Linha de worm e Worm_CP, dois gasodutos de código aberto para endireitar e quantificação de dados de imagem fluorescência obtidos de elegans caenorhabditis

Culturing e imagem C. elegans de acordo com o método descrito neste protocolo produz grandes imagens de visão geral de populações de vermes. Para facilitar a inspeção visual e a classificação de worms a partir dessas imagens desenvolvemos o Worm-align. Worm-align é um script FIJI simples e fácil de usar que pode ser usado para criar montagens de worms endireitados e alinhados. Os worms são selecionados a partir de imagens de visão geral desenhando uma linha ao longo do eixo longitudinal dos worms. Cada worm selecionado é atribuído um número, cortado e endireitado, e adicionado a uma montagem. Montagens podem ser geradas por imagem ou combinando todas as imagens da pasta de entrada original. Como esperado, a saída do gasoduto depende em grande parte da qualidade das linhas desenhadas em cima das imagens. Para ilustrar este ponto, a Figura 4 mostra vários exemplos de linha e sua saída de Worm-align. Uma linha completa da cabeça até a ponta da cauda produz um verme devidamente alinhado (rotulado de “bom”). A Figura 4 também mostra como o rastreamento de imprecisões durante a execução do Worm-align afeta a saída do alinhamento. A partir da montagem anotada incluída na Figura 4C,deve-se tomar cuidado para evitar os seguintes erros, pois dificultam o alinhamento adequado dos worms: Rastreamento inconsistente do verme da cabeça à cauda (rotulado de “cauda à cabeça”). Isso resulta em vermes sendo orientados em diferentes direções (ou seja, cauda-a-cabeça versus cabeça-a-cauda) no alinhamento. Rastreamento incompleto (rotulado como “incompleto”). Isso resulta apenas na parte do verme que foi traçada para ser cortada para a montagem. Incluindo múltiplos vermes em um único traço (rotulado de “verme com duas cabeças”). Isso resulta em vermes mais (seções significativas de) seus vizinhos sendo inseridos no mesmo painel da montagem. Adicionando linhas aleatórias à imagem (rotulada como “aleatória”). Isso resulta na inserção de painéis aleatórios na montagem. Para a criação da montagem, não é um problema se duas linhas individuais se cruzam (rotuladas como “interseção”) ou forem unidas em cada extremidade do worm (rotulado “unidos”), desde que cada linha rastreie todo o comprimento de um worm individual: o script de alinhamento worm individualmente e sequencialmente seleciona cada linha ROIs, culturas e endireita-lo, de modo que cada painel na montagem final representará um único traço de linha. No caso dos vermes interseccionais, no entanto, embora vermes endireitados de comprimento total apareçam para vermes “intersecting1” e worm “intersecting2” na montagem (ver Figura 5A-B), é claramente perceptível que esses vermes se cruzam na imagem geral original. Portanto, pode-se concluir que a identificação visual de linhas intersetoriais é possível a partir da imagem de sobreposição encontrada na subpastora ‘dados'(Figura 5A),bem como dos painéis de vermes individuais namontagem (Figura 5B). Além disso, qualquer sobreposição de worms/linhas pode ser identificada a partir da tabela de controle de qualidade (QC) gerada para cada imagem processada pelo Worm-align e salva na subpasta de dados. Esta tabela registra três parâmetros para cada uma das linhas ROIs desenhadas na imagem (ver Figura 5C): Destes, o comprimento indica o comprimento do ROI de linha, que é um bom indicador do tamanho do worm; e o número do Worm indica a ordem em que as linhas foram desenhadas na imagem de visão geral. Finalmente, a última coluna indica se há sobreposição entre o worm/linha em questão e qualquer um dos outros worms/linhas selecionados na imagem. Em caso de sobreposição, o número nesta coluna será diferente do listado na coluna número worm. Em combinação com a imagem de sobreposição, a tabela QC deve ajudar o pesquisador a tomar decisões aprendidas sobre quais vermes devem ser excluídos da montagem e/ou quantificação. A saída de Worm-align pode ser usada para quantificação subsequente da intensidade da fluorescência em worms únicos. Em FIJI, os ROIs de linha podem ser usados para medir a intensidade da fluorescência nos dados de imagem originais, por exemplo, executando o simples script FIJI ‘ Worm-quant.ijm’, que também pode ser encontrado no repositório de linha worm no Github. Alternativamente, a saída de alinhamento worm pode ser importada para software de análise de imagem de terceiros. Demonstramos isso importando a saída de dois conjuntos de dados de alinhamento worm em Worm_CP, um pipeline que geramos no CellProfiler. Worm_CP usa os arquivos na subpaste ‘CellProfiler’ da pasta de saída de alinhamento worm para ajustar máscaras de segmentação desses worms individuais selecionados durante a execução da macro de alinhamento worm. Especificamente, ele usa a máscara de linha (chamada: Lines_) para isolar vermes selecionados da população de vermes vistas na máscara binária (chamada: Mask_). Deve-se notar que as linhas que se cruzam na imagem de visão geral(Figura 5A),embora não seja um problema para a geração de montagens, são problemáticas para o Worm_CP pipeline. Por que este é o caso, é ilustrado na Figura 5 D-E. Worm_CP usa a máscara de linha (Figura 5D), e não ROIs individuais para auxiliar na identificação de vermes individuais. A linha de intersecção desenhada em segundo lugar durante a execução do Worm-align é sobreposta na primeira linha e, portanto, a intensidade ao longo desta linha será a de ROI2, incluindo na broca onde a linha 1 e 2 se sobrepõem. Como resultado, o CellProfiler segmentará a linha2 como um objeto, mas a linha1 como dois objetos separados onde ele se cruza com a linha2. Isso significa que o CellProfiler produzirá duas (metade) máscaras de verme para worm ‘intersecting1′(Figura 5E). A maneira mais fácil de excluir esses eventos da análise final (se necessário), é identificar o número de worms de interceptação da tabela QC (subpatos de dados) e remover medições desses worms dos arquivos de saída cellProfiler. Observe que os worms não serão necessariamente alocados no mesmo número em FIJI e CellProfiler: Para identificar o número de worm FIJI na saída cellProfiler, olhe os valores de Intensity_Max_Intensity no arquivo de saída ‘Linhas.csv’. Qualquer Intensity_Max_Intensity valor que aparece na tabela ‘Linhas.csv’ mais de uma vez por imagem é uma indicação dessa linha ROI resultando em uma máscara de verme fraturada. Uma vez segmentadas máscaras de vermes individuais, Worm_CP pode medir a intensidade da fluorescência nos worms selecionados para todos os canais registrados. Todas as medidas são tomadas a partir dos dados originais (brutos) da imagem, embora deva ser observado que o CellProfiler redimensiona automaticamente a intensidade do pixel em uma escala de 0-1. Isso é conseguido dividindo o valor de intensidade de pixel bruto pela intensidade máxima possível de pixels para a imagem. No caso de imagens de 8 bits este valor é de 255, e no caso de imagens de 16 bits é 65535. Os valores de intensidade do CellProfiler precisam, portanto, ser multiplicados pelo valor máximo de intensidade possível para recuperar valores equivalentes aos dados de imagem bruta. A saída Worm_CP consiste em dois arquivos csv, ‘worms.csv’ e ‘Linhas.csv’ que são salvos na pasta de saída selecionada. Ao inspecionar esses arquivos, é claro que o CellProfiler registra um grande número de parâmetros relacionados à intensidade da fluorescência. Destes, o Intensity_IntegratedIntensity corresponde à fluorescência total por verme (ou seja, a soma da intensidade da fluorescência dentro de todos os pixels que interpretam a máscara de um verme individual). O parâmetro Intensity_MeanIntensity refere-se à intensidade média de fluorescência dentro de um verme individual (ou seja, a intensidade média de fluorescência por pixel para todos os pixels contidos dentro de um worm individual). Devido à ocorrência ocasional de (pequenos) erros na segmentação das máscaras de vermes, recomenda-se que as medidas da MeanIntensity sejam utilizadas ao comparar medições de fluorescência de vermes individuais entre duas condições. Se quiser substratar a fluorescência de fundo de medições quantificadas, use as medições chamadas MeanIntensity_Threshold. Utilizamos o Worm_CP pipeline para quantificar a intensidade de fluorescência de animais fixos que foram rotulados com um corante fluorescente que incorpora gotículas lipídicas (LDs)(Figura 6). Para validar a quantificação da fluorescência do pipeline worm-align/Worm_CP, quantificamos a intensidade de fluorescência no mesmo conjunto de worms do conjunto de dados BODIPY pelo pipeline de linha de worm/Worm_CP ou quantificação manual em FIJI/ImageJ. A quantificação manual foi realizada em FIJI/ImageJ circulando cada verme, bem como uma zona de fundo escura em cada imagem. A intensidade da fluorescência foi medida no gerenciador do ROI e o valor medido para o fundo da imagem foi subtraído da medição da fluorescência do verme de cada verme, conforme descrito17. Comparamos vermes N2 do tipo selvagem (WT) com mutantes dbl-1(nk3), que exibem menor teor de gotículas lipídicas18. Como esperado, a intensidade da fluorescência verde é significativamente diminuída entre os vermes WT e dbl-1(nk3) com ambos os métodos(Figura 6A,B). Exemplos de vermes alinhados podem ser observados na Figura 6C,D. O teor de gotícula lipídica é reduzido em 17% (p-value<0,0001, t-test não pago) entre WT e dbl-1(nk3) usando quantificação manual e 14% (p-value=0,0051 t-test não pago) usando o Worm_CP pipeline. A diminuição do teor de gotículas lipídicas observada aqui no dbl-1(nk3) com ambos os métodos de quantificação está de acordo com a literatura18. Isso mostra que a quantificação de imagens de fluorescência adquiridas com o Worm_CP pipeline CellProfiler é comparável à quantificação manual. Também usamos Worm_CP para quantificar a resposta de choque térmico em vermes vivos expressando GFP sob controle do gene indutível de choque térmico hsp-70(C12C8.1)9. A Figura 7 mostra imagens representativas de C. elegans ao vivo carregando o hsp-70(C12C8.1)p::Repórter GFP. Na ausência de estresse térmico, os vermes não induzem a expressão GFP(Figura 7A,B). No entanto, quando os vermes são expostos a um curto choque térmico de 30 min a 34 °C, eles induzem a expressão GFP(Figura 7C,D). Os níveis de expressão GFP com e sem choque térmico são quantificados na Figura 7E. Do jeito que está, Worm_CP é um oleoduto muito básico. No entanto, essa abordagem permite uma segmentação mais precisa de máscaras de vermes individuais, o que permite uma quantificação mais precisa da intensidade de fluorescência nesses vermes selecionados a partir da imagem. Por essa razão, preferimos essa abordagem em vez de uma quantificação áspera em FIJI, usando apenas as máscaras de linha. Além disso, o CellProfiler oferece a vantagem de que módulos de análise adicionais podem ser facilmente incluídos no pipeline. Por exemplo, para o conjunto de dados que analisa o conteúdo de gotículas lipídicas, a inserção de módulos adicionais no Worm_CP pipeline poderia investigar números de gotículas lipídicas e intensidade de fluorescência de gotículas individuais nesses worms selecionados nas imagens de visão geral. Figura 1: Gerando uma micropipette bucal. Um capilar de vidro é estendido na chama de um queimador bunsen(A),até que forneça extremidades alongadas finas(B). O capilar de vidro estendido é então conectado à peça adaptadora da micropipette bucal. (C) Esquema de uma micropipette bucal. A micropipette bucal foi montada com um capilar de vidro conectado a um adaptador. Um tubo de silicone de 6 mm conecta o adaptador a um filtro de seringa de 0,2 μm, usado para segurança. A outra extremidade do filtro é anexada a um tubo de silicone de 3 mm terminando com uma ponta de filtro de 1mL. O experimentador pode aspirar através da ponta do filtro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Aspiração do líquido ao redor da pelota de minhoca, utilizando a micropipette bucal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Adicionando o deslizamento de tampas nos worms que estão na almofada de agarose Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Exemplos de alisamento de vermes usando worm-align em imagens de fluorescência adquiridas de animais vivos carregando o repórter transcricional fat-7p::GFP no intestino e um marcador vermelho de co-injeção na faringe(mio-2p::tdtomato). (A) Captura de tela de uma imagem composta adquirida no microscópio fluorescente de vermes vivos no terceiro dia da vida adulta. A imagem foi aberta com Worm_align e linhas foram desenhadas ao longo do eixo longitudinal dos vermes usando worm-align. (B) Captura de tela da mesma imagem que em (A), com exemplos comentados de desenho bom e ruim das linhas ao longo do eixo dos worms, usando Worm-align. (C) Exemplos de linhas desenhadas em cima de vermes que podem subir a vermes alinhados incorretamente. Saída alinhada com worms dos worms selecionados em B. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60 ms e intensidade de fluorescência vermelha = 8, exposição=60 ms. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Exemplos de endireitamento de vermes usando worm-align em worms interseccionais. (A) Captura de tela de uma imagem composta adquirida no microscópio fluorescente de vermes vivos no 3º dia de animais adultos carregando o repórter transcricional fat-7p::GFP no intestino e um marcador vermelho de co-injeção na faringe(mio-2p::tdtomato). Os vermes interseccionais são rotulados como “intersecting1” e “intersecting2”, enquanto os vermes não sobrepostos são rotulados como “good3” e “good4”. (B) Montagem criada por Worm-align representando vermes endireitados selecionados em (A). É perceptível na montagem que os vermes 1 e 2 estavam se cruzando na imagem original (vermes rotulados como “intersecting1” e “intersecting2”). (C) Captura de tela da tabela QC do Worm-align que permite detectar casos em que os worms se cruzam. Comprimento: comprimento da linha ROI; número de verme: ordem em que as linhas foram desenhadas; última coluna indica se há uma sobreposição entre o worm/linha de interesse e qualquer outro verme. Neste exemplo, o verme na primeira bruto (número de verme1) se sobrepõe ao worm número 2, conforme indicado pelo número “2” na última coluna. (D) Captura de tela das linhas desenhadas com worm-align nos quatro worms selecionados em A. (E) Captura de tela das máscaras geradas pelo Worm-align nos quatro worms selecionados em A, mostrando como as máscaras para os dois vermes interseccionais são renderizadas. Neste caso, duas máscaras em vez de uma estão agora correspondendo ao verme “intersecting1”. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela Materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60ms e intensidade de fluorescência vermelha = 8, exposição = 60 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: O Worm_CP pipeline quantifica a fluorescência tão precisamente quanto a quantificação manual. Comparação da quantificação da fluorescência de vermes adultos jovens fixados e manchados para conteúdo de gotícula lipídica com o corante fluorescente verde BODIPY, utilizando Worm_CP pipeline (A) ou quantificação manual(B). O teor de gotículas lipídicas de WT e dbl-1 (nk3) foi monitorado por animais de fixação e coloração com BODIPY, que se intercala em ácidos graxos de gotículas lipídicas (ver protocolo A). Os animais adultos jovens foram fixados com isopropanol de 60% e manchados com BODIPY por 1h. O mesmo conjunto de animais foi quantificado utilizando o Worm_CP pipeline (ver etapa 7) ou por quantificação manual de acordo com os procedimentos padrão17. (A) Quantificação da fluorescência usando Worm_CP pipeline. WT: n=22 animais, fluorescência média= 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3): n=25 animais, fluorescência média= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Teste t não pago. (B) Quantificação manual da fluorescência. WT: n=22 animais, fluorescência média = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 animais, fluorescência média = 0,8632 ± 0,109 SD. Teste t não não pago. (C, D) Exemplo representativo ou saída worm-Align para animais WT(C) e dbl-1(nk3) (D) endireitados com o pipeline de alinhamento worm. As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela Materiais) com intensidade de fluorescência verde=2, exposição=60ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Exemplo de quantificação de fluorescência e alinhamento de vermes vivos a partir de imagens de fluorescência de vermes vivos carregando o repórter transcricional hsp-70(C12C8.1)p::GFP após choque térmico. (A) Após um curto choque térmico (30 min a 34 °C), vermes adultos jovens foram recuperados em sua temperatura de cultivo (25 °C) e montados em seguida, imagens 3,5h após choque térmico. Cerca de 30 vermes foram quantificados após choque térmico usando o oleoduto de alinhamento worm. (A-B) Exemplos de vermes alinhados que não foram expostos ao choque térmico. (C-D) Exemplos de vermes chocados com o calor carregando hsp-70(C12C8.1)p::GFP usando worm-align. (E) mostra a intensidade média do GFP (Worm_CP parâmetro: MeanIntensity_Threshold) de MCC jovens adultos adultos cultivados, sem choque térmico ou após exposição a choque térmico (34 °C por 30 min). As imagens foram tiradas com um objetivo de 20x em um microscópio widefield invertido (ver tabela materiais) com intensidade de fluorescência verde=1, exposição=60ms; sem HS: n=12, HS: n=32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1: Localização em FIJI onde a macro de alinhamento de worm pode ser encontrada, uma vez instalada. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 2: Seleção da pasta contendo todas as imagens tiradas com as mesmas configurações. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 3: Geração de 4 subpastas na pasta de saída em FIJI. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 4: Desenho de uma linha através da largura do worm e configurações do canal para a montagem. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura Suplementar 5: Visualização da imagem com as configurações aplicadas. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura Suplementar 6: Desenho de uma linha ao longo do eixo longitudinal dos vermes de interesse para inclusão na montagem e/ou quantificação. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 7: Montagem dos worms selecionados na pasta de saída, em pasta “alinhada”. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura Suplementar 8: Eliminando imagens anteriores de análises anteriores em Cell Profiler. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 9: Importação de metadados para CellProfiler da pasta de saída de alinhamento de worms selecionando a subpasta Configurações.csv. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 10: O pipeline CellProfiler Worm_CP.cpproj usa as imagens Lines_ para acionar os worms selecionados (A), e produz máscaras de vermes únicos dos worms de interesse (C). O gasoduto também mede a intensidade de fundo (B). Perspectiva de todos os parâmetros medidos pelo pipeline Worm_CP.ccproj que são exportados em um arquivo csv (D). Clique aqui para baixar este arquivo. Figura Suplementar 11: Seleção de arquivos de saída no “ExportToSpreadsheet no pipeline Worm_CP.cpproj. Clique aqui para baixar este arquivo.