekilde değerlendirmek için ‘altın standart’ mikronükleus testi ile birleştirilmiş olmalarını sağlar. Bir dizi toksikolojik uç nokta (örneğin, karaciğer fonksiyonu, (pro-)inflamatuar yanıt, sitotoksiklik ve genotoksisite) hakkında rapor verme yetenekleri, hem akut (24 saat) hem de uzun süreli (120 h) maruz kalma rejimlerinde çeşitli ENM’ler kullanılarak karakterize edilmiştir. Bu 3D in vitro hepatik model, daha gerçekçi ENM maruziyetlerini değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece ENM tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.
İnsan tabanlı çok sayıda uygulama (örneğin, gıda, kozmetik, giyim, spor ekipmanları, elektronik, ulaşım ve tıp) genelinde çeşitli mühendislik nanomalzemelerin (ENM) hızlı gelişimi ve uygulanması nedeniyle, insanların düzenli olarak ENM’ye maruz kalmaları kaçınılmazdır. Bununla birlikte, bu malzemeleri çok sayıda uygulamada avantajlı gören yeni, boyuta özgü fizyoterapi-kimyasal özelliklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde yan etkilere neden olabileceğine dair endişeler artmaktadır. Şu anda, bu ENM’lere fizyolojik olarak daha fazla maruziyeti aktif olarak yansıtmak ve bu malzemelerin akut, uzun süreli ve tekrarlanan düşük doz maruz kalma senaryoları üzerindeki potansiyel toksisitesini değerlendirmek için birçok uluslararası faaliyet uygulanmaktadır.
Karaciğerin MARUZ KALMA SONRASI ENM birikiminin önemli bir bölgesi olduğu yaygın olarak bilindiğinden, HEPATIK toksikoloji ENM maruziyeti göz önüne alındığında anahtardır1,2. Ayrıca, karaciğer sistemik dolaşıma giren maddelerin metabolizması ve detoksifikasyonu için birincil organ sistemidir3. 2D hepatosit modellerinin karmaşık çok hücreli etkileşimlerin karmaşıklıklarını doğru bir şekilde taklit etmediğini veya in vivo olarak gözlenen metabolik aktiviteyi uygun şekilde temsil etmediğini kabul eden anlayışa dayanarak, in vivo ikame teknolojileri için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili in vitro 3D karaciğer modelleri geliştirmeye daha fazla odaklanılmıştır4,5. Gelişmiş 3D kültür teknolojilerinin kullanılması, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimlerinin araştırılmasını sağlayan in vitro hepatik modellerin uzun ömürlülüğünü artırır. Ek olarak, bu gelişmiş kültür formatı, safra canaliculi, aktif taşıyıcı süreçleri ve geliştirilmiş CYP450 ilaç metabolizasyon yetenekleri gibi gelişmiş fizyolojik, organotipik özelliklerin oluşumunu teşvik eder, böylece modellerin öngörülebilirliğini artırır6. Mono-kültürlerden (sadece hepatositler) veya ortak kültürlerden (nonparenkimal hücreli hepatositler) oluşan mevcut 3D in vitro hepatik modeller çeşitli biçimlerde mevcuttur, ultra yüksek yapışma plakalarındaki mikrotissues veya sferoidlerden, asılı damla sferoidlere, matrislere ve / veya iskelelere gömülü hücrelere ve mikroakışkan hücre kültürü platformlarına kadar, hepsi hepatik toksisite değerlendirmesi için etkili gelişmiş in vitro modeller olarak kabul edilir6,7. Bununla birlikte, bu model sistemlerinin çoğu yüksek bakım gerektirir, özel ekipman gerektirir ve pahalıdır. Ayrıca, bu modeller genellikle sabit DNA hasarını ölçen yöntemleri kullanarak genotoksisite testi gibi tehlike uç noktalarının değerlendirilmesinde kullanılmasını önleyen statiktir (yani bölünmeyen hücre modelleri). Genotoksisite, düzenleyici toksikolojide temel bir ön koşuldur ve herhangi bir toksik edicinin risk değerlendirmesinin hayati bir bileşenidir8. Eksojen bir maddeye maruz kalmadan sonra ortaya çıkabilecek tüm DNA hasarı biçimlerini ölçmek için uygulanabilecek tek bir test yoktur. Bununla birlikte, in vitro genotoksisite test pilinin temel bir bileşeni, brüt kromozomal hasarı ölçen güvenilir ve çok yönlü bir teknik olan mikronükleus testidir9. OECD Test Kılavuzu 487 tarafından açıklanan, in vitro DNA hasarını ve genotoksisiteyi değerlendirmek için kullanılan altın standart bir tekniktir ve düzenleyici tehlike değerlendirmesi10,11için test pili gereksiniminin bir parçasıdır.
İnsan hepatosellüler karsinom hücre hattı, HepG2, hücreler kolayca kullanılabilir, kaynağa nispeten ucuz, kültüre basit ve yüksek verim taramasına uygun olduğu için ilk tehlike değerlendirmesi taraması için yaygın olarak kullanılır12,13. 3D küresel yapılara kültürlendiğinde, karaciğer mikroçevresini iyi bir şekilde yeniden özetledikleri ve mikronükleus testini desteklemek için yeterli proliferatif yeteneklere sahip hepatik bir model sundukları gösterilmiştir3. HepG2 küresel modellerinin daha da geliştirilmesi, uzun süreli, tekrarlanan maruz kalma rejimleri (≤14 gün) üzerinde genotoksisite tehlike değerlendirmesini desteklemek için modelin uzun ömürlülüğünü ve karaciğer benzeri işlevselliğini iyileştirmek için kurulmuştur. Böylece, 3R’lerin değiştirilmesi ilkeleri doğrultusunda, hayvan deneylerini azaltmak ve iyileştirmek için mevcut protokol, akut, uzun süreli ve tekrarlanan kimyasal ve ENM maruziyetlerini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde takip eden birden fazla toksikolojik uç noktayı (örneğin karaciğer işlevselliği, (pro)enflamatuar belirteçler, sitotoksiklik ve genotoksisite) güvenilir bir şekilde değerlendirebilen gelişmiş bir 3D in vitro hepatik model sağlamak için kurulmuştur.
Burada, akut veya uzun süreli, tekrarlanan ENM maruziyetlerini takiben genotoksisite tehlike değerlendirmesi için fizyolojik olarak ilgili 3D hepatosit hücre hattı tabanlı in vitro model sistemi kurmak için bir yöntem sunuyoruz. Protokol 6 temel aşamaya ayrılabilir: kriyoprezer korunmuş HepG2 hücrelerinin kült haline alınması; HepG2 küresel preparat; HepG2 sferoid asılı damladan agarose süspansiyona transfer; HepG2 küresel hasat; mikronükleus tahlil ve puanlama; ve veri analizi.
3D hepatik modeller için uygulamalar, hedeflenen belirli biyokimyasal uç noktaya veya olumsuz sonuç yoluna bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Her modelin, birincil insan hepatosit (PHH) modellerindeki interdonor varyasyondan hücre hattı tabanlı modellerde azaltılmış sitokrom p450 aktivitesine kadar yararları ve sınırlamaları vardır, ancak hepsi kendi başına değerlidir6,12,18,19. Genotoksisiteyi değerlendirirken, aktif çoğalma gerektiğinden, in vitro mikronükleus testi gibi düzenleyici onaylı uç noktalarla uyumluluk modellerinde sınırlamalar vardır. Genotoksisite değerlendirmesi, DNA onarımının geçici lezyonları düzeltmesi için fırsat olduğunda sabit DNA hasarının hücre sonrası bölünmesinin ölçülmesini gerektirdiğinden, bu gereklidir. Ne yazık ki, son derece farklılaştırılmış hepatosit (yani, HepaRG) bazlı küreseller veya PHH mikrotizeleri, en fizyolojik olarak ilgili karaciğer benzeri özellikleri sergilediği düşünülen statik (proliferatif olmayan) modelleroluşturur 12,19,20. Sonuç olarak, burada sunulan 3D HepG2 küresel model, genotoksisite testini destekleyebilecek uygun, alternatif bir model sağlar. HepG2 hücre hattı bazlı küreseller, albümin ve üre üretimi ve bazı CYP450 aktivitesi5,12,19gibi temel karaciğer benzeri özellikleri korurken, küresellerin dış yüzeyinde yeterince aktif olarak bölünen hücrelere sahiptir. Esas olarak bu in vitro karaciğer modeli mikronükleus testini tamamlamak için geliştirilmiştir, çünkü bu genotoksisite testi için pilde önerilen iki in vitro testlerden biridir8,10,11,21. Bununla birlikte, model DNA dizileme analizi ve gen ekspresyon (RNA) teknolojilerine kolayca uygulanabilirken, kuyruklu yıldız testi gibi diğer DNA hasar uç noktaları için daha fazla uyarlanıp kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, ENM parazitinin bazı uç nokta analizlerinde oynadığı rolü göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, akış sitometrisi bazlı analizler özellikle partikül paraziti nedeniyle ENM genotoksisite değerlendirmesi için uygun olmayabilir22.
Aktif olarak hücre bölünmesi geçiren küresel modellerin sınırlayıcı faktörlerinden biri boyutlarıdır. Modelin çoğalmaya devam etmesine izin veren yeterli hücre olması gerektiğinden, tohumlama yoğunluğunun optimizasyonu kritik öneme sahiptir; ancak çok yüksek olmayan bir hücre sayısı, bu da küreselin aşırı kompakt hale gelmesine neden olur ve nekrotik çekirdeğin artmasına neden olur. Bu nekrozun nedeninin sınırlı oksijen ve besin difüzyonu olduğuna inanılmaktadır, çünkü bu difüzyonun sınırının yaklaşık 100 – 150 μm doku23,24olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu hücre türüne, hücre numarasına, iskele etkileşimlerine ve kültür koşullarına bağlıdır25. O zamandan beri, yaklaşık 700 μm çapının C3A sferoidlerin merkezinde nekrozun erken başlamasını önlemek için sınır olduğu gösterilmiştir, küresel başına 4000 HepG2 hücresinin tohumlaması, maruz kalma sırasında modelin çapının ≤500 μm26olmasını sağlar. Ayrıca, Shah ve arkadaşları, küresel başına 5000 hücrenin üzerinde tohumlanan HepG2 hücrelerinin, kültürde 7 gün sonra canlılıkta% 25’lik bir azalma sergilediğini ve bunun ortalama 680 μm çapına ve 20 μL asılı damla5’tebesinlerin sınırlı mevcudiyetine bağlı olabileceğini tespit etti. Bunun üstesinden gelmek için, mevcut protokolde tasarlanan model, asılan damlanın küreselin ilk oluşumunu takiben agarose kaplı kuyulara aktarıldığı kritik bir adımdan geçer. Bu, küreseller içinde sürekli artan hücre sayısını sürdürmek için daha fazla kültür ortamının mevcut olmasını sağlar. Sonuç olarak, HepG2 küresel modeli kültürde 10 gün sonra% 70’in üzerinde uygulanabilir kalır ve uzun süreli tehlike değerlendirmesi in vitro içinkullanılabilir.
HepG2 küresel modeli hem akut hem de uzun süreli maruz kalma rejimlerini destekleyebilirken, uzun kültür dönemlerinde hücre kültürü ortamının yenilenmesi, sferoidlerin potansiyel kaybı nedeniyle ortamın tamamen değiştirilmesi tavsiye edildiği için bu model için kısıtlanır. ENM maruziyetlerinde, homojen ENM dağılımlarının aglomera ve tortuya eğiliminin yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, bir ENM çökeltilerinin parçacık parametrelerine (örneğin, boyut, şekil ve yoğunluk) bağlı olarak değişebileceği ve entrika sedimansasyonu, difüzyon ve dozimetri (ISDD) modeli veya enm (süspansiyon) maruziyeti ile ilgili olarak sıklıkla atıfta bulunulan son türevleri kullanılarak teorik olarak belirlenebileceği dikkat çekicidir27,28. Bu akılla, hücre kültürü ortamının sadece% 50’sinin hücre kültürünün yüzeyinden dikkatlice çıkarılması durumunda, ENM dozunun bozulması ve daha sonra çıkarılmasının teoride minimum olması gerektiği varsayılıyor. Bununla birlikte, Brownian hareketi söz konusu olduğunda, bu kesinlikle böyle olmayabilir ve test edilecek her bir ENM’nin birikmesi ve tortulması için daha fazla çalışma yapılmalıdır, doğru dozimetrinin uzun süreli maruz kalma rejimleri boyunca korunmasını sağlamak için27. Esas olarak bu, tekrarlanan dosing rejimlerini gerçekleştirirken göz önünde bulundurulacak potansiyel bir sınırlamadır, çünkü bu son, birikmiş konsantrasyon için kritik olabilir. Öte yandan, kimyasal bazlı maruziyetler, dikkate alınması gereken kendi sınırlamaları olmadan olmasa da, kimyasal maddelerin çözeltide kalma eğiliminde olduğu konusunda daha basit bir yaklaşım sunar ve böylece yeni eklenen konsantrasyona ek olarak orijinal kimyasal konsantrasyonun doğrudan değiştirilmesi, medya tazeleme sırasında kaybolan herhangi bir kimyasalın buna göre değiştirilmesini sağlar29. Gelecekteki uygulamalar, modelin uzun süreli kültür dönemlerinde tekrarlanan maruz kalma rejimlerine uygunluğunu değerlendirmeyi içerecektir, çünkü tekrarlanan dosing stratejileri, belirli bir organ sisteminin ksenobiyotik bir maddenin biyoakümülasyonundan kaynaklanan olumsuz etkileri iyileştirme veya üstesinden gelme yeteneğini değerlendirmek için çok önemlidir.
Sonuç olarak, bu 3D in vitro hepatik model, bir dizi gerçekçi maruz kalma senaryosunu değerlendirmek için kullanılacak kapasiteye sahiptir, böylece hem ENM’yi hem de kimyasal tehlike değerlendirmesini rutin ve kolay erişilebilir bir şekilde daha iyi desteklemek için gelecekteki bir in vitro yaklaşım sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bu araştırmanın 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında AVRUPA Birliği’nin PATROLS projesi için Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldığını kabul etmek istiyor.
Aflotoxin B1 | Sigma Aldrich, UK | A6636-5MG | |
Agarose | Sigma Aldrich, UK | A9539-50G | |
Autoclave Tape | |||
BCG Albumin Assay | Sigma Aldrich, UK | MAK124 | |
Bovine Serum Albumin Powder | Sigma Aldrich, UK | A9418 | |
Cell Freezing Aid | Thermo Fisher Scientific, UK | 5100-0001 – Mr Frosty | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Cytochalasin B | Merck, UK | 250233 | |
Cytology Metal Clips | |||
Cytospin 4 Centrifuge | ThermoFisher Scientific, UK | CM00730202 | |
DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine | GIBCO, Paisley, UK | 41965-039 | |
DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes | GIBCO, Paisley, UK | 21063-029 | |
DPX Mounting Medium | FisherScientific, UK | D/5330/05 | |
Ethanol | FisherScientific, UK | 10048291 | |
FBS | GIBCO, Paisley, UK | 10270-106 | |
Filter Cards for Shandon Cytospin | FisherScientific, UK | 15995742 | |
Frosted Glass Slides | ThermoFisher Scientific, UK | ||
Giemsa's Stain Improved R66 Solution, Gurr | VWR Chemicals, UK | MFCD00081642 | |
Glass Coverslips (24 x 60) | Deckglaser, VWR | ECN631-1575 | |
Haemocytometer and Coverslip | |||
Immersion Oil for Microscope | Zeiss, UK | 518F, ISO8034 | |
Laminar Class II Tissue Culture Hood | Scanlaf Mars | ||
Light Microscope | Zeiss, UK | Axiovert 40C | |
Liquid Nitrogen | |||
Methanol | FisherScientific, UK | 10284580 | |
Microwave | |||
Non-Filtered, Sterile 200µl and 1000µl Pipette tips | Greiner-Bio-One, UK | ||
NuncMicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific, Denmark | 167008 | |
P1000 and P200 micropipettes | |||
P300 and P50 multi-channel pipettes | |||
PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free | GIBCO, Paisley, UK | 14190-094 | |
Pen/Strep | GIBCO, Paisley, UK | 15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml | |
Phosphatase Buffer Tablets | GIBCO, Paisley, UK | 10582-013 | |
Pipette Boy | |||
Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges | FisherScientific, UK | 11690581 | |
Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" – Probe | Branson, USA | 101-063-971R | |
T-25 and T-75 Tissue Culture Flask | Greiner-Bio-One, UK | T-25 (690175) and T-75 (660175) | |
Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich, UK | T8154-100mL | |
Urea Assay Kit | Sigma Aldrich, UK | MAK006 | |
Virkon Disinfectant | DuPont, UK | Rely+On Virkon | |
Water Bath (37˚C) | Grant JBNova 18 | ||
Weighing Balance | |||
Xylene | FisherScientific, UK | 10588070 | |
0.05% Trypsin-EDTA | GIBCO, Paisley, UK | 5300-054 | |
0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
0.45µm Filter Unit | Millex HA, MF-Millipore, UK | SLHA033SS | |
1.0mL Syringe | BD Plastipak, FisherScientific, UK | 300185 | |
20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps | DWK Life Sciences GmbH, Germany | WHEA986581 | |
37˚C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator | NUAIRE DHD Autoflow | ||
3mL Pasteur Pipette | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL Conical Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
50mL or 100mL Glass Bottles | |||
50mL Skirted Falcon Tubes | Greiner-Bio-One, UK | ||
5mL, 10mL and 25mL Pipettes | Greiner-Bio-One, UK | ||
9.4cm Square, Petri Dish | Greiner-Bio-One, UK | 688161 |