ליישר תולעת Worm_CP, שני צינורות קוד פתוח ליישור וכימות של נתוני תמונה פלואורסצנטיים המתקבלים מ- Caenorhabditis elegans
Summary
Worm-align/Worm_CP היא זרימת עבודה פשוטה FIJI /CellProfiler שניתן להשתמש בה כדי ליישר וליישר דגימות אלגנס Caenorhabditis ולהבקיע תותלעת שלמה מבוססת תמונה assays ללא צורך בשלבי אימון קודמים. יישמו תולעת ליישר / Worm_CP לכימות של ביטוי הנגרמת הלם חום בבעלי חיים חיים או טיפות השומנים בדגימות קבועות.
Abstract
בעיה נתקלת לעתים קרובות בעת רכישת נתוני תמונה מ C. elegans קבוע או הרדמה היא כי תולעים לחצות אשכול עם שכניהם. בעיה זו מחמירה עם צפיפות הולכת וגדלה של תולעים ויוצרת אתגרים להדמיה וכימות. פיתחנו זרימת עבודה מבוססת FIJI, Worm-align, שניתן להשתמש בה כדי ליצור מונטאז’ים חד-ערוציים או רב-ערוציים של תולעים שנבחרו על-ידי המשתמש, מיושרות ומיושרות מנתוני תמונה גולמיים של C. elegans. יישור תולעים הוא זרימת עבודה פשוטה וידידותית למשתמש שאינה דורשת הכשרה מוקדמת של המשתמש או של אלגוריתם הניתוח. מונטאז’ים הנוצרים עם יישור תולעת יכולים לסייע בבדיקה החזותית של תולעים, בסיווגן ובייצוגן. בנוסף, ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכימות עתידי של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, ישירות ב- FIJI, או בפלטפורמות תוכנה אחרות לניתוח תמונה. אנו מדגימים זאת על-ידי ייבוא פלט יישור התולעת Worm_CP, צינור המשתמש בתוכנת CellProfiler בקוד פתוח. הגמישות של CellProfiler מאפשרת שילוב של מודולים נוספים להקרנת תוכן גבוה. כדוגמה מעשית, השתמשנו בצינור על שתי ערכות נתונים: ערכת הנתונים הראשונה היא תמונות של תולעי כתב הלם חום המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של המקדם של הלם חום בלתי ניתן לריפוי hsp-70, ואת ערכת הנתונים השנייה הם תמונות המתקבלות תולעים קבועות, מוכתם עבור מאגרי שומן עם צבע פלואורסצנטי.
Introduction
אורגניזם פשוט יחסית, nematode C. elegans, היא מערכת מודל שימושי מאוד לחקר מחלות אנושיות. כ -38% מהגנים בגנום C. elegans יש עמיתים פונקציונליים בבני אדם1,2. אחד המאפיינים הייחודיים של C. elegans הוא שהוא שקוף אופטית, ומאפשר גישה קלה למידע in vivo לגבי (תת) ביטוי תאי של כתבים פלואורסצנטיים על פני רקמות. זה עושה C. elegans אורגניזם מודל הממשלה עבור מסכי תוכן גבוה באמצעות פלטפורמות מבוססות תמונה3. עם זאת, נושא אחד שלעתים קרובות מסבך מחקרים אלה הוא שכאשר מדמיינים אוכלוסיות צפופות של תולעים, הם נוטים לחצות ולהתקבץ, מה שהופך את ההשוואות בין תולעים בודדות למאתגרות, ומערפל ניתוח תמונה לכימות במורד הזרם.
פתרונות קיימים המתגברים על בעיה זו מסתמכים בדרך כלל על אופטימיזציה של פרוטוקול culturing והדמיה, כגון באמצעות שימוש במיקרו-נוזליםהגדרות 4, המאפשר תולעים בודדות להיתפס בתמונותנפרדות 5,6. אחרים יישמו אלגוריתמים של למידת מכונה המאפשרים הכרה בתולעים בודדות, אפילו באוכלוסייה מגושמת. דוגמה מצוינת של האחרון הוא WormToolbox, שהוא הרחבה מודולרית של פלטפורמת ניתוח תמונה קוד פתוח, CellProfiler7. WormToolbox מציעה תפוקה גבוהה ופתרון תוכן גבוה לניתוח של C. elegans, וברור היתרונות של הכללתו CellProfiler, כמו מודולי ניתוח נוספים ניתן לכלול בקלות. למרות WormToolbox מגיע מסופק עם מודל מאומן מראש (ברירת מחדלWormModel.xml), הסבה של אלגוריתם למידת מכונה נדרש בדרך כלל עבור כל יישום חדש. הדרכות מקוונות על איך לעשות את זה זמינים על Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). למרות זאת, התקנה ושימוש WormToolbox דורש השקעת זמן משמעותית עבור משתמשים טירון.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני בזמן לתרבות, ואוכלוסיות תדמיתיות של C. elegans. כדי לאפשר הערכה של תולעים בודדות בתמונות שנרכשו פיתחנו זרימת עבודה פשוטה מבוססת פיג’י בקוד פתוח, בשם Worm-align. ניתן להשתמש ליישור תולעים כדי ליצור מונטאז’ים חד-ערוציים או רב-ערוציים של תולעים מיושרות ומיושרות. ראשית, על המשתמש לבחור באופן ידני תולעים בודדות לניתוח על-ידי ציור קו מהראש לזנב. יישור תולעים ישתמש בבחירה זו כדי לחתוך תולעים נבחרות מתמונת הסקירה, וליצור מונטאז’ שבו תולעים נבחרות מיושרות ומיושרות כדי להקל על השוואה חזותית והצגה.
בנוסף, ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכימות עתידי של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, ישירות ב- FIJI, או בפלטפורמות תוכנה אחרות לניתוח תמונה. אנו מדגימים זאת על-ידי ייבוא פלט יישור התולעת Worm_CP, צינור המשתמש בתוכנת CellProfiler בקוד פתוח. הגמישות של CellProfiler מאפשרת שילוב של מודולים נוספים להקרנת תוכן גבוה. השתמשנו בצינור Worm_CP כדי לכמת את תגובת הלם החום, מנגנון הגנה שמור היטב כי refolds חלבונים כי הם misfolded עקב לחצים כגון טמפרטורהגבוהה 8. באופן ספציפי, יישנו את הצינור על תולעים הנושאות טרנסג’ין מרובה עותקים משולב, שבו המקדם של גן בלתי ניתן לחיסון הלם חום, hsp-70(C12C8.1), כוננים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)9. השתמשנו גם בצינור Worm_CP על בעלי חיים קבועים שתויגו בצבע פלואורסצנטי המדמיין טיפות שומנים (LDs), איבר אחסון השומן העיקרי ב C. elegans10. בעוד שלזרימת עבודה זו אין את התפוקה המוצעת על ידי WormToolBox, היא אלטרנטיבה ידידותית למשתמש ופשוטה להצגה חזותית וניתוח של ניסויים מבוססי תמונה C. elegans.
Protocol
1. קיבוע תולעים להדמיית תוכן שומן באמצעות צבע פלואורסצנטי עבור טיפות שומנים (BODIPY)10 הכן אוכלוסייה מסונכרנת של C. elegans על ידי הלבנה על פי נהליםסטנדרטיים 2. צלחת על 1,000 תולעים L1-שלב על 9 ס”מ נמטודה צמיחה מדיה (NGM) צלחת לכל מצב.הערה: יותר תולעים מוכנות מאשר מכומתות בפועל בסוף, עקב אובדן תולעים בעת הטיפול. כדי דימוי בעלי חיים בשלב מבוגר צעיר (סביב 50 שעות פוסט ציפוי L1 ב 20 °C (60 °F), לשטוף כל צלחת 9 ס”מ עם 15 מ”ל של M9 בצינור חרוט, צנטריפוגה ב 252 x גרם במשך 1 דקות, ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף ולהשאיר 1 מ”ל של M9 על גלולה של תולעים. העברה 1 מ”ל של M9 המכיל את התולעים בצינור 2 מ”ל חלבון נמוך מחייב microcentrifuge, באמצעות טיפים שימור נמוך. לסובב למטה ב 252 x גרם במיקרוצנטריפוגה במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant, נזהר לא לגעת גלולת התולעת בתחתית הצינור. לניטור תוכן השומן באמצעות 4,4-דיפלואורו-1,3,5,7,8-פנטמתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-indacene (BODIPY) כתמים10 (רשימת חומרים),לתקן תולעים או על ידי הוספת 0.5 מ”ל של 60% isopropanol לכדור התולעת במשך 3 דקות11, או על ידי הוספת 2 מ”ל של מתנול קר כקרח במשך 10 דקות. עבור שני ההליכים, להפוך את הצינור כל 30 s.התריעה: אם מתנול הוא הריג’נט הקיבעון שנבחר, יש לבצע צעד זה במכסה המנוע של האדים בשל רעילותו. הסר תיקון רב ככל האפשר מבלי לגעת גלולת התולעת ולהוסיף 1 מ”ל של M9. תן לתולעים להתיישב בתחתית הצינור במשך 3-5 דקות. לשטוף שוב עם 1 מ”ל של M9, לתת לתולעים להתיישב ולהסיר את supernatant, משאיר על 50 μL בצינור. אבטח את הצינור באמצעות מלחציים. להקפיא לפצח את התולעים על ידי צלילת הצינור סגור היטב בחנקן נוזלי ולאחר מכן לתוך אמבט מים חמים ב ~ 40 מעלות צלזיוס. חזור על שלב 1.9 פעם נוספת. הוסף 0.5 מ”ל של BODIPY מדולל M9 בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם / μL ומקום על מסובב בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. לאחר 1 שעות, תן לתולעים להתיישב בתחתית הצינור במשך 3-5 דקות. הסר על טבעי ולהוסיף 1 מ”ל של M9. תן לתולעים להתיישב בתחתית ולהסיר על טבעי.הערה: לחילופין, ניתן להסתובב למטה ב 252 x g במשך 1 דקות, כמו זה לא נראה להשפיע על המורפולוגיה. הוסף 0.5 מ”ל של M9.הערה: אם התיקון הוא 60% isopropanol, התולעים יכול להיות מנוצל רק בתוך 48 שעות. אם התיקון הוא מתנול, התולעים צריך להיות מנוצל בתוך 24 שעות. 2. הכנת רפידות אגרוז להרים את התולעים הערה: השלב הקריטי בעת הכנת כרית אגרוז הוא להשיג כרית של עובי רגיל. אחרת, תולעים על פני כרית יהיה במישורים מוקד שונים, מה שהופך את זה מסובך לקבל תמונה ממוקדת של שדה ראייה רחב יותר. הכן 2% רפידות אגרוז על ידי הוספת 0.2 גרם של אגרוז ל 10 מ”ל של H2O מעוקר בבקבוק או בקבוק חרוט. מחממים במיקרוגל במשך 30 עד שהאגוז מתחיל לרתוח.הערה: אין להתחממות יתר ולעצור ברגע שיופיעו בועות; אחרת זה מגביר את צמיגותו של אגרוז מה שהופך אותו קשה יותר להשיג את עובי כרית הרצוי. לאחר שהתעוררות נמסה, לוותר על טיפה של אגרוז נמס במרכז מגלשת זכוכית מיקרוסקופ באמצעות קצה פיפטה μL 1000 עם לחתוך סוף מאוד שלה. מיד, אבל בעדינות, להחזיק עוד שקופית זכוכית קרוב מאוד טיפת אגרוז ולשחרר אותו על אגרוז כדי ליצור כרית של עובי קבוע לתוצאות מיקרוסקופיה הטובה ביותר.הערה: שחרור השקופית העליונה מגובה לא רק ליצור בועות אבל יגרום כרית אחידה. לחלופין, ניתן גם להשתמש בשתי מגלשות זכוכית המאגפים את השקופית עם הפנקס, עם שכבה דקה של סרט הדבקה בכל שקופית. לאחר מינימום של 2-3 דקות, להסיר בעדינות את השקופית העליונה. באמצעות הצד של השקופית העליונה, חתוך את הפנקס כדי להפוך אותו בצורת ריבוע. הר את התולעים בתוך 5 דקות, כדי למנוע את כרית ייבוש לפני השימוש. 3. הרכבה תולעים קבועות להדמיה צור מיקרופיגט בפה על ידי הרחבת נימי זכוכית דקים בלהבה של מבער בונזן (איור 1A). לאחר הארכה בלהבה, שוברים את נימי הים לשני חלקים (איור 1B). בחר את ההולם ביותר, בדרך כלל הארוך ביותר, ולבדוק אם סוף נימי פתוח על ידי מנסה שאפת מים.הערה: אם הנוזל אינו נכנס נימי, הוא דק מדי או חסום. חותכים בעדינות את קצה נימי עם זוג מספריים, הימנעות חיתוך יותר מדי כמו תולעים יהיה שאפתן אם החור הוא גדול מדי. חבר את נימי הזכוכית מהשורה 3.1 למתאם נימי (איור 1C), המקושר לצינור הסיליקון 6 מ”מ וחבר את הקצה השני של צינור הסיליקון 6 מ”מ למסנן 0.2 מיקרומטר, המחובר לצינור סיליקון 3 מ”מ בקצה השני שלו (איור 1C). חבר קצה מסנן של 1 מ”ל (איור 1C) לקצה החופשי של צינור הסיליקון 3 מ”מ כדי לשאוף נוזל.הערה: מסנן μm 0.2 מתווסף בין הפה של הניסוי נימי, כדי להבטיח בטיחות מקסימלית של הניסוי. פתרון דומה משמש עבור מיקרופיטים בפה המשמשים לטיפול בעוברים עכבר12. לשנות את המסנן (בדרך כלל כל כמה חודשים) אם micropipette הפה אינו שאפו נוזל יותר. באמצעות מיקרופיפט הפה תחת מיקרוסקופ דיסקט, הסר נוזלים רבים ככל האפשר סביב גלולת התולעת של תולעים קבועות (איור 2).הערה: צינורות supernatant החוצה באמצעות micropipette ידני יכול לשמש כחלופה פיפטים הפה בשלבים 3.1 כדי 3.3 כדי להסיר על טבעי ככל האפשר. הוסף 6 μL של מדיום הרכבה. אנו מוצאים, עם זאת, כי שיטה זו אינה פועלת ביעילות כמו כי נוזל מוגזם רפידות יוצר צפיפות תולעת דליל, מה שהופך הדמיה זמן רב יותר. חדש את שלב 3.6. תסתכל על החלק התחתון של הצינור וודא כי פיפטה לא שאף את התולעים. הוסף במהירות 10 μL של מדיוםהרכבה (רשימתחומרים) לתחתית הצינור. יש לשטוף קצה של 10 μL ב-PBS עם עקבות של חומר ניקוי (0.01% טריטון), כדי למנוע מתולעים להידבק לצדדים של קצה פיפטה מפלסטיק. חותכים את הקצה של הקצה עם זוג מספריים. העברה 8 μL של מדיום הרכבה המכיל את התולעים על כרית אגרוז מוכן בשלב 2.3. מתחת למיקרוסקופ, לנער בעדינות את השקופית, כדי למנוע חפיפה של התולעים. מכסים את טיפת מדיום ההרכבה על כרית אגרוז עם כיסוי של 18 מ”מ x 18 מ”מ (איור 3).הערה: כיסויים קטנים יותר עדיפים מכיוון שהם מפעילים פחות לחץ על התולעים. החזק את כיסוי עם זוג פינצטה ולהחיל קצה אחד של כיסוי על כרית agarose, לפני בעדינות הפקדת coverslip עם פינצטה. 4. הרכבה של תולעים חיות להדמיה הערה: כדי לדמיין תולעים חיות, הן חייבות להיות משותקות על הפנקס. אחת הדרך להשיג זאת היא לשתק אותם עם אגוניסט הקולטן הניקוטיני: levamisole (רשימת חומרים). פיפטה 3-4 μL של 3 mM levamisole מומס M9 על כרית אגרוז שנוצר בשלב 2.3.הערה: צריך להיות מספיק נפח נוזלי כי התולעים אינן על גבי אחד את השני אבל לא יותר מדי נוזלים כי התולעים דליל מדי על כרית. קוטפים תולעים מנוסים יכולים להשתמש 3 μL של levamisole. קוטפים מנוסים פחות ייתכן שיהיה צורך להוסיף נפח גדול יותר של levamisole, כך levamisole לא לגמרי להתאדות. בחר 30-50 תולעים לכל תנאי לתוך טיפת levamisole. מכסים את טיפת levamisole על כרית אגרוז עם כיסוי 18 מ”מ x 18 מ”מ. תולעי תמונה בתוך 1 שעות, כמו הסוכן המשתק בסופו של דבר יוביל למוות של התולעים. 5. הדמיית שקופיות עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם כרית agarose של עובי אחיד, תמונה כל התולעים על השקופית בבת אחת באמצעות 6 x 6 או 7 x 7 תמונה גדולה למשל עם המטרה 20x של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם עובי הפנקס אינו שווה, רכוש מספר תמונות קטנות יותר של 3 x 3 או 4 x 4 של אותה שקופית. השתמש באותן הגדרות עבור עוצמת פלואורסצנטיות ותזמן חשיפה עבור כל התנאים. התאם כל הגדרה כך שתתאים לשקופית בעוצמה הבהירה ביותר, כדי להבטיח שלא תהיה רוויית פיקסלים. לקבלת הוראות ספציפיות לגבי רכישת תמונה, בצע את ההוראות של יצרן המיקרוסקופ. 6. יצירת תמונות מונטאז’ של תולעים בודדות מיושרות באמצעות צינור FIJI ליישור תולעים התקן את חבילת התוכנה לניתוח תמונות קוד פתוח FIJI13/ImageJ14 https://imagej.net/Fiji. אם התקנה קודמת של FIJI זמינה, ודא שהיא מתעדכנת לגירסה 1.52a או גירסה מתקדמת יותר, מכיוון שחלק מהפונקציות המשמשות במאקרו (לדוגמה, פונקציות טבלה) דורשות זאת. הורד את המאקרו ליישר תולעת מ Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align. פתח את FIJI והפעל את המאקרו יישור תולעת. ביצוע יישור תולעת על-ידי לחיצה על | פקודות מאקרו | הפעל שורת התפריטים הראשית של FIJI (איור S1). עכשיו לאתר את התסריט Worm-align.ijm במחשב. המאקרו מאותחל על-ידי בקשת מיקום התמונות. הצינור יפעל הן על תמונות פלואורסצנטיות חד-ערוציות והן על תמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות (איור S2). בחר תיקיית קלט והמאקרו ייצור באופן אוטומטי תיקיית פלט שבה יישמרו כל התוצאות (איור S3).הערה: חשוב שהתיקיה שנבחרה תכיל רק קבצי תמונה, כיוון שנוכחות תבניות קובץ אחרות תגרום למאקרו לקרוס. באופן אידיאלי, רק לקבץ יחד תמונות שנלכדו עם אותן הגדרות מיקרוסקופ. יישור תולעת יקבל תבניות קובץ רבות ושונות, כולל nd2, czi, tif, rgb, jpg ו- png. שם תיקיית הפלט יהיה זהה לתיקיית הקלט, כאשר ‘_output’ נוסף כ- postfix, כלומר אם תיקיית הקלט היא ‘תמונות’, הפלט יימצא ב’ images_output’. תיקיית הפלט תכיל ארבע תיקיות משנה, שבהן יישמרו הנתונים. אפשר למאקרו להמשיך לפתוח את התמונה הראשונה תיקיית הקלט ולהשתמש בה כתמונה מייצגת כדי לחלץ הגדרה כדי ליצור את המונטאז’.הערה: יישור תולעת יבחר באופן אוטומטי את התמונה הראשונה תיקיית הקלט כדי ליצור את ההגדרות שיחולו על כל התמונות האחרות בתיקיה. אם תמונה אחרת נחשבת למייצגת יותר של ערכת הנתונים, ודא שתמונה זו נבחרת על-ידי שמירת עותק של התמונה תיקיית הקלט, שינוי השם כך שיפורט כעת בראש הרשימה (לדוגמה, ‘0_RepresentativeImage’). בעזרת כלי הציור ‘קו ישר’, צייר קו לרוחב תולעת (איור S4) ולהשתמש באורך קו זה כדי לקבוע את גובה האזורים החתוכים עבור תולעים בודדות. עבור כל ערוץ, ציין את השם, טבלת בדיקת המידע (LUT), הגדרות העוצמה (B&C) ואם יש לכלול אותו במונטאז’ (איור S4).הערה: פרמטרים אלה נרשמים נשמרים בקובץ הגדרות, הגדרות.csv, הממוקם בתיקיית המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט. לאחר לכידת כל ההגדרות, מוצג למשתמש איך ייראו התמונות לאחר יישום ההגדרות שהוחלו (איור S5). סמן את התיבה העליונה אם ההגדרות מספיקות. בחר אפשרויות ליצירת מונטאז’ (הסר קרציות, אם אינן נדרשות): 1. צור מונטאז’ של תולעים נבחרות עבור כל תמונה בודדת, או 2. צור מונטאז’ משולב שבו כל התולעים שנבחרו בכל התמונות שבתיריית הקלט ישולבו במונטאז’ יחיד. לחץ על אישור כדי לבצע את שאר המאקרו.הערה: אם התיבה העליונה אינה מסומנת לפני לחיצה על ‘אישור’ המאקרו יהפעלה מחדש של ההגדרה, כך שניתן יהיה למטב את הגדרות התמונה. צינור יישור התולעת ממשיך כעת לפתוח את כל התמונות תיקיית הקלט. עבור כל תמונה, צייר קווים על ציר האורך של כל התולעים שייכללו במונטאז’ ו/או לכמת (איור 4 ואיור S6)באמצעות הכלי ‘קו מקולח’ (שורת התפריטים הראשית של FIJI). כדי להבטיח יישור נכון של התולעת, צייר קווים באופן עקבי מקצה הראש עד הזנב (או להיפך), ולאורך התולעת המלאה (ראה דוגמאות לציור קו “טוב” ו”רע” מאיור 4B). הוסף כל שורה למנהל ההשקעות, על-ידי לחיצה על יישור תולעת Ctrl+T. משתמש בקווים שנוספו למנהל ההשקעות, בשילוב עם פרמטר רוחב התולעת (מוגדר בשלב 6.4) כדי ליצור תמונות חתוכה של תולעים בודדות שנבחרו. אוסף ה- ROIs של השורה נשמר בתקביית המשנה ‘data’. תיקיה זו מכילה גם עותק של התמונה המקורית המציגה את השורות, כמו גם את מספר התולעת. קווים מקודדים בצבע עם טבלת בדיקת Glasbey_on_dark הנתונים. התמונות של תולעים ישרות נשמרות single_worms של תיקיית הפלט. בנוסף, אם אפשרות זו נבחרת בשלב 6.6 של פרוטוקול זה, Worm-align מייצרת מונטאז’ים של כל התולעים שנבחרו לכל תמונת מבט כולל ו/או עבור כל תמונות הסקירה של תיקיית הקלט (ראו איור 4C ואיור S7). מונטאז’ים אלה נמצאים בתיקיות המשנה ‘מיושרות’ של תיקיית הפלט. 7. ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות של תולעת אחת באמצעות הפלט מתולעת ליישר בצינור CellProfiler אוטומטי לעיבוד וניתוח נתונים במורד הזרם של פלט יישור תולעת, הורד והתקן את חבילת התוכנה לניתוח תמונה בקוד פתוח ‘CellProfiler15,16 https://cellprofiler.org/. הורד את Worm_CP.cpproj מ- GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-alignהערה: הצבר לדוגמה המתואר כאן נבנה באמצעות CellProfiler2.2.0 וייתכן שלא יפעל בגירסאות מאוחרות יותר של CellProfiler. לפני הפעלת Worms_CP.cpproj, ודא שכל תמונות הפלט הצפויות נמצאות בתיקיות המשנה CellProfiler של תיקיית הפלט Worm-align: עותק מעובד של התמונה המקורית (בשם: Original_), מסיכת תמונה בינארית של אוכלוסיית התולעים (הנקראת: Mask_), מסיכת קו של הקווים המצוירים על תולעים נבחרות (בשם: Lines_) ותמונה אחת המייצגת כל אחד מהערוצים הקיימים בתמונה המקורית (הנקראת על-ידי מספר ערוץ). כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות בתולעים בודדות, לחץ על מודול הקלט תמונות ופשוט גרור את תיקיית הפלט CellProfiler לחלון שאומר שחרר קבצים ותיקיות כאן. אם רשימת תמונות קיימת מניתוח קודם, הסר אותן תחילה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון ובחירה באפשרות נקה רשימת קבצים. כדי לא לכלול את הקובץ ‘הגדרות.csv’ ברשימת התמונות, בחר ‘תמונות בלבד’ או ‘מותאם אישית’ עם ‘סיומת היא tif, tiff, ome.tif או ome.tiff’ עבור הגדרות המסנן (איור S8). לחץ על מודול קלט מטה-נתונים. בשיטת החילוץ השנייה, לחץ על התיקייה הצהובה ואתר את תיקיית המשנה CellProfiler בתיקיה פלט WormAlign (איור S9). בחרו בקובץ ‘.csv’ וקשרו את הקמורות בקובץ לפלט CellProfiler על-ידי התאמת המטא-נתונים בקובצי CSV לאלה שבתמונות (מטא-נתונים של ערוץ). לחץ על מודול הקלט NamesAndTypes והוסף תמונה חדשה עבור כל ערוץ של התמונה המקורית לכמת.הערה: כבר קיימות בצינור הדוגמה מסיכת התולעת, שתי תמונות צבע, מסיכת הקו והתמונה המקורית ושלוש תמונות בקנה מידה אפור (הערוץ הירוק והעררוץ האדום). יש להתאים את הרשימה במודול זה אם לתמונות המקוריות יש פחות או יותר ערוצים מאשר התמונות לדוגמה. ודא כי שם התמונות בכל תווית עמודה/מסיכה/תולעים נכון.הערה: שמות התמונות בשורה אחת צריכים להתאים לאותה תמונה ראשונית לניתוח. אם נעשתה טעות במהלך תהליך ניתוח התמונה, חלק מתמונות הפלט יהיו חסרות השמות תחת תווית שלוש עמודות / מסיכה / תולעים לא יתאים לאותה תמונה ראשונית יותר עבור כל שורה. אם זה המקרה, למצוא איפה הטעות היא. הקש על הצג הגדרת פלט כדי לבחור את התיקיה לשמירת הפלט מקובץ Cellprofiler. לחץ על הפעל מצב בדיקה. פעם אחת במצב בדיקה, בדוק שוב את הגדרות הצבר על-ידי החלתן על התמונה הראשונה ב ערכת הנתונים, על-ידי לחיצה על הפעל (אשר יפעל דרך כל המודולים הפעילים בצנרת), או על שלב (שיפעל דרך מודול הצינור אחד בכל פעם).הערה: במצב בדיקה, המידות שחולצו לא ייוצאו, גם אם מודול ExportToSpreadsheet קיים (ופעיל) בצנרת. לאחר שהצינור מבצע את הפעולות כפי שהוא צריך, לחץ על צא ממצב בדיקה ולאחר מכן הקש על נתח תמונות. כפי שתצורתו נקבעה כעת, ה-Worms_CP ישתמש (1) בתדמית Mask_ כדי לקטע מסיכת תולעת מחוספסת ואת תמונת ה- Lines_ (איור S10A) כדי ל בודד את התולעים שנבחרו ולייצר מסיכות תולעת בודדות (איור S10C), (2) למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל הערוצים הקיימים בתמונות הקלט באותן תולעים שזוהו והוסוו. הצינור יכול גם למדוד את עוצמת הרקע (איור S10B) ולתקן את כל התמונות בהתאם (מסומן על ידי סף המילה בשם הפרמטרשנמדדIntensity_MeanIntensity_green_threshold. פתח את Worm_CP הכולל שני קבצי csv, תולעים.csv וקווים.csv שנשמרו בתשיית הפלט שנבחרה (ראה איור S11). ניתן לפתוח קבצים אלה ב- Excel או ב- R (Studio) לצורך עיבוד ודיווח לאחר עיבוד ודיווח. אם נדרש פלט נוסף, למשל לכל נתוני תמונה, ניתן לבחור באפשרות זו במודול גליון הייצוא של ExportToSpreadsheet בצנרת.
Representative Results
Culturing והדמיה C. elegans על פי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת תמונות סקירה גדולות של אוכלוסיות תולעים. כדי להקל על בדיקה חזותית וסיווג של תולעים מתמונות אלה פיתחנו תולעת ליישר. יישור תולעים הוא סקריפט פיג’י פשוט וידידותי למשתמש שניתן להשתמש בו כדי ליצור מונטאז’ים של תולעים מיושרות ומיושרות. תולעים נבחרות מתוך תמונות סקירה על ידי ציור קו לאורך הציר האורך של התולעים. לכל תולעת שנבחרה מוקצה מספר, נחתכת ומיישרת, והיא נוספת למונטאז’. מונטאז’ים יכולים להיווצר לכל תמונה או לשלב את כל התמונות מתריית הקלט המקורית. כצפוי, הפלט של הצינור תלוי במידה רבה באיכות הקווים שצוירו על גבי התמונות. כדי להמחיש נקודה זו, איור 4 מציג מספר דוגמאות שורה, ואת הפלט שלהן מישור תולעת. קו שלם מהראש לקצה הזנב מייצר תולעת מיושרת כראוי (שכותרתה “טוב”). איור 4 מראה גם כיצד אי-דיוקי עקיבה במהלך ביצוע יישור תולעת משפיעים על פלט היישור. מתוך המונטאז’ המבאר הכלול איור 4C, יש לדאוג להימנע מהשגיאות הבאות, מכיוון את היישור הנכון של תולעים: מעקב לא עקבי של התולעת מהראש לזנב (שכותרתו “זנב לראש”). התוצאה היא תולעים להיות מוכוון בכיוונים שונים (כלומר, זנב אל ראש לעומת ראש אל זנב) ביישור. מעקב לא שלם (שכותרתו “לא שלם”). התוצאה היא רק החלק של התולעת שאותר להיחיתוך למונטאז’. כולל תולעים מרובות בעקבות בודדות (שכותרתן “תולעת עם שני ראשים”). התוצאה היא תולעים פלוס (חלקים משמעותיים של) שכניהם להיות מוכנס באותו פאנל של מונטאז ‘. הוספת קווים אקראיים לתמונה (שכותרתה “אקראי”). התוצאה היא החדרת לוחות אקראיים במונטאז’. ליצירת מונטאז’ אין זו בעיה אם שני קווים בודדים מצטלבים (המסומן כ”מצטלבים”) או מצורפים בכל קצה של התולעת (המסומן כ”מצורף”), כל עוד כל שורה עוקבת אחר כל אורכה של תולעת בודדת: כתב יישור התולעת בנפרד ובאופן רציף בוחר כל מונפק, יבולים ומיישר אותו, כך שכל פאנל במונטאז’ הסופי ייצג קו מעקב יחיד. עם זאת, במקרה של התולעים המצלבות, למרות תולעים באורך מלא מופיעות לתולעת “מצטלבת1” ותולעת “מצטלבת2″ במונטאז’ (ראו איור 5A-B),ניכר בבירור כי תולעים אלה חוצות זו את זו בתמונת הסקירה המקורית. לכן, ניתן להסיק כי זיהוי חזותי של קווים מצטלבים אפשרי מתמונת שכבת-המשנה שנמצאהבתת-התת-תיקיות’נתונים’ ( איור 5A ), וכן מהלווחות של תולעים בודדות במונטאז’ (איור 5B). בנוסף, ניתן לזהות כל חפיפה של תולעים/קווים מטבלת בקרת האיכות (QC) שנוצרה עבור כל תמונה מעובדת על-ידי יישור תולעים, ולשמר אותה בתת-תיקיית הנתונים. טבלה זו מתעדת שלושה פרמטרים עבור כל אחד מההסבה על ההשקעה של הקו שצוירו בתמונה (ראה איור 5C): מבין אלה, אורך מציין את אורך מעבר ההשקעה של הקו, שהוא מחוון טוב לגודל התולעת; ומספר התולעת מציין את הסדר שבו הקווים צוירו בתדמית הסקירה. לבסוף, העמודה האחרונה מציינת אם קיימת חפיפה בין התולעת/הקו הנדון לבין כל אחת מהתולעים/הקווים האחרים שנבחרו בתמונה. במקרה של חפיפה, המספר בעמודה זו יהיה שונה מהמספר המפורט בעמודה מספר תולעת. בשילוב עם תמונת שכבת-על, טבלת QC צריכה לסייע לחוקר לקבל החלטות מלומדות לגבי אילו תולעים יש להוציא מהמונטאז’ ו/או הכימות. ניתן להשתמש בפלט של יישור תולעת לכימות לאחר מכן של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות. בפיג’י, ניתן להשתמש בהחזרי ההשקעה של הקו כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בנתונים המקוריים של התמונה, לדוגמה על-ידי ביצוע סקריפט FIJI הפשוט ‘ Worm-quant.ijm’, אשר ניתן למצוא גם במאגר יישור תולעת על Github. לחלופין, ניתן לייבא את פלט יישור התולעת לתוכנה לניתוח תמונה של ספק חיצוני. אנו מדגימים זאת על ידי ייבוא פלט יישור תולעת של שתי ערכות נתונים Worm_CP, צינור שיצרנו ב- CellProfiler. Worm_CP משתמש בקבצים בתת-תיקיית המשנה ‘CellProfiler’ של תיקיית הפלט Worm-align כדי לכוונן מסיכות פילוח של תולעים בודדות אלה שנבחרו במהלך ביצוע המאקרו Worm-align. באופן ספציפי, היא משתמשת במסכת הקו (הנקראת: Lines_) כדי לבודד תולעים נבחרות מאוכלוסיית התולעים שנראתה במסכה הבינארית (הנקראת: Mask_). יש לציין כי קווים הצטלבים בתמונת הסקירה (איור 5A), אם כי אינם בעיה עבור דור המונטאז’ים, הם בעייתיים עבור Worm_CP החדש. מדוע זה המקרה, מאויר באיור 5 D-E. Worm_CP משתמש במסכת הקו (איור 5D), ולא בהסברים בודדים כדי לסייע בזיהוי תולעים בודדות. הקו מצטלב שצויר שני במהלך הביצוע של ליישר תולעת הוא על קו ראשון ולכן האינטנסיביות לאורך קו זה יהיה זה של ROI2 כולל בסיביות שבו קו 1 ו 2 חופפים. כתוצאה מכך, CellProfiler יקטע את line2 כאובייקט אחד, אך קו1 כשני אובייקטים המופרדים למקום שבו הוא מצטלב עם line2. משמעות הדבר היא כי CellProfiler יפיק שתי (חצי) מסכות תולעת עבור תולעת ‘מצטלבים1’ (איור 5E). הדרך הקלה ביותר לא לכלול אירועים אלה בניתוח הסופי (אם נדרש), היא לזהות את מספר התולעת של תולעים מצטלבים מטבלת QC (תיקיית משנה של נתונים), ולהסיר מדידות עבור תולעים אלה מקבצי הפלט CellProfiler. שים לב כי תולעים לא בהכרח יוקצו באותו מספר FIJI ו CellProfiler: כדי לזהות את מספר תולעת FIJI בפלט CellProfiler להסתכל על ערכי Intensity_Max_Intensity בקובץ הפלט ‘קווים.csv’. כל Intensity_Max_Intensity המופיע בטבלה ‘קווים.csv’ יותר מפעם אחת בכל תמונה הוא אינדיקציה לכך שההוצאה על ההשקעה של קו זה גורמת למסכת תולעת שבורה. לאחר מקטע מסכות תולעת בודדות, Worm_CP למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתולעים שנבחרו עבור כל הערוצים המוקלטים. כל המדידות נלקחות מנתוני התמונה המקוריים (הגולמיים), אם כי יש לציין ש- CellProfiler משנה באופן אוטומטי את עוצמת הפיקסלים בסולם של 0-1. הדבר מושג על ידי חלוקת ערך עוצמת הפיקסל הגולמי בעוצמת הפיקסל המרבית האפשרית לתמונה. במקרה של תמונות של 8 סיביות ערך זה הוא 255, וגם במקרה של תמונות של 16 סיביות הוא 65535. לפיכך, יש להכפיל את ערכי העוצמה של CellProfiler בערך העוצמה המרבי האפשרי כדי להחזיר ערכים השווים לנתונים הגולמיים של התמונה. פלט Worm_CP מורכב משני קבצי csv, ‘תולעים.csv’ ו.csv קווים’ שנשמרו בתיקיה הפלט שנבחרה. בעת בדיקת קבצים אלה, ברור כי CellProfiler מתעד מספר רב של פרמטרים הקשורים לעוצמת פלואורסצנטיות. מתוך אלה, Intensity_IntegratedIntensity תואמת את הפלואורסצנטיות הכוללת לכל תולעת (כלומר, סכום עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך כל הפיקסלים המפרשים את המסכה של תולעת בודדת). הפרמטר Intensity_MeanIntensity מתייחס לעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בתוך תולעת בודדת (כלומר, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לפיקסל עבור כל הפיקסלים הכלולים בתולעת בודדת). בשל התרחשות מזדמנת של (קטן) שגיאות בפילוח מסכות התולעת מומלץ להשתמש במדידות MeanIntensity בעת השוואת מדידות פלואורסצנטיות של תולעים בודדות בין שני תנאים. אם אתם רוצים להפחית את פלואורסצנטיות הרקע מדידות מכומתות, השתמשו במדידות הנקראות MeanIntensity_Threshold. השתמשנו בצינור Worm_CP כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות מבעלי חיים קבועים שתויגו בצבע פלואורסצנטי המשלב טיפות שומנים (LDs) (איור 6). על מנת לאמת כימות פלואורסצנטיות מצינור Worm-align/Worm_CP, כימתנו את עוצמת הפלואורסצנטיות באותה קבוצת תולעים מתוך ערכת הנתונים BODIPY על-ידי צינור יישור תולעת/Worm_CP או כימות ידני ב- FIJI/ImageJ. כימות ידני בוצע FIJI / ImageJ על ידי הקפת כל תולעת, כמו גם אזור רקע כהה בכל תמונה. עוצמת הפלואורסצנטיות נמדדה במנהל ההשקעות והערך שנמדד עבור רקע התמונה הוחסך ממדידת פלואורסצנטיות התולעת של כל תולעת,כמתואר 17. השווינו תולעי N2 מסוג פראי (WT) למוטנטים dbl-1(nk3), המציגים ירידה בתתוכן טיפת השומנים18. כצפוי, עוצמת הפלואורסצנטיות הירוקה יורדת באופן משמעותי בין תולעי WT ו- dbl-1(nk3) בשתי השיטות (איור 6A,B). דוגמאות לתולעים מיושרות ניתן לראות איור 6C,D. תוכן טיפת השומנים יורד ב- 17% (p-value<0.0001, t-test לא מפורש) בין WT ל- dbl-1(nk3) באמצעות כימות ידני, וב- 14% (p-value = 0.0051 t-test לא מפורש) באמצעות צינור Worm_CP. הירידה בתתוכן טיפת השומנים שנצפה כאן dbl-1(nk3) עם שתי שיטות כימות היא בהתאם לספרות18. זה מראה כי כימות של תמונות פלואורסצנטיות שנרכשו עם הצינור Worm_CP CellProfiler דומה לכימות ידני. השתמשנו גם Worm_CP לכמת את תגובת הלם החום בתולעים חיות המבטאת GFP תחת שליטה של הלם החום גן בלתי ניתן לריפוי hsp-70(C12C8.1)9. איור 7 מציג תמונות מייצגות של אלגנים חיים של C. הנושאים את hsp-70(C12C8.1) מגיב לחום:כתב GFP. בהיעדר עומס חום, התולעים אינן גורמות לביטוי GFP (איור 7A,B). עם זאת, כאשר תולעים נחשפות להלם חום קצר של 30 דקות ב-34 מעלות צלזיוס, הן גורמות לביטוי GFP (איור 7C,D). רמות ביטוי GFP עם ובלי זעזוע חום מכומתות ב איור 7E. כפי שהוא עומד, Worm_CP הוא צינור בסיסי מאוד. עם זאת, גישה זו מאפשרת פילוח מדויק יותר של מסכות תולעת בודדות, המאפשר כימות מדויק יותר של עוצמת הפלואורסצנטיות בתולעים שנבחרו מהתמונה. מסיבה זו, אנו מעדיפים גישה זו על פני כימות מחוספס FIJI, באמצעות רק את מסכות הקו. בנוסף, CellProfiler מציע את היתרון כי מודולי ניתוח נוספים יכולים בקלות להיכלל בצנרת. לדוגמה, עבור ערכת הנתונים שמסתכלת על תוכן טיפת השומנים, החדרת מודולים נוספים לצינור Worm_CP יכולה לחקור מספרי טיפות שומנים ועוצמת פלואורסצנטיות של טיפות בודדות בתולעים אלה שנבחרו בתמונות הסקירה. איור 1: יצירת מיקרופיט פה. נימי זכוכית מורחב בלהבה של מבער בונזן (A), עד שהוא מספק גפיים מוארכות דקות (B). נימי הזכוכית המורחבת מחוברים לאחר מכן לחתיכת המתאם של מיקרופיגט הפה. (ג)סכמטי של מיקרופיקט פה. מיקרופיקט הפה הורכב עם נימי זכוכית מחובר לתוך מתאם. צינור סיליקון 6 מ”מ מחבר את המתאם למסנן מזרק μm 0.2, המשמש לבטיחות. הקצה השני של המסנן מחובר צינור סיליקון 3 מ”מ מסתיים עם קצה מסנן 1mL. הניסוי יכול לספירה באמצעות קצה המסנן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: שאיפת הנוזל המקיף את גלולת התולעת, באמצעות מיקרופיפט הפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הוספת הכיסוי על התולעים הנחת על כרית agarose אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: דוגמאות ליישור תולעים באמצעות יישור תולעת על תמונות פלואורסצנטיות הנרכשות מבעלי חיים הנושאים את כתב התמלול fat-7p::GFP במעי וסמן הזרקת שיתוף אדום בלוע (myo-2p::tdtomato). צילוםמסךשל תמונה מורכבת שנרכשה במיקרוסקופ הפלואורסצנטי של תולעים חיות ביום השלישי לבגרות. התמונה נפתחה עם Worm_align וקווים צוירו לאורך הציר האורך של התולעים באמצעות יישור תולעת. (B) צילום מסך של אותה תמונה כמו ב- (A), עם דוגמאות לציור טוב ורע של הקווים לאורך ציר התולעים, באמצעות יישור תולעת. (C) דוגמאות לקווים המצוירים מעל תולעים שיכולים לעלות לתולעים מיושרות באופן שגוי. תפוקת יישור תולעים של התולעים שנבחרו ב- B. התמונות צולמו עם מטרה של פי 20 במיקרוסקופ שדה רחב הפוך (ראה טבלת חומרים) בעוצמת פלואורסצנטיות ירוקה =1, חשיפה=60 ms ועוצמת פלואורסצנטיות אדומה = 8, חשיפה = 60 ms. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: דוגמאות ליישור תולעים באמצעות יישור תולעים על תולעים מצטלבים. (א) צילום מסך של תמונה מורכבת שנרכשה על המיקרוסקופ הפלואורסצנטי של תולעים חיות ביום 3 של בעלי חיים בוגרים הנושאים את כתב התמלול שומן-7p::GFP במעי וסמן הזרקת שיתוף אדום בלוע (myo-2p::tdtomato). תולעים מצטלבים מסומנות כ”מצטלבים1″ ו”מצטלבים2″, בעוד תולעים שאינן חופפות מסומנות כ”good3” ו-“good4”. (B) מונטאז’ שנוצר על-ידי יישור תולעים המייצג תולעים מיושרים שנבחרו ב- (A). במונטאז’ ניכר כי התולעים 1 ו-2 מצטלבים בתמונה המקורית (תולעים שכותרתן “מצטלבים1″ ו”מצטלבים2”). (C) צילום מסך של טבלת QC מ- Worm-align המאפשר לזהות מקרים שבהם תולעים מצטלבים. אורך: אורך שורת ההשקעה; מספר תולעת: הסדר שבו הקווים צוירו; העמודה האחרונה מציינת אם קיימת חפיפה בין התולעת/קו העניין לבין כל תולעת אחרת. בדוגמה זו, התולעת בגולמי הראשון (מספר תולעת1) חופפת עם תולעת מספר 2, כפי שצוין על-ידי המספר “2” בעמודה האחרונה. (D) צילום מסך של הקווים המצוירים עם יישור תולעת על ארבע התולעים שנבחרו ב- A. (E) צילום מסך של המסכות שנוצרו על-ידי יישור תולעת בארבע התולעים שנבחרו ב- A, המראה כיצד מעובדות המסכות עבור שתי התולעים מצטלבים. במקרה זה, שתי מסכות במקום אחת תואמות כעת לתולעת “מצטלבים1”. התמונות צולמו עם מטרה 20x על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך (ראה שולחן חומרים) בעוצמת פלואורסצנטיות ירוקה = 1, חשיפה = 60ms ועוצמת פלואורסצנטיות אדומה = 8, חשיפה = 60 ms. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: Worm_CP הצינור מכמת פלואורסצנטיות בצורה מדויקת כמו כימות ידני. השוואה של כימות פלואורסצנטיות של תולעים בוגרות צעירות קבועות ומוכתמות לתכולת טיפת השומנים עם הצבע הפלואורסצנטי הירוק BODIPY, באמצעות צינור Worm_CP (A) או כימות ידני (B). תוכן טיפת השומנים של WT ו dbl-1 (nk3) היה במעקב על ידי תיקון וכתמים בעלי חיים עם BODIPY, כי intercalates לתוך חומצות שומן של טיפות השומנים (ראה פרוטוקול A). בעלי חיים בוגרים צעירים תוקנו עם 60% isopropanol מוכתם BODIPY עבור 1h. אותה קבוצה של בעלי חיים כומתו באמצעות צינור Worm_CP (ראה שלב 7) או על ידי כימות ידני על פי נהליםסטנדרטיים 17. (א)כימות פלואורסצנטיות באמצעות Worm_CP צנרת. WT: n = 22 בעלי חיים, פלואורסצנטיות ממוצעת = 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n = 25 בעלי חיים, פלואורסצנטיות ממוצעת = 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. מבחן t לא מפוקד. (ב) כימות ידני של פלואורסצנטיות. WT: n = 22 בעלי חיים, פלואורסצנטיות ממוצעת = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1(nk3): n = 25 בעלי חיים, פלואורסצנטיות ממוצעת = 0.8632 ± 0.109 SD. מבחן t לא מפוקד. (C, D) דוגמה מייצגת או פלט יישור תולעת עבור חיות WT (C) ו- dbl-1(nk3) (D) מיושר עם הצינור ליישור תולעת. התמונות צולמו עם מטרה 20x על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך (ראה טבלת חומרים) בעוצמת פלואורסצנטיות ירוקה = 2, חשיפה = 60ms. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: דוגמה לכימות פלואורסצנטי ויישור תולעים חיות מתמונות פלואורסצנטיות של תולעים חיות הנושאות את כתב התמלול hsp-70(C12C8.1)p::GFPבעקבות הלם חום. (א)בהלם חום קצר (30 דקות ב-34 מעלות צלזיוס), תולעים צעירות נמצאו בטמפרטורת הטיפוח שלהן (25 מעלות צלזיוס) והורכבו ואז דימוי של 3.5 שעות לאחר הלם חום. כ-30 תולעים כומתו בעקבות הלם חום באמצעות צינור יישור התולעת. (A-B) דוגמאות לתולעים מיושרות שלא נחשפו להלם חום. (C-D) דוגמאות לתולעים המומות חום הנושאות hsp-70(C12C8.1)p::GFP באמצעות יישור תולעת. (E) מציג את עוצמת GFP הממוצעת (Worm_CP פרמטר: MeanIntensity_Threshold) של תולעים צעירות WT גדל, ללא הלם חום או עם חשיפה להלם חום (34 °C (34 °F) במשך 30 דקות). התמונות צולמו עם מטרה 20x על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך (ראה טבלת חומרים) בעוצמת פלואורסצנטיות ירוקה = 1, חשיפה = 60ms; אין HS: n = 12, HS: n = 32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור נוסף 1: מיקום בפיג’י שבו ניתן למצוא את המאקרו יישור התולעת, לאחר ההתקנה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 2: בחירת התיקיה המכילה את כל התמונות שצולמו באותן הגדרות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 3: יצירת 4 תיקיות משנה תיקיית הפלט ב- FIJI. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 4: ציור קו לרוחב התולעת והגדרות הערוץ עבור המונטאז’. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור 5: תצוגה מקדימה של התמונה עם ההגדרות שהוחלו. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור משלים 6: ציור קו לאורך הציר האורך של תולעי העניין להכללה במונטאז’ ו/או לכמות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 7: מונטאז’ של התולעים שנבחרו לתיקיית הפלט, תחת התיקיה “מיושר”. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 8: ניקוי תמונות קודמות מניתוח קודם ב-Cell Profiler. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 9: ייבוא מטא-נתונים ל- CellProfiler מתשיית הפלט יישור תולעת על-ידי בחירה .csv המשנה ‘הגדרות’. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 10: צינור CellProfiler Worm_CP.cpproj משתמש בתמונות Lines_ כדי להפוך את התולעים שנבחרו לתולעים שנבחרו (A) ומייצר מסיכות תולעים בודדות של תולעי העניין (C). הצינור מודד גם את עוצמת הרקע (B). Outlook של כל הפרמטרים הנמדדים על-ידי Worm_CP.ccproj המיוצאים בקובץ csv (D). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור נוסף 11: בחירת קבצי פלט ב”גליון הייצוא בצינור Worm_CP.cpproj”. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
יישור תולעים הוא צינור עיבוד תמונה מבוסס FIJI שיוצר בקלות מונטאז’ים של תולעים שנבחרו על-ידי המשתמש, שבהם תולעים מיושרות ומיושרות כדי לסייע בהשוואה חזותית, סיווג וייצוג. למרות תכונה זו מוצעת גם על ידי כמה כלים קיימים, במיוחד מודול WormToolbox ב CellProfiler7, תולעת ליישר דורש יחסית מעט ניסיון ניתוח תמונה קודמת: משתמשים צריכים רק לעקוב אחר תולעים אלה הם רוצים לבחור עבור montage (וניתוח). למרות שמעקב אחר התולעים על נתוני התמונה הגולמית הוא תהליך קל – במיוחד כאשר מחשב או טאבלט עם מסך מגע זמין – הוא בעל חשיבות עליונה, כי קווים מצוירים כראוי לאורך הציר האורך של התולעים. קווים לא שלמים, הבאים רק חלק מהתולעת, יגרמו לתולעים חלקיות במונטאז’ (כלומר, תולעים חסרות ראשי קצוות זנב) ומסכות פילוח חלקיות במהלך ניתוח CellProfiler. כמו כן, אם קווים משתי תולעים בודדות חוצים, התולעים לא יעובדו כראוי במונטאז’ יישור התולעת, כמו גם לכימות פלואורסצנטי. לבקרת איכות נשמרת תמונת שכבת-על של בחירות הקו בתמונה המקורית, יחד עם טבלת QC. מתוך אלה, קווים בעייתיים שיובילו לתולעים מפולחים באופן שגוי ניתן לזהות בקלות ולא לכלול מונטאז ‘ ו / או ניתוח עוקב.
למרות שהקלט הישיר של הניסוי בבחירת התולעים אולי נראה קצת גוזל זמן, הוא מציג יתרון ברור של זרימת העבודה על פני אחרים בניסויים שבהם תולעים בשלבים התפתחותיים שונים נמצאות באותה תמונה: תולעים ניתן לבחור במהלך “צעד המעקב”, על ידי מתאר רק את התולעים כי הם בשלב ההתפתחותי הנכון. לחלופין, ניתן לסנן תולעים באמצעות הפלט מ- Worm_CP בהתבסס על אורך קו העקיבה, או על שטח מסיכת הפילוח, שניהם אינדיקטורים אמינים לאורך/גודל התולעים. ניתן לטעון כי אלגוריתמים של למידת מכונה עשויים להיאבק לזהות תולעים בשלבים התפתחותיים שונים, שכן גודלם ומראהם בתמונות DIC כל כך שונים.
הפלט של ליישר תולעת יכול לשמש לכימות הבא של עוצמת פלואורסצנטיות בתולעים בודדות, או בפיג’י ישירות, או בפלטפורמות אחרות של תוכנה לניתוח תמונה. הדגמנו זאת על ידי ייבוא פלט יישור התולעת לצינור CellProfiler (Worm_CP), המאפשר כימות של עוצמת פלואורסצנטיות רב-ערוצית באותן תולעים בודדות שנבחרו בעת הפעלת צינור יישור התולעת. בחרנו בגישה זו בגלל הגמישות של תוכנת CellProfiler: זה פשוט לשלב מודולים נוספים לתוך הצינור כדי לנתח תכונות נוספות בתולעים בודדות (למשל מדידת הגודל של טיפות השומנים, או גרגירי מתח, גרעינים, מיטוכונדריה). בנוסף, מסכות התולעת הבודדות עשויות לשמש לאמן דגם חדש עבור WormToolbox7.
היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי הוא מהיר ודורש התקנה פשוטה הרכבה תולעת. שיטה זו מהירה יותר מכיוון שהיא אינה דורשת השקעת זמן בלמידת פעולת תוכנה או הפעלת ערכות הדרכה באמצעות אלגוריתםמכונה 7. יתר על כן, שיטה זו פועלת עם תולעים חיות או קבועות פשוט רכוב על רפידות אגרוז רגילות. אין צורך להשתמש בתאים מיקרופלואידיים מורכבים, כפי שפותחו בשיטות אחרות5,6.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר כריסטיאן לנקוט ב- BIOCEV (פראג, צ’כיה) שלימד אותנו את טכניקת מיקרופיפטית הפה להרכיב תולעים קבועות וד”ר פטימה סנטוס וד”ר דבי דראג על שיתוף הגדרת בטיחות על מיקרופיגט הפה. אנו מודים גם לפרנססקה הודג’ על עריכת כתב היד, שרלין מרדוק ומתקני מכון ביברהאם על תמיכתם. OC נתמך על-ידי ERC 638426 ו- BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Materials
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
Referenzen
- Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
- Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biologie. 76 (9), 91-99 (2012).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
- Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9 (2014).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100 (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), 343-351 (2017).
Diesen Artikel zitieren
Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (159), e61136, doi:10.3791/61136 (2020).