多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

アストロサイトは脳の発達と生理学の中で多くの重要な機能を果たします^。栄養摂取や血流を調節する血液脳関門での役割のほかに、ニューロンの活動や行動を変えることができる神経調節薬を産生しながら、シナプス形成と機能に積極的に寄与する^。さらに、アストロサイト機能障害は、様々な神経障害³に寄与する。大脳皮質に位置するアストロサイトは、神経細胞プロセスとの広範な接触を可能にする精巧な形態を示す。これらの接触は、回路機能に必須であり、また、細胞接着タンパク質⁴を介してアストロサイト形態形成およびシナプト生成を制御する。神経科学者は、関心のある神経学的モデルにおけるアストロサイトの発達と形態形成を調査するための便利で堅牢なツールを必要としています。しかし、近隣に対するアストロサイトの接近と均一な三次元タイリングにより、皮質アストロサイトを単一にし、免疫マーカーを使用してその形態を包括的に評価することは困難です。

現在、2つの主要な遺伝子工学戦略は、その際の皮質アストロサイトの標識と個別化を可能にする:トランスジェニックマウスラインでのまばらなレポーター活性化またはレポータープラスミドのエレクトロポレーションを用いた体細胞トランスジェネシス。最初の戦略は、タモキシフェン送達時にアストロサイトで特異的に活性化されたクレリコンビナーゼの誘導可能な形態を発現するマウスでフロクスされたレポーターマウスラインを繁殖させることに依存する(例えば、Aldh1l1-CreERT2^5)。この戦略には、いくつかの欠点があります。まず、トランスジェニックマウスの繁殖には多数の動物が必要であり、多重アッセイは典型的には、皮質アストロサイトの十分にまばらな標識を提供するためにタモキシフェンの適切な用量を決定するために必要である。目的の遺伝的マウスモデルで皮質アストロサイト表現型を分析するには、さらに多くの繁殖とマウスの消費が必要になります。さらに、子宮タモキシフェン注射では分化を妨げることが知られており、この戦略はアストロサイトの初期段階の研究に適用することが困難である。インビボDNAエレクトロポレーションは、動物の最小数6に依存する代替タモキシフェンフリー戦略^である。胚期または出生後の段階で行われるこのアプローチは、げっ歯類の側腹腔にレポータープラスミドを注入し、続いて細胞膜に毛穴を作る電気パルスを注入することで構成され、DNAが心室を裏打ちする前駆細胞に入ることを可能にする。続いて、電気ポレートされたプラスミドによって運ばれるレポータートランスジーンは、標的細胞機械によって処理され^、7を発現する。2つのエレクトロポレーション方法は、以前にマウス皮質アストロサイトにラベルを付けるために説明されている:1)早期出生^後段階で1-2単色エピソードレポータープラスミドのエレクトロポレーションに依存するエレクトロポレーション(PALE)による出生後アストロサイトラベリング。2)複数の単色統合レポータープラスミド^8、9、10の子宮エレクトロポレーション(IUE)に基づくStarTrack戦略。これら2つの技術は、効率的に大脳皮質にPrAを標識するが、彼らはまた、いくつかの制限を提示する。それらの初期バージョンでは、両方の方法は、アストロサイトの発現を駆動するためにグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターに依存しており、これは、通常の安静時PrA^11,12よりも強くGFAPを発現するピアルおよび反応性アストロサイトに対してラベリングを偏らせる可能性がある。PALEに関しては、早期生まれのPrA(または初期の剥離前駆体から生じるもの)の標識を防ぐエレクトロポレーションの後期段階と、アストログリア開発の初期段階の分析、およびPrAが出生後¹³週目の間に受ける大規模な分裂の間に連続した分裂を通じて希釈されるエピソームベクターの使用^である。PALEとは対照的に、StarTrackは、PrAへの胚性および出生後前駆物質の両方の寄与を追跡することを可能にする統合レポータープラスミドの胚エレクトロポレーションに基づいています。ユビキチンCプロモーター(UbC-StarTrack)に依存する更新されたStarTrackスキームは、神経前駆物質^15、16、17の神経およびグリア降下(アストロサイトを含む)の両方における蛍光レポーターのより広い発現を達成する。しかし、現在のバージョンでは、このアプローチの実装は、部分的な励起および発光スペクトルの重複を有する6つの蛍光タンパク質(FP)を発現する12の異なるプラスミドの等モル混合物に依存するため、複雑である。

ここで提示される、強力で広く活性なプロモーターによって駆動される統合レポーター構築物を用いた子宮エレクトロポレーションベースの多色ラベリング法における簡単な表題は、皮質アストロサイト¹⁴を単一化する。また、ライセンス(例えば、イマリス)とオープンアクセス(Vaa3D^{18、19、20)}の両方を使用した容易な画像解析パイプラインが、それぞれアストロサイトの領土容積と樹状化をセグメント化するために提供される。前述の方法と比較して、この戦略は、細胞質に向けられた1〜2色の多色積分性遺伝子多アドレス組み込み色マーカー(MAGICマーカーまたはMM²¹⁾と、細胞メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβ-globin^splicesを含む合成CAGプロモーターによって発現が駆動される核細胞コンパートメントのみに依存する。これにより、胚性から出生後後期までの皮質アストロサイトの標識および追跡が可能となり、GFAP発現^14,23とは無関係である。これらのトランス遺伝子のそれぞれは、次の4つの異なるFPを有する:eBFP、mTurquoise2/mCerulean、EYFP、およびtdTomato / mCherryは、1)シーケンシャルチャネル取得で簡単に回避できる最小限のスペクトル重複を表示する;2)最適化された励起力とコレクションのゲイン。3)狭いFP放出窓を収集するために特定の二色フィルタ。MM戦略は、細胞集団におけるFPの確率発現を駆動するために、自己切除可能なCreリコンビナーゼ(seCre)とCre/loxの再結合を使用する。MMトランスジーンの単一のコピーは、相互に排他的な方法でFPを発現し、複数の遺伝子がFPの組み合わせを生み出し、数十の異なる色合いを生み出します。遺伝子導入のゲノム積分は、ピギーバク(PB)またはTol2転置システム^24、25、26によって駆動される。したがって、子宮エレクトロポレーションを通して、MMツールキットとそれが生成する多色の「モザイク」は、複数の隣接する皮質前駆物質の同時マーキングと、皮質アストロサイトを含むそれらのグリア降下の追跡を長期間にわたって可能にする。色のコントラストは、PrAの輪郭の明確なFPの表現から生じるコントラストを許可し、その後、その領土容積(IMARISを使用)と複雑な形態(Vaa3Dを使用)に関する重要な情報を抽出します。ここで詳しく示される多色戦略は、様々な発達段階で野生型マウスの皮質アストロサイト表面および形態に迅速かつ容易にアクセスできる便利で堅牢な方法であり、トランスジェニックレポーターラインを使用することなく、神経疾患のマウスモデルにおけるアストロサイト解剖学的特徴を調査するために容易に適応可能である。