蠕虫对齐和Worm_CP，两个开源管道，用于从卡诺哈布迪蒂斯精英获得的荧光图像数据的直化 和定量
Summary
蠕虫对齐/Worm_CP 是一个简单的 FIJI/CellProfiler 工作流程，可用于拉直和对齐 卡诺哈布迪蒂斯埃利根样本 ，并评分全蠕虫图像为基础的检测，而无需事先的培训步骤。我们应用蠕虫对Worm_CP/分析方法，用于在活动物中对热休克诱导表达的定量，或在固定样品中对脂滴进行定量分析。
Abstract
从固定或麻醉的 C. elegans 获取图像数据时经常遇到的问题是蠕虫与邻居交叉和聚类。随着蠕虫密度的增加，这个问题更加严重，给成像和定量带来了挑战。我们开发了基于 FIJI 的工作流 Worm 对齐，可用于从 C. elegans 的原始图像数据生成用户选择、拉直和对齐蠕虫的单通道或 多通道蒙太奇。 蠕虫对齐是一种简单且用户友好的工作流，不需要事先对用户或分析算法进行训练。使用蠕虫对齐生成的蒙太奇可以帮助对蠕虫、蠕虫的分类和表示进行目视检查。此外，Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们将 Worm 对齐输出导入到使用开源 cellProfiler Worm_CP的管道中来演示这一点。CellProfiler 的灵活性使其他模块能够用于高含量筛选。作为一个实际的例子，我们在两个数据集上使用了管道：第一个数据集是热冲击检测器蠕虫的图像，这些蠕虫在热冲击可吸收基因 hsp-70的启动者控制下表达绿色荧光蛋白（GFP），第二个数据集是从固定蠕虫获得的图像，用荧光染料染色为脂肪储存。
Introduction
一个相对简单的生物体，线虫，是研究人类疾病的非常有用的模型系统。C.elegans基因组中大约38%的基因在人类1、2中具有功能对应。C. elegans 的独特特性之一是光学透明，便于获取有关荧光报告器跨组织（子）细胞表达的体内信息。这使得C.elegans成为使用基于图像的平台3的高内容屏幕的主要模型有机体。然而，一个经常使这些研究复杂化的问题是，当对密集的蠕虫群进行成像时，它们往往会交叉和聚类，使单个蠕虫之间的比较具有挑战性，使下游图像分析和定量变得多云。
克服这一问题的现有解决方案通常依赖于培养和成像协议的优化，例如通过使用微流体设置4，允许单个蠕虫被捕获在单独的图像5，6。另一些应用机器学习算法，允许识别单个蠕虫，即使在块块中。后者的一个很好的例子是 WormToolbox，它是开源图像分析平台 CellProfiler7 的模块化扩展。WormToolbox 为 C. elegans 的分析提供了高吞吐量和高含量的解决方案，并且它显然受益于 CellProfiler 的加入，因为可以轻松包括其他分析模块。尽管 WormToolbox 附带了预先训练的模型 （DefaultWormModel.xml，但每个新应用程序通常需要重新训练机器学习算法。有关如何做到这一点的在线教程可在 Github （https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/） 上找到。尽管如此，安装和使用 WormToolbox 需要为新手用户投入大量时间。
在这里，我们描述了一个简单、具有成本和时间有效的文化协议，以及 C.elegans的图像群。为了在采集的图像中评估单个蠕虫，我们开发了一个简单的基于 FIJI 的工作流，名为 Worm 对齐。蠕虫对齐可用于生成拉直和对齐蠕虫的单通道或多通道蒙太奇。首先，用户必须通过绘制一条从头部到尾部的线来手动选择单个蠕虫进行分析。蠕虫对齐将使用此选择从概览图像中裁剪选定的蠕虫，并生成蒙太奇，其中所选蠕虫被拉直和对齐，以便于进行可视化比较和呈现。
此外，Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们将 Worm 对齐输出导入到使用开源 cellProfiler Worm_CP的管道中来演示这一点。CellProfiler 的灵活性使其他模块能够用于高含量筛选。我们已经使用Worm_CP管道来量化热冲击反应，这是一种保存完好的保护机制，可以重新折叠因高温8等压力源而错折叠的蛋白质。具体来说，我们把管道应用于携带集成多拷贝转基因的蠕虫，其中热冲击可吸收基因 hsp-70（C12C8.1） 的启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）9。我们还在固定动物Worm_CP上使用了Worm_CP管道，这些动物被贴上了荧光染料的标签，这种染料可以可视化脂质液滴（LDs）， 这是C.elegans10中主要的脂肪储存细胞器。虽然此工作流没有 WormToolBox 提供的吞吐量，但它是一个用户友好且简单的替代方法，用于可视化演示和分析基于 图像的 C. elegans实验。
Protocol
1. 使用荧光染料将蠕虫固定用于脂肪含量成像（BODIPY）10 根据标准程序 2，通过漂白来准备C.elegans 的同步种群。板约1000L1级蠕虫到9厘米线虫生长介质（NGM）板每个条件。注：由于处理时蠕虫丢失，准备的蠕虫比最后实际量化的蠕虫多。 要在年轻的成人阶段成像动物（约50小时后L1电镀在20°C），洗每9厘米板与15 mL的M9在锥形管，离心机在252 x g1 分钟，并删除上流板。 重复洗涤，将 M9 的 1 mL 留在蠕虫颗粒上。 在2 mL低蛋白结合微离心管中，使用低保留技巧转移含有蠕虫的1 mL。 在微离心中以 252 x g 旋转 1 分钟，取出上清液，小心不要接触管底的蠕虫颗粒。 用于使用 4，4-二氟-1，3，5，7，8-彭他基-4-波拉-3a，4a-diaza-s-indacene（BODIPY）染色监测脂肪含量10 （材料表）， 修复蠕虫要么添加0.5 mL的60%异丙醇到蠕虫颗粒3分钟11，或通过添加2 mL的冰冷甲醇10分钟。对于这两个程序，每 30 s 反转一次管。注意：如果甲醇是所选的固定试剂，由于其毒性，必须在烟罩中执行此步骤。 在不接触蠕虫颗粒的情况下，尽可能去除固定剂，并添加 1 mL 的 M9。让蠕虫在管底沉淀3~5分钟。 再次用 1 mL 的 M9 洗涤，让蠕虫沉淀并去除上清液，在管中留下约 50 μL。使用夹子固定管子。 将安全封闭的管子放入液氮中，然后在 +40°C 下放入温水浴中，冷冻破解蠕虫。 再重复步骤 1.9。 在 M9 中以 1 μg/μL 的最终浓度稀释 0.5 mL，并在室温下放在旋转器上 1 小时。 1小时后，让蠕虫在管底沉淀3~5分钟。 取出上一液并添加 1 mL 的 M9。 让蠕虫在底部沉淀并去除上清液。注意：或者，可以旋转在252 x g 1分钟，因为这似乎不会影响形态。 添加 0.5 mL 的 M9。注：如果固定性为 60% 异丙醇，则蠕虫只能在 48 小时内使用。如果固定性是甲醇，蠕虫应在24小时内使用。 2. 准备加糖垫来安装蠕虫 注：准备加糖垫的关键步骤是获得一个常规厚度的垫。否则，穿过焊盘的蠕虫将在不同的焦平面上，因此很难获得更宽视野的聚焦图像。 在烧杯或圆锥烧瓶中加入 0.2 g 的 agarose 到 10 mL 的灭菌 H 2 O 中，准备2%的气糖垫。在微波炉中加热30s，直到红糖开始沸腾。注：请勿过热，一旦出现气泡，请停止;否则，它增加了加糖的粘度，使其更难达到所需的垫厚度。 一旦气糖融化，使用1000μL移液器尖端及其末端切口，在显微镜玻璃幻灯片的中心分配一滴融化的阿加罗斯。立即，但微妙，举行另一个玻璃幻灯片非常接近阿加罗斯下降，并释放到阿加罗斯，形成一个常规厚度垫的最佳显微镜结果。注意：从高度释放顶部幻灯片不仅会形成气泡，还会导致垫板不均匀。或者，也可以使用两个玻璃幻灯片，在幻灯片的侧面与垫，与薄层胶带在每张幻灯片。 至少 2~3 分钟后，轻轻取下顶部滑轨。使用顶部幻灯片的侧面，修剪垫，使其方形。在 5 分钟内安装蠕虫，以防止垫在使用前干燥。 3. 安装固定蠕虫进行成像 通过在 Bunsen 燃烧器的火焰中延伸薄玻璃毛细管来创建口腔微管（图 1A）。在火焰中延伸后，将毛细管分解为两块（图1B）。选择最充分的，通常是最长的，并测试毛细管的端是否打开，通过尝试吸水。注：如果液体没有进入毛细管，则其太薄或被阻塞。用一把剪刀轻轻切割毛细管的端，避免切割太多，因为如果孔太大，蠕虫会吸气。 将玻璃毛细管从步骤3.1插入毛细管适配器（图1C），连接到6毫米硅胶管，将6毫米硅胶管的另一端插入0.2 μm过滤器，连接到另一端的3毫米硅胶管（图1C）。将 1 mL 滤片尖端（图1C）插入3毫米硅胶管的自由端以吸气。注：在实验者的嘴和毛细管之间添加0.2 μm过滤器，以确保实验者的最大安全性。类似的解决方案用于用于处理小鼠胚胎12的嘴微管。如果口腔微管不再吸气液体，请更换过滤器（通常每隔几个月更换一次）。 在解剖显微镜下使用口腔微管，在固定蠕虫的蠕虫颗粒周围去除尽可能多的液体（图2）。注：使用手动微移液器移液，可用作步骤 3.1 至 3.3 中的口移液器的替代品，以尽可能多地去除上流液。添加 6 μL 的安装介质。然而，我们发现这种方法不能如此高效，因为焊盘中过多的液体会产生稀疏的蠕虫密度，这使得成像更加耗时。恢复步骤 3.6。查看管的底部，确保移液器不会吸气蠕虫。 快速将 10 μL 的安装介质 （材料表） 添加到管的底部. 用洗涤剂（0.01% Triton）的痕迹在PBS中冲洗10μL尖端，以防止蠕虫粘在塑料移液器尖端的两侧。用一把剪刀切开尖端的一端。 将含有蠕虫的8μL安装介质转移到步骤2.3中准备的阿加罗斯垫上。在显微镜下，轻轻摇动幻灯片，以避免蠕虫重叠。 用 18 mm x 18 mm 盖玻片盖住 agarose 垫上的安装介质掉落（图 3）。注：较小的盖玻片是首选，因为它们对蠕虫施加的压力较小。用一对钳子握住盖玻片，将盖玻片的一条边缘涂抹在 agarose 垫上，然后用钳子轻轻沉积盖玻片。 4. 安装活蠕虫进行成像 注意：要对活蠕虫进行图像成像，它们必须固定在垫子上。实现这一目的的一个方法就是用尼古丁受体激动剂麻痹它们：levamisole（材料表）。 在 M9 中溶解在步骤 2.3 中创建的 agarose 垫上，将 3 mM levamisole 的管道 3±4 μL 溶解在 agarose 垫上。注：应该有足够的液体体积，蠕虫不是彼此的顶部，但没有太多的液体，蠕虫太稀疏的垫。有经验的蠕虫采摘者可以使用 3 μL 的 levamisole。经验不足的采摘者可能需要添加更大的体积的莱瓦米索，这样利瓦米索不会完全蒸发。 每个情况选择 30~50 个蠕虫进入利瓦米索的掉落。 用 18 mm x 18 mm 盖玻片盖住阿加罗斯垫上的利瓦米索滴。图像蠕虫在1小时内，作为麻痹剂将最终导致蠕虫死亡。 5. 使用荧光显微镜成像幻灯片 使用均匀厚度的 agarose 垫，使用 6 x 6 或 7 x 7 大图像（例如，使用荧光显微镜的 20 倍目标）一次成像幻灯片上的所有蠕虫。如果垫的厚度不均匀，则获取同一幻灯片的多个较小的 3 x 3 或 4 x 4 图像。 对于所有条件的荧光强度和曝光时间使用相同的设置。调整每个设置以匹配强度最亮的幻灯片，确保没有像素饱和度。有关图像采集的具体细节，请按照显微镜制造商的说明操作。 6. 使用蠕虫对齐的 FIJI 管道创建对齐单个蠕虫的蒙太奇图像 安装开源图像分析软件包 FIJI13/ImageJ14 https://imagej.net/Fiji。如果以前安装的 FIJI 可用，请确保它更新到版本 1.52a 或更晚版本，因为宏中使用的某些功能（例如表函数）需要此功能。从 Github 下载蠕虫对齐宏：https://github.com/hannekeo/Worm-align。 打开 FIJI 并运行蠕虫对齐宏。通过单击插件执行蠕虫对齐|宏|在FIJI 主菜单栏中运行（图 S1）。现在，在计算机上找到 Worm-align.ijm脚本。 宏通过请求图像的位置进行初始化。该管道将同时处理单通道和多通道荧光图像（图S2）。选择一个输入文件夹，宏将自动生成一个输出文件夹，其中将保存所有结果（图 S3）。注意：所选文件夹仅包含图像文件非常重要，因为存在其他文件格式将导致宏崩溃。理想情况下，仅将使用相同的显微镜设置捕获的图像分组在一起。蠕虫对齐将接受许多不同的文件格式，包括 nd2，czi，tif，rgb，jpg 和 png。输出文件夹的名称与输入文件夹的名称相同，将”_output”添加为后缀，即如果输入文件夹为”图像”，则输出将在”images_output”中找到。输出文件夹将包含四个子文件夹，其中将保存数据。 允许宏继续打开输入文件夹中的第一个图像，并使用它作为代表性图像来提取一个设置来生成蒙太奇。注：蠕虫对齐将自动选择输入文件夹中的第一个图像，以生成将应用于文件夹中所有其他图像的设置。如果认为另一个图像更代表数据集，请确保通过在输入文件夹中保存图像的副本，更改名称，以便现在将其列在列表顶部（例如”0_RepresentativeImage”）来选择此图像。 使用 直线绘图工具 ，在蠕虫的宽度上绘制一条线（图S4），并使用此线的长度来确定单个蠕虫的裁剪区域的高度。对于每个通道，指定名称、查找表 （LUT）、强度设置 （B&C） 以及是否应包含在蒙太奇中（图S4）。注：这些参数记录并保存在设置文件，设置 .csv，位于 输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中。 捕获所有设置后，用户将显示应用应用设置后的图像外观（图S5）。如果设置足够，请勾选顶部框。选择蒙太奇生成选项（如果不需要，请删除滴答声）：1. 为每个图像生成选定蠕虫蒙太奇，或 2. 生成组合蒙太奇，其中输入文件夹中所有图像上选择的所有蠕虫将合并到单个蒙太奇中。单击 ” 确定”以执行宏的其余部分。注：如果在单击”确定”之前未勾选顶部框，宏将重新运行设置，因此可以优化图像设置。 蠕虫对齐管道现在继续打开输入文件夹中的所有图像。对于每幅图像，使用”分段线”工具（在 FIJI 主菜单栏上），在要包含在蒙太奇和/或量化的所有蠕虫的纵向轴上绘制线条。为确保蠕虫正确对齐，请从头到尾（反之亦然）和沿蠕虫的完整长度绘制线（参见图4B中的”好”和”坏”线绘制示例）。 将每 行添加到 ROI 管理器中，通过单击 Ctrl+T. 蠕虫对齐使用添加到 ROI 管理器中的行，结合蠕虫宽度参数（在步骤 6.4 中设置）生成单个选定蠕虫的裁剪图像。行 RBI 的集合保存在”数据”子文件夹中。此文件夹还包含显示行的原始图像的副本以及蠕虫的数量。线条使用查找表Glasbey_on_dark颜色。拉直蠕虫的图像保存在输出 文件夹single_worms 子文件夹中。此外，如果在此协议的步骤 6.6 中选中，Worm 对齐将生成每个概览图像和/或输入文件夹中所有概览图像选择的所有蠕虫的蒙太奇（参见 图 4C 和图 S7）。这些蒙太奇可以在输出文件夹的”对齐”子文件夹中找到。 7. 在自动细胞保护器管道中使用蠕虫对齐的输出分析单蠕虫荧光强度 对于蠕虫对齐输出的下游数据处理和分析，从https://cellprofiler.org/下载并安装开源图像分析软件包”CellProfiler15，16″。 从 GitHub Worm_CP. cpproj管道： https://github.com/hannekeo/Worm-align注意：此处描述的示例管道是使用 CellProfiler2.2.0 构建的，可能无法在 CellProfiler 的后期版本中运行。 在启动 Worms_CP.cpproj 管道之前，请确保所有预期的输出图像都存在于 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中：原始图像的已处理副本（名为 Original_）、蠕虫总体的二进制图像掩码（名称： Mask_）、在选定蠕虫上绘制的线的线蒙版（名称为 Lines_）以及一个表示原始图像中每个通道的图像（按通道编号命名）。 要量化单个蠕虫中的荧光强度，请单击 “图像”输入 模块，只需 将 CellProfiler 输出文件夹拖动到显示” 在此放置文件和文件夹”的窗口中。如果从以前的分析中显示图像列表，请先在窗口中右键单击并选择”清除文件列表 “来删除这些图像。要从图像列表中排除”设置.csv”文件，请为筛选器设置选择”仅图像”或”自定义”，其中”扩展是 tif、tiff、ome.tif 或 ome.tiff”（图 S8）。 单击元数据输入模块。在第二个提取方法中，单击黄色文件夹，并在 WormAlign 输出文件夹中找到 CellProfiler 子 文件夹（图 S9）。选择 “设置.csv 文件，通过将 CSV 文件中的元数据与图像中的元数据（通道元数据）匹配，将文件中的设置链接到 CellProfiler 输出。 单击 NamesAndType 输入 模块，并插入要量化原始图像的每个通道的新图像。注：示例管道中已存在的是蠕虫蒙版、两个彩色图像、线蒙版和原始图像，以及三个灰度图像（绿色和红色通道）。如果原始图像的通道比示例图像多或少，需要调整此模块中的列表。 检查每个列标签/掩码/蠕虫中的图像名称是否正确。注：一行上的图像名称应全部对应于要分析的同一初始图像。如果在图像分析过程中出错，则某些输出图像将丢失，并且三列标签/掩码/蠕虫下的名称将不再对应于每行相同的初始图像。如果是这种情况，请找出错误在哪里。 按 “查看输出 设置”以选择文件夹以从 Cellprofiler 保存输出。 单击 “开始测试模式”。进入测试模式后，通过单击 Run（将运行在管道中的所有活动模块）或 Step（ 一次通过管道运行一个模块）将 管道 的设置应用于数据集中的第一个图像，可以仔细检查管道的设置。注：在测试模式下，即使管道中存在（且处于活动状态 ）， 也不会导出提取的测量值。 管道按其应执行的方式后，单击退出测试模式，然后按”分析图像”。根据当前配置，Worms_CP 将使用 Mask_ 图像对粗糙的蠕虫蒙版和 Lines_图像（图S10A）进行分割，以挑出选定的蠕虫并生成单个蠕虫掩码（图 S10C），（2）测量识别和蒙版这些蠕虫中输入图像中所有通道的荧光强度。管道还可以测量背景强度（图S10B），并相应地更正所有图像（以所测参数名称中的字阈值表示），例如：Intensity_MeanIntensity_green_threshold）、（3）测量所选蠕虫的大小，以及 （4） 导出所有测量参数（图 S10D）。 打开Worm_CP由两个 csv 文件、蠕虫和行.csv这些文件.csv这些文件保存在选定的输出文件夹中（参见图 S11）。这些文件可以在 Excel 或 R（工作室）中打开，用于后期处理和报告。如果需要其他输出（例如每个图像数据），可以在管道中的ExportToSpreadsheet 模块中选择此选项。
Representative Results
根据本协议中描述的 方法，对 C. elegans 进行培养和成像，可生成蠕虫群的大型概览图像。为了促进这些图像中蠕虫的目视检查和分类，我们开发了蠕虫对齐技术。蠕虫对齐是一个简单且用户友好的 FIJI 脚本，可用于创建拉直和对齐蠕虫的蒙太奇。通过沿着蠕虫的纵向轴绘制一条线，从概览图像中选择蠕虫。每个选定的蠕虫都分配一个数字，裁剪和拉直，并添加到蒙太奇。蒙塔奇可以生成每个图像或合并从原始输入文件夹中的所有图像。 正如预期的那样，管道的输出在很大程度上取决于在图像顶部绘制的线条的质量。为了说明这一点 ，图 4 显示了几个行示例，以及 Worm 对齐的输出。从头部到尾部的完整线会产生正确对齐的蠕虫（标记为”好”）。 图 4 还显示了在执行蠕虫对齐期间跟踪不准确之处如何影响对齐的输出。从图 4C中包含的注释蒙太奇中，应注意避免以下错误，因为它们妨碍了蠕虫的正确对齐： 蠕虫从头到尾的跟踪不一致（标有”尾部到头部”）。这会导致蠕虫在对齐中以不同的方向（即尾部与头对尾）定向。 不完整的跟踪（标记为”不完整”）。这仅导致跟踪为蒙太奇裁剪的蠕虫部分。 在单个跟踪中包括多个蠕虫（标记为”带两个头的蠕虫”）。这会导致蠕虫加上（相当一部分）其邻居入蒙太奇的同一面板中。 向图像添加随机线条（标记为”随机”）。这会导致在蒙太奇中插入随机面板。 对于蒙太奇的创建，如果两条单独的线相交（标记为”相交”），或在蠕虫的两端连接（标记为”连接”），只要每行跟踪单个蠕虫的整个长度，则不是问题：Worm 对齐脚本单独和顺序选择每行 ROIS，裁剪并拉直它，因此最终蒙太奇中的每个面板将代表一条线跟踪。然而，在相交蠕虫的情况下，虽然全长拉直蠕虫出现在蒙太奇中的蠕虫”相交1″和蠕虫”相交2″（参见图5A-B），很明显，这些蠕虫在原始概览图像中相互交叉。因此，可以得出结论，从”数据”子文件夹（图5A）中的叠加图像以及蒙太奇中单个蠕虫的面板（图5B）中，可以直观地识别相交线。此外，可以从 Worm 对齐为每个处理的图像生成的质量控制 （QC） 表中识别蠕虫/行的任何重叠，并保存在数据子文件夹中。此表记录了图像中绘制的每个行 ROI 的三个参数（参见图5C）：其中，长度指示线 ROI 的长度，这是蠕虫大小的一个很好的指标;Worm编号指示在概览图像上绘制线条的顺序。最后，最后一列指示有关蠕虫/行与图像中选定的任何其他蠕虫/行之间是否有重叠。如果重叠，此列中的数字将不同于 Worm 编号列中列出的数字。与叠加图像相结合，QC 表应帮助研究人员做出以下明智的决定，以决定将哪些蠕虫排除在蒙太奇和/或定量之外。 蠕虫对齐的输出可用于随后量化单个蠕虫的荧光强度。在 FIJI 中，线 ROIS 可用于测量原始图像数据中的荧光强度，例如，通过执行简单的 FIJI 脚本”Worm-quant.ijm”，该脚本也可以在 Github 上的 Worm 对齐存储库中找到。或者，Worm 对齐输出可以导入到第三方图像分析软件中。我们将两个数据集的 Worm 对齐输出导入到 Worm_CP 中来演示这一点。Worm_CP使用蠕虫对齐输出文件夹的”CellProfiler”子文件夹中的文件来微调在执行蠕虫对齐宏期间选择的这些单个蠕虫的分段掩码。具体地说，它使用行掩码（名为：Lines_）将选定的蠕虫与二进制掩码（名为：Mask_）中看到的蠕虫群体隔离。应该注意的是，在概览图像上相交的线（图5A）虽然对蒙太奇的生成来说不是问题，但对于管道的Worm_CP问题。为什么会这样，如图5 D-E 所示。Worm_CP使用线掩码（图5D），而不是单个ROIS来帮助识别单个蠕虫。在执行 Worm 对齐时绘制的相交线叠加在第一行上，因此沿此线的强度将是 ROI2 的强度，包括在行 1 和 2 重叠的位中。因此，CellProfiler 将线 2 分割为一个对象，但 line1 将分割为两个对象，这些对象与线 2 相交。这意味着 CellProfiler 将生产两个（半）蠕虫掩码，用于蠕虫”相交1″（图 5E）。从最终分析中排除这些事件的最简单方法是从 QC 表（数据子文件夹）中识别相交蠕虫的蠕虫数量，并从 CellProfiler 输出文件中删除这些蠕虫的测量值。请注意，在 FIJI 和 CellProfiler 中，不一定分配相同的蠕虫编号：要在 CellProfiler 输出中标识 FIJI 蠕虫编号，请查看”行.csv”输出文件中的 Intensity_Max_Intensity 值。每个Intensity_Max_Intensity显示的”线.csv”表中出现的任何一个值都表示该线路 ROI，导致蠕虫掩码断裂。 一旦对单个蠕虫Worm_CP，就可以测量所选蠕虫中所有记录通道的荧光强度。所有测量都是从原始（原始）图像数据中拍摄的，但应该注意的是，CellProfiler 会自动以 0-1 的刻度重新缩放像素强度。这是通过将原始像素强度值除以图像的最大可能像素强度实现的。在 8 位图像的情况下，此值为 255，在 16 位图像的情况下，它是 65535。因此，CellProfiler 强度值需要乘以最大可能的强度值，以重新获得等效于原始图像数据的值。输出Worm_CP csv 文件（”蠕虫.csv”和”行.csv”）保存在所选输出文件夹中。在检查这些文件时，很明显，CellProfiler 记录了大量与荧光强度相关的参数。其中，Intensity_IntegratedIntensity对应于每个蠕虫的总荧光（即，解释单个蠕虫掩码的所有像素内的荧光强度之和）。参数 Intensity_MeanIntensity 是指单个蠕虫中的平均荧光强度（即单个蠕虫中包含的所有像素的平均荧光强度）。由于在分割蠕虫掩码时偶尔出现（小）错误，建议在比较两个条件之间单个蠕虫的荧光测量时使用平均丁度测量。如果想要从量化的测量中减损背景荧光，请使用名为”MeanIntensity_Threshold。 我们使用管道Worm_CP定动物的荧光强度，这些动物被贴上荧光染料的标签，这种荧光染料被整合到脂滴（LDs）中（图6）。为了验证蠕虫对齐/Worm_CP管道的荧光定量，我们通过 WORM 对齐/Worm_CP 管道或 FIJI/ImageJ 中的手动定量，量化了 BODIPY 数据集中同一组蠕虫的荧光强度。在 FIJI/ImageJ 中，通过盘旋每个蠕虫以及每个图像中的暗背景区域执行手动定量。荧光强度在ROI管理器中测量，图像背景测量值从每个蠕虫的蠕虫荧光测量中减去，如所述17。我们比较野生类型（WT）N2蠕虫dbl-1（nk3）突变体，其表现出减少脂滴含量18。正如预期的那样，使用这两种方法，WT 和dbl-1（nk3）蠕虫之间的绿色荧光强度显著降低（图 6A，B）。如图 6C，D中观察到对齐蠕虫的示例。使用手动定量，WT 和dbl-1（nk3）之间的脂滴含量减少 17%（p 值<0.0001，未配对 t-test），使用 Worm_CP 管道减少 14%（p 值=0.0051 未配对 t 测试）。在dbl-1（nk3）中观察到的脂液滴含量的减少与两种定量方法是符合文献18的。这表明，使用细胞Profiler管道对采集Worm_CP图像的定量可与手动定量相媲美。 我们还使用Worm_CP定量的活蠕虫热震响应，在热冲击可吸收基因hsp-70（C12C8.1）9的控制之下表达GP。图 7显示了携带热响应hsp-70（C12C8.1）p 的实时 C. elegans的代表性图像：：GFP 记者。在没有热应力的情况下，蠕虫不会诱导GP表达（图7A，B）。然而，当蠕虫在34°C下暴露在30分钟的短热冲击下时，它们会诱导GP表达（图7C，D）。图7E 中量化了带热冲击和没有热冲击的GFP表达水平。 就目前情况Worm_CP一个非常基本的管道。但是，这种方法确实能够更准确地分割单个蠕虫掩码，从而更准确地量化从图像中选择的蠕虫中的荧光强度。因此，我们更喜欢这种方法，而不是在 FIJI 中粗略的定量，只使用线掩码。此外，CellProfiler 还具有一个优势，即其他分析模块可以轻松地包含在管道中。例如，对于查看脂滴含量的数据集，在 Worm_CP 管道中插入其他模块可以调查概览图像中所选蠕虫中单个液滴的脂液滴数和荧光强度。 图1：生成口腔微管。玻璃毛细管在Bunsen燃烧器（A）的火焰中延伸，直到它提供细细的伸长四肢（B）。然后将扩展的玻璃毛细管插入口腔微管的适配器部分。（C） 嘴微管的示意图。口腔微管由插入适配器的玻璃毛细管组装。6 mm 硅胶管将适配器连接到 0.2 μm 注射器过滤器，用于安全。过滤器的另一端连接到 3 mm 硅胶管上，末端有 1mL 滤芯尖端。实验者可以通过过滤尖端吸气。 请单击此处查看此图的较大版本。 图2：使用口腔微管，吸入蠕虫颗粒周围的液体。请单击此处查看此图的较大版本。 图 3：将盖玻片添加到铺设在 agarose 垫上的蠕虫上 请单击此处查看此图的较大版本。 图4：蠕虫在携带转录记者脂肪 -7p的活体动物获得的荧光图像上使用蠕虫对齐的例子：肠道中的GGFP和咽部的红色共注射标记（myo-2p：：tdtomato）。 （A） 成年后第3天在活蠕虫荧光显微镜上获得的合成图像的截图。以图像打开图像Worm_align使用蠕虫对齐沿蠕虫的纵轴绘制线条。（B） 与在 （A） 中相同的图像的屏幕截图，示例注释了蠕虫轴沿线的图形的好的和坏的，使用蠕虫对齐。（C） 在蠕虫顶部绘制的线示例，这些线可能上升到对齐错误的蠕虫。在 B. 图像中选择的蠕虫的蠕虫对齐输出是在倒置的宽场显微镜上以 20 倍的目标的拍摄（参见材料表），绿色荧光强度为+1，曝光=60 ms，红色荧光强度为 8，曝光=60 ms。 图 5：在相交蠕虫上使用蠕虫对齐蠕虫拉直的示例。 （A） 成年动物第3天在活蠕虫荧光显微镜上获得的合成图像截图，该图像携带转录记者 脂肪-7p：肠道中的GGFP和咽部的红色共注射标记（myo-2p：tdtomato）。相交蠕虫被标记为”相交1″和”相交2″，而非重叠蠕虫则标记为”好3″和”好4″。（B） 蒙太奇由蠕虫对齐创建，表示在 （ A ） 中选择的拉直蠕虫。在蒙太奇中，蠕虫 1 和 2 在原始图像上相交（标记为”相交 1″和”相交 2″的蠕虫）明显地相交。（C） 来自蠕虫对齐的 QC 表的屏幕截图，允许发现蠕虫相交的情况。长度：ROI 线的长度;蠕虫编号：绘制线条的顺序;最后一列指示蠕虫/感兴趣的线和任何其他蠕虫之间是否有重叠。在此示例中，第一个原始（蠕虫编号 1）中的蠕虫与蠕虫编号 2 重叠，如最后一列中的数字”2″所示。（D） 在 A. （ E ） 中选择的四个蠕虫上绘制的蠕虫对齐线的屏幕截图，在 A 中所选的四个蠕虫上由蠕虫对齐生成的掩码的屏幕截图，显示如何呈现两个相交蠕虫的掩码。在这种情况下，两个掩码而不是一个掩码现在对应于蠕虫”相交1″。在倒置的宽场显微镜上以20倍的镜面拍摄的图像（参见材料表），绿色荧光强度为1，曝光=60ms，红色荧光强度为8，曝光=60毫秒 。 图6：Worm_CP与手动定量一样准确地量化荧光。使用绿色荧光染料BODIPY或手动定量（B）对年轻成年蠕虫的荧光定量进行定Worm_CP染色脂滴含量的比较。通过用BODIPY固定和染色动物，监测WT和dbl-1（nk3）的脂质液滴含量，这些动物会分解成脂质液滴的脂肪酸（见协议A）。年轻的成年动物被固定与60%异丙醇和沾染的BODIPY1小时。同一组动物使用管道（见Worm_CP 7）或按照标准程序17进行人工量化。（A） 使用管道Worm_CP定量。WT：n=22只动物，平均荧光=1.016（A.U）±0.206 SD;dbl-1（nk3 ）：n=25 动物，平均荧光= 0.8714 （A.U） ± 0.126 SD. 未配对 t 检验。（B） 荧光的手动定量。WT：n=22动物，平均荧光 = 1.048 ± 0.153 SD;dbl-1（nk3） ：n=25 动物，平均荧光 = 0.8632 ± 0.109 SD. 未配对 t 测试。（C， D）WT （C） 和dbl-1（nk3） （ D ）动物的代表性示例或蠕虫对齐输出与蠕虫对齐管道拉直。图像拍摄于倒置宽场显微镜上的20倍目标（见材料表），绿色荧光强度为2，曝光=60ms。请点击此处查看此图的较大版本。 图7：从携带转录报告器 hsp-70（C12C8.1）的活蠕虫的荧光图像中荧光定量和对准的例子：：热冲击后GFP。 （A） 在短暂的热冲击（34°C下为30分钟）后，在培养温度（25°C）下回收年轻的成年蠕虫，然后安装3.5h后热休克。使用蠕虫对齐管道在热冲击后，对大约 30 种蠕虫进行量化。（A-B）未暴露于热冲击的对齐蠕虫示例。（C-D）携带 hsp-70（C12C8.1）的热震蠕虫示例：：使用蠕虫对齐的 GFP。（E） 显示 WT 年轻成年蠕虫生长的 GFP 平均强度 （Worm_CP 参数： MeanIntensity_Threshold），无热冲击或暴露于热冲击（34°C，30 分钟）。在倒置的宽场显微镜上以20倍的镜面拍摄图像（见材料表），绿色荧光强度为1，曝光=60ms;无 Hs： n = 12， Hs： n = 32 。 请单击此处查看此图的较大版本。 补充图 1：在 FIJI 中，一旦安装，就可以找到蠕虫对齐宏的位置。请点击这里下载此文件。 补充图 2：选择包含使用相同设置拍摄的所有图像的文件夹。请点击这里下载此文件。 补充图 3：在 FIJI 的输出文件夹中生成 4 个子文件夹。请点击这里下载此文件。 补充图 4：绘制穿过蠕虫宽度的线条和蒙太奇的通道设置。请点击这里下载此文件。 补充图 5：使用应用的设置预览图像。请点击这里下载此文件。 补充图 6：沿着感兴趣的蠕虫的纵轴绘制一条线，以便包含在蒙太奇和/或定量中。请点击这里下载此文件。 补充图 7：输出文件夹中选定蠕虫的蒙太奇，在”对齐”文件夹下。请点击这里下载此文件。 补充图 8：清除单元格探查器中先前分析中以前的图像。请点击这里下载此文件。 补充图 9：通过选择”设置”或”子文件夹”，从 Worm 对齐输出文件夹中将元数据.csv器。请点击这里下载此文件。 补充图 10：CellProfiler 管道 Worm_CP.cpproj 使用 Lines_映像来单个选定的蠕虫 （A），并生成感兴趣的蠕虫 （C） 的单个蠕虫掩码。管道还测量背景强度 （B）。在 csv 文件 （D） 中导出的Worm_CP.ccproj 的管道测量的所有参数的展望。请点击这里下载此文件。 补充图 11：在”导出到存储表”中的输出文件的选择Worm_CP.cpproj 管道。请点击这里下载此文件。
Discussion
蠕虫对齐是基于 FIJI 的图像处理管道，它很容易生成用户选择的蠕虫蒙太奇，其中蠕虫被拉直和对齐，以帮助可视化比较、分类和表示。虽然此功能也由一些现有工具提供，特别是 CellProfiler7中的 WormToolbox 模块，但 Worm 对齐所需的先前图像分析体验相对较少：用户只需跟踪他们想要为蒙太奇（和分析）选择的蠕虫。虽然在原始图像数据上跟踪蠕虫是一个简单的过程，尤其是在触摸屏计算机或平板电脑可用时，但最重要的是，要正确绘制蠕虫的纵向轴线。不完整的线（仅遵循部分蠕虫）将导致蒙太奇（即蠕虫缺少尾端头）中的部分蠕虫，以及 CellProfiler 分析期间的部分分割掩码。此外，如果来自两个单独的蠕虫的线交叉，蠕虫将不能正确处理在蠕虫对齐蒙太奇以及荧光定量。为了进行质量控制，原始图像上的线选择的叠加图像将保存在数据文件夹中，以及一个 QC 表。从这些，有问题的线，将导致不正确的分段蠕虫可以很容易地识别和排除蒙太奇和/或后续分析。
虽然实验者在选择蠕虫时的直接输入似乎有点耗时，但它在实验中，不同发育阶段的蠕虫可以在同一图像中出现：蠕虫可以在”跟踪步骤”中选择，仅概述处于正确发育阶段的蠕虫。或者，可以使用 Worm_CP 的输出筛选蠕虫，这些输出基于跟踪线的长度或分段掩码的区域，这两者都是蠕虫长度/大小的可靠指标。可以说，机器学习算法可能难以识别不同发育阶段的蠕虫，因为它们的大小和外观在 DIC 图像中是如此不同。
Worm-align 的输出可用于在 FIJI 直接或其他图像分析软件平台中对单个蠕虫的荧光强度进行后续定量。我们通过将蠕虫对齐输出导入简单的 CellProfiler 管道 （Worm_CP）来演示这一点，它允许在运行 Worm 对齐管道时选择的单个蠕虫中量化多通道荧光强度。我们之所以选择这种方法，是因为 CellProfiler 软件具有灵活性：将其他模块整合到管道中以分析单个蠕虫中的其他功能（例如，测量脂质液滴或应力颗粒、核、线粒体）的尺寸非常简单。此外，单个蠕虫掩码可能用于训练 WormToolbox7 的新模型。
此方法的主要优点是速度快，需要简单的蠕虫安装设置。此方法更快，因为它不需要花时间学习软件操作，也不需要通过机器算法7 运行训练集。此外，此方法适用于仅安装在常规的 agarose 垫上的活蠕虫或固定蠕虫。没有必要使用复杂的微流体室，如其他方法5，6开发。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢BIOCEV（捷克共和国布拉格）的克里斯蒂安·兰特托博士教我们安装固定蠕虫的口腔微移子技术，感谢法蒂玛·桑托斯博士和黛比·德拉格博士在口腔微管上分享安全设置。我们还感谢弗朗切斯卡·霍奇编辑手稿，沙琳·默多克和巴布拉汉姆研究所设施的支持。OC 受 ERC 638426 和 BBSRC [BBS/E/B000C0426] 支持。
Materials
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
Referenzen
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Diesen Artikel zitieren
Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (159), e61136, doi:10.3791/61136 (2020).